張 敏 李媛媛 張東波 于成功,#

南京中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合鼓樓臨床學院1(210008) 南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化內科2 南京大學醫(yī)學院消化科3

Faecalibacteriumprausnitzii對LFA-1基因敲除的結腸炎小鼠中Treg細胞和細胞因子的影響*

張 敏1李媛媛2張東波3于成功1,2#

南京中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合鼓樓臨床學院1(210008) 南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化內科2南京大學醫(yī)學院消化科3

背景：Faecalibacteriumprausnitzii(Fp)可促進Treg細胞的分化，淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)亦參與Treg細胞的分化調節(jié)。目的：探討Fp對LFA-1基因敲除(LFA-1-/-)的結腸炎小鼠中Treg細胞和細胞因子的影響。方法：將同樣遺傳背景下野生型小鼠和LFA-1-/-小鼠隨機分為野生型對照組、野生型治療組、LFA-1-/-對照組、LFA-1-/-治療組。小鼠飲用DSS溶液誘導結腸炎模型，治療組小鼠予Fp灌胃。觀察各組小鼠一般狀況和組織病理學評分，以流式細胞術檢測脾臟和腸系膜淋巴結中Treg細胞比例，ELISA法檢測外周血清IL-10、TGF-β1含量，實時PCR法檢測結腸組織IL-10、TGF-β1 mRNA表達。結果：與相應對照組相比，野生型治療組結腸組織學評分顯著下降(P<0.05)；野生型治療組和LFA-1-/-治療組脾臟和腸系膜淋巴結中Treg細胞比例顯著升高(P<0.05)，血清IL-10、TGF-β1含量顯著升高(P<0.01)，TGF-β1 mRNA表達顯著升高(P<0.05)；LFA-1-/-治療組IL-10 mRNA表達顯著降低(P<0.01)。與野生型治療組相比，LFA-1-/-治療組血清TGF-β1含量顯著降低(P<0.05)，IL-10、TGF-β1 mRNA表達顯著降低(P<0.05)。結論：Fp在LFA-1-/-小鼠中可上調Treg細胞比例，促進Treg細胞分泌抗炎因子IL-10、TGF-β1。Fp治療野生型結腸炎小鼠的療效優(yōu)于LFA-1-/-小鼠，可能與LFA-1缺失對Treg細胞功能的發(fā)揮和細胞因子分泌受限有關。

Faecalibacteriumprausnitzii； 淋巴細胞功能相關抗原1； T淋巴細胞, 調節(jié)性； 結腸炎； 白細胞介素10； 轉化生長因子β1

炎癥性腸病(IBD)為腸道慢性、復發(fā)性炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結腸炎(UC)和克羅恩病(CD)。目前認為腸道菌群參與腸黏膜免疫系統(tǒng)的異常反應。Treg細胞能減輕炎癥反應，提高免疫耐受。Faecalibacteriumprausnitzii(Fp)是一種具有抗炎和免疫調節(jié)作用的腸道共生菌。有研究[1]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)p及其產(chǎn)物在結腸炎動物模型中具有促進Treg細胞分化和抗炎因子分泌的作用。本研究的前期研究[2]已表明，淋巴細胞功能相關抗原(LFA)-1對Treg細胞的分化和功能有影響，但Fp對LFA-1基因敲除(LFA-1-/-)時影響Treg細胞分化調控及其作用機制目前尚不清楚。本研究通過DSS誘導小鼠結腸炎模型，旨在探討Fp對LFA-1-/-結腸炎小鼠中Treg細胞和細胞因子的影響。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑

1. 實驗動物：LFA-1-/-C57BL/6J小鼠和同樣遺傳背景的野生型C57BL/6J小鼠(美國Jackson Laboratory)各20只，飼養(yǎng)于南京鼓樓醫(yī)院無特定病原體級動物實驗中心，7～8周齡，雌雄各半，體質量20～23 g。

2. 主要試劑：DSS(MP Biomedicals公司)，F(xiàn)p(ATCC 27766，美國模式菌種保藏中心)，F(xiàn)ITC標記的抗鼠CD4抗體、APC標記的抗鼠CD25抗體、PE標記的抗鼠Foxp3抗體以及小鼠白細胞介素-10(IL-10)、轉化生長因子-β1(TGF-β1) ELISA試劑盒(eBioscience, Inc.)，紅細胞裂解液(MILTENYI BIOTEC)，引物、反轉錄、PCR試劑盒和Trizol裂解液(TAKARA BIO INC.)。

二、研究方法

1. Fp菌培養(yǎng)：將Fp接種至LYHBHI培養(yǎng)基于37 ℃厭氧箱中培養(yǎng)48 h。根據(jù)600 nm波長處吸光度值結合平板菌落計數(shù)計算細菌濃度，以PBS重選并調整濃度至1×109CFU/mL。

2. 動物模型制備和分組：將40只野生型小鼠和LFA-1-/-小鼠隨機分為野生型對照組、野生型治療組、LFA-1-/-對照組和LFA-1-/-治療組，每組各10只。小鼠飲用3.5% DSS溶液誘導結腸炎模型，治療組小鼠給予0.2 mL/10 g Fp每天灌胃1次，對照組以等量PBS灌胃，每天1次，連續(xù)7 d。造模期間觀察小鼠的狀況、活動和排便情況，每日稱重。造模第8天，頸椎脫臼法處死小鼠，眼眶取血，無菌取脾臟、腸系膜淋巴結和結腸，測量小鼠回盲部至肛門的結腸長度。

3. 組織學評分：取結腸炎病變顯著部位，以中性甲醛固定，行HE染色。參照Dutra等[3]的標準行組織學評分。0分，黏膜結構正常，無炎癥；1分，黏膜隱窩損壞1/3伴較少炎性細胞浸潤；2分，黏膜隱窩損壞2/3伴少量炎性細胞浸潤；3分，黏膜結構損壞嚴重涉及固有層伴大量炎性細胞浸潤；4分，黏膜結構紊亂，炎性細胞大量浸潤，甚至有透壁反應，結腸壁僵硬增厚。

4. 流式細胞術檢測脾臟和腸系膜淋巴結中Treg細胞比例：無菌取小鼠新鮮脾臟和腸系膜淋巴結，充分研磨后脾臟細胞加入紅細胞裂解液。予PBS重懸后計數(shù)，取1×106個細胞加入表面抗體APC-CD25 0.8 μL、FITC-CD4 1.0 μL，振蕩、避光20 min；加入固定破膜劑800 μL，避光1～2 h；加入PE-Foxp3 2.5 μL，避光孵育45 min，PBS重懸至100 μL 后上流式細胞儀檢測。

5. ELISA法檢測外周血IL-10、TGF-β1含量：具體檢測步驟按照試劑盒說明書進行操作。

6. 實時PCR法檢測結腸組織IL-10、TGF-β1 mRNA表達：各組隨機抽取4只小鼠，提取結腸總RNA，逆轉錄合成cDNA，行PCR反應。IL-10引物序列：F：5’-GCC TTA TCG GAA ATG ATC CA-3’，R：5’-AGG GTC TTC AGC TTC TCA CC-3’。TGF-β1引物序列：F：5’-ATT CCT GGC GTT ACC TTG G-3’，R：5’-AGC CCT GTA TTC CGT CTC CT-3’。內參GAPDH引物序列：F：5’-CAT GGC CTT CCG TGT TCC TA-3’，R：5’-TGT CAT CAT ACT TGG CAG GTT TCT-3’。反應條件：95 ℃ 30 min；95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)；60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。以2-△△Ct法計算目的基因的表達。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、小鼠的一般狀況、結腸長度和病理變化

造模后第3天，兩組對照組小鼠開始出現(xiàn)進食減少，活動量少、精神萎靡、便質稀，體質量下降，第5天對照組小鼠開始出現(xiàn)部分血便，癥狀隨時間延長加重，鏡下可見黏膜正常結構破壞，大量炎性細胞浸潤，杯狀細胞減少；兩組治療組癥狀均較相應對照組減輕，鏡下炎性細胞浸潤程度減輕，同時體質量下降減少(圖1)。

野生型對照組和LFA-1-/-對照組結腸長度較相應治療組明顯縮短(P<0.05)，且野生型治療組較LFA-1-/-治療組明顯增加(P<0.05)。野生型對照組結腸組織病理學評分較相應治療組顯著升高(P<0.05)，而LFA-1-/-對照組與LFA-1-/-治療組之間無明顯差異(P>0.05)。兩組治療組結腸組織病理學評分無明顯差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組結腸長度和組織病理學評分(±s)

*與相應對照組比較，P<0.05；▲與野生型治療組比較，P<0.05

二、脾臟和腸系膜淋巴結中Treg細胞比例

野生型治療組和LFA-1-/-治療組小鼠脾臟和腸系膜淋巴結中Treg細胞比例較相應對照組均顯著升高(P<0.05)；野生型治療組脾臟中Treg細胞比例顯著高于LFA-1-/-治療組(P<0.01)，而兩組治療組腸系膜淋巴結中Treg細胞比例無明顯差異(P>0.05)(圖2)。

三、血清IL-10、TGF-β1含量

野生型治療組和LFA-1-/-治療組血清IL-10、TGF-β1含量較相應對照組顯著升高(P<0.01)，且野生型治療組血清TGF-β1含量顯著高于LFA-1-/-治療組(P<0.05)，而兩組治療組血清IL-10含量無明顯差異(P>0.05)(表2)。

A：野生型對照組；B：野生型治療組；C：LFA-1-/-對照組；D：LFA-1-/-治療組

與相應對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組 別IL?10(pg/mL)TGF?β1(pg/mL)IL?10mRNA表達TGF?β1mRNA表達野生型對照組83．51±6．53134．70±10．311．27±0．041．06±0．03野生型治療組121．00±11．08??174．10±9．91??1．07±0．141．19±0．07?LFA?1-/-對照組71．54±6．36114．60±8．251．03±0．040．47±0．13LFA?1-/-治療組105．10±7．24??140．20±8．16??▲0．61±0．09??▲0．70±0．06?▲

與相應對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；▲與野生型治療組比較，P<0.05

四、結腸組織IL-10、TGF-β1 mRNA表達

與相應對照組相比，野生型治療組和LFA-1-/-治療組結腸組織TGF-β1 mRNA表達顯著升高(P<0.05)，野生型治療組IL-10 mRNA表達無明顯差異(P>0.05)，LFA-1-/-治療組IL-10 mRNA表達顯著降低(P<0.01)。野生型治療組結腸組織IL-10、TGF-β1 mRNA表達均顯著高于LFA-1-/-治療組(P<0.05)(表2)。

討 論

Fp對維護腸道菌群的穩(wěn)態(tài)起重要作用，可分泌丁酸鹽和未知產(chǎn)物。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)p具有免疫調節(jié)和抗炎的作用[4]。本課題組的前期動物實驗[5]發(fā)現(xiàn)，對于TNBS誘導的實驗性結腸炎大鼠，F(xiàn)p及其上清液通過增加脾臟中Treg細胞比例而發(fā)揮治療作用，但具體機制不明。說明益生菌對IBD的治療具有舉足輕重的作用。Treg細胞可降低炎性反應，抑制炎性進展，在維持免疫穩(wěn)態(tài)、抗炎等過程中扮演重要角色。研究證明，Treg細胞數(shù)量減少或功能下降與IBD的發(fā)展相關[6]。動物實驗[7]顯示，通過體內輸注Treg細胞可減輕重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠的結腸炎癥狀。臨床研究[8]表明，與正常人相比，IBD患者外周血Treg細胞比例顯著下降。因此，通過提高Treg細胞比例治療IBD已成為目前研究的熱點。Treg細胞分為nTreg細胞和iTreg細胞，兩者具有相似的抑制功能[9]。在人體內，生理情況下nTreg細胞分布于脾臟和淋巴結中，而iTreg細胞主要位于腸道相關淋巴結中[10-11]。本研究流式細胞術結果顯示野生型結腸炎小鼠給予Fp治療后，脾臟和腸系膜淋巴結Treg細胞比例顯著升高，同時癥狀減輕，結腸長度增加，組織病理學評分降低，說明Fp可有效治療結腸炎小鼠；LFA-1-/-結腸炎小鼠經(jīng)Fp治療后，組織病理學評分與相應對照組無明顯差異，考慮LFA-1對Treg細胞功能有調控作用，進而影響了Fp治療結腸炎的療效。

LFA-1為β2家族成員，可與細胞間黏附分子-1(ICAM-1)結合，對淋巴細胞的遷移、活化、歸巢等有顯著作用[12]。動物實驗[13-14]表明，敲除LFA-1基因可導致外周Treg細胞比例和功能的降低。本研究中，F(xiàn)p治療后可提高LFA-1-/-小鼠脾臟和腸系膜淋巴結Treg細胞比例，提示Fp通過多種途徑調控Treg細胞的分化。本實驗中，野生型治療組脾臟中Treg細胞比例高于LFA-1-/-治療組，提示Fp與LFA-1可能協(xié)同促進Treg細胞分化，但具體機制不明；而兩組腸系膜淋巴結中Treg細胞比例無明顯差異，考慮到細胞活性、溫度、抗體結合度等條件可影響流式細胞術，實驗結果可能會有一定誤差。

Treg細胞通過分泌IL-10和TGF-β而在IBD中發(fā)揮抗炎作用。有研究表明，TGF-β mRNA表達可證實Treg細胞的存在[15]。Schramm等[16]發(fā)現(xiàn)，外周Treg細胞比例升高是由于轉基因小鼠高表達TGF-β。TGF-β具有抑制炎癥的作用，在自身免疫中發(fā)揮重要作用，TGF-β1缺陷小鼠可引起全身多器官炎癥，并可發(fā)生早期死亡[17]。IL-10主要由巨噬細胞和單核細胞產(chǎn)生，具有抗炎作用。IL-10缺失可導致與CD相似的結腸炎，且CD的復發(fā)與低含量IL-10相關[18]。本研究兩組治療組血清IL-10和TGF-β1含量均高于相應對照組，說明Fp抗炎的機制可能與促進抗炎因子的分泌有關。LFA-1-/-治療組中血清TGF-β1含量顯著低于野生型治療組，而IL-10含量無明顯差異。Wohler等[14]的研究亦發(fā)現(xiàn)，Treg細胞治療LFA-1-/-結腸炎小鼠的療效不如野生型小鼠。

本研究還發(fā)現(xiàn)，野生型和LFA-1-/-結腸炎小鼠經(jīng)Fp治療后，TGF-β1 mRNA表達均顯著升高，但野生型治療組IL-10 mRNA表達與相應對照組無明顯差異，這一結果與野生型治療組外周血IL-10含量較相應對照組升高不一致，考慮到體內促炎因子如IL-17A等可影響IL-10的分泌，前期研究[19]已表明Fp可下調促炎因子IL-17A。考慮到IL-17A對IL-10的分泌有負反饋作用，有利于維持腸道內促炎因子/抗炎因子的平衡，維持腸道內穩(wěn)態(tài)。有臨床研究[20]表明，UC患者T細胞中IL-10 mRNA表達明顯升高，結腸中IL-10陽性細胞含量亦明顯升高。本研究中LFA-1-/-治療組IL-10 mRNA表達較相應對照組顯著降低，考慮LFA-1缺失影響了外周Treg細胞向腸道組織的遷移。LFA-1-/-小鼠經(jīng)Fp治療后IL-10、TGF-β1 mRNA表達顯著低于野生型治療組，與LFA-1缺失影響Treg細胞的分化遷移有關。而Fp在LFA-1缺失的情況下，起調控Treg細胞相關炎性因子表達的作用。

綜上所述，雖然LFA-1能調控Treg細胞的分化和遷移以及相關細胞因子的基因表達，但不能忽視Fp對Treg細胞的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)p在LFA-1缺失的情況下能上調Treg細胞比例，促進抗炎因子TGF-β1 mRNA表達。Fp治療LFA-1-/-結腸炎小鼠的療效低于野生型小鼠，可能與LFA-1缺失對Treg細胞功能的發(fā)揮和細胞因子表達受限有關。進一步探究Fp與LFA-1協(xié)同作用的機制，可為今后治療IBD提供新思路。

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(2016-08-01收稿；2016-09-06修回)

Effect ofFaecalibacteriumprausnitziion Treg Cells and Cytokines in Colitis Mice with LFA-1 Knockout

ZHANGMin1,LIYuanyuan2,ZHANGDongbo3,YUChenggong1,2.

1ClinicalCollegeofChineseandWesternIntegratedMedicine,NanjingUniversityofChineseMedicine/DrumTowerHospital,Nanjing(210008);2DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing;3DepartmentofGastroenterology,NanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing

YU Chenggong, Email: chenggong_yu@nju.edu.cn.

Faecalibacteriumprausnitzii; Lymphocyte Function-Associated Antigen-1; T-Lymphocytes, Regulatory; Colitis; Interleukin-10; Transforming Growth Factor beta1

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.03.006

國家自然科學基金項目(81470819)

#本文通信作者，Email: chenggong_yu@nju.edu.cn

Background: It has been widely accepted thatFaecalibacteriumprausnitzii(Fp) induces the differentiation of Treg cells. Lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1) is also involved in the differentiation of Treg cells. Aims: To investigate the effect of Fp on Treg cells and cytokines in colitis mice with LFA-1 knockout (LFA-1-/-). Methods: Twenty wild type mice and twenty LFA-1-/-mice with same genetic background were randomly divided into wild type control group, wild type treatment group, LFA-1-/-control group and LFA-1-/-treatment group. Colitis model was induced by drinking DSS solution. Mice in the two treatment groups were intragastrically administrated with Fp. General status and histopathological score were assessed. Percentages of Treg cells in spleen and mesenteric lymph nodes were measured by flow cytometry. Serum levels of IL-10 and TGF-β1 were measured by ELISA. mRNA expressions of IL-10 and TGF-β1 in colonic tissue were detected by real time PCR. Results: Compared with corresponding control groups, histopathological score was significantly decreased in wild type treatment group (P<0.05); percentages of Treg cells in spleen and mesenteric lymph nodes were significantly increased (P<0.05), serum levels of IL-10 and TGF-β1 were significantly increased (P<0.01), expression of TGF-β1 mRNA was significantly increased in wild type treatment group and LFA-1-/-treatment group (P<0.05); expression of IL-10 mRNA was significantly decreased in LFA-1-/-treatment group (P<0.01). Compared with wild type treatment group, serum level of TGF-β1 was significantly decreased (P<0.05), and mRNA expressions of IL-10 and TGF-β1 were significantly decreased in LFA-1-/-treatment group (P<0.05). Conclusions: Fp can up-regulate the percentages of Treg cells and enhance the secretion of anti-inflammatory cytokines IL-10 and TGF-β1 in LFA-1-/-mice. The therapeutic efficacy for colitis in wild type mice is superior to that in LFA-1-/-mice, which may be related to the inhibition of function of Treg cells and secretion of cytokines due to LFA-1 knockout.