何偉麗， 翟賀寧， 許戈陽(yáng)， 楊景哥， 楊 華， 王存川△

(暨南大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院普通外科， 2附屬第一醫(yī)院內(nèi)鏡中心， 3醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系, 廣東 廣州 510632)

肥胖2型糖尿病患者與大鼠胃旁路術(shù)后血清總膽汁酸水平的變化*

何偉麗1， 翟賀寧2△， 許戈陽(yáng)3， 楊景哥1， 楊 華1， 王存川1△

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院普通外科，2附屬第一醫(yī)院內(nèi)鏡中心，3醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系, 廣東 廣州 510632)

目的： 觀察胃旁路術(shù)對(duì)肥胖2型糖尿病患者及肥胖2型糖尿病模型大鼠血清總膽汁酸水平的影響，并探討其分子機(jī)制。方法: 收集并分析2011年6月～2016年6月暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院肥胖2型糖尿病患者共87例術(shù)后血糖恢復(fù)情況及血清總膽汁酸水平變化數(shù)據(jù)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選用SD大鼠，高脂喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射低劑量鏈脲佐菌素的方法制作肥胖2型糖尿病模型，分為正常對(duì)照(普通飼料喂養(yǎng)非手術(shù))組、胃旁路手術(shù)組及假手術(shù)組，檢測(cè)手術(shù)前后大鼠血糖及血清總膽汁酸水平，HE染色觀察大鼠胰腺組織病理變化，ELISA方法檢測(cè)大鼠肝組織膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)含量，real-time PCR和Western blot分別檢測(cè)各組大鼠肝組織CYP7A1和小分子異源二聚體伴侶(SHP) mRNA和蛋白水平。結(jié)果: 肥胖2型糖尿病患者及模型大鼠胃旁路術(shù)后空腹血糖降低，血清總膽汁酸水平升高，肝組織合成膽汁酸經(jīng)典途徑的限速酶CYP7A1含量降低，CYP7A1 mRNA和蛋白表達(dá)量均減少，肝組織膽汁酸合成的負(fù)性調(diào)節(jié)因子SHP mRNA和蛋白表達(dá)量均增加，與假手術(shù)組比較差異顯著(P<0.05)。結(jié)論: 胃旁路手術(shù)后肥胖2型糖尿病患者及模型動(dòng)物血清總膽汁酸水平升高，且該變化并非因經(jīng)典途徑合成膽汁酸增多。

胃旁路術(shù)； 肥胖； 2型糖尿??； 膽汁酸

隨著人們飲食結(jié)構(gòu)的變化、生活方式的改變，近年來(lái)肥胖2型糖尿病患者逐年增多[1]，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)超重或肥胖人口約占總?cè)丝诘?/4，且超重與肥胖人群2型糖尿病患病率分別為12.8%和18.5%，并且我國(guó)2型糖尿病患者中約50%腹型肥胖[2-3]。肥胖2型糖尿病患者藥物治療療效欠佳[4]。而近年來(lái)開(kāi)展的胃旁路手術(shù)不但緩解了肥胖問(wèn)題，患者高血糖狀態(tài)也得到長(zhǎng)期有效控制，甚至達(dá)到治愈標(biāo)準(zhǔn)[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)胃旁路手術(shù)后血清總膽汁酸水平升高[6]。膽汁酸可通過(guò)激活法尼酯X受體(farnesoid X receptor, FXR)和G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體1(G protein-coupled bile acid receptor 1, GPBAR1; 又稱(chēng)TGR5)兩大類(lèi)受體參與糖代謝調(diào)節(jié)[7]。研究發(fā)現(xiàn)低膽汁酸水平更容易導(dǎo)致肥胖和脂代謝紊亂[8]。膽汁酸作為膽汁的主要成分，是以膽固醇為原料在肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化而成，膽汁酸從頭合成是機(jī)體肝組織清除膽固醇的主要方式，肝細(xì)胞合成膽汁酸途徑有兩種：經(jīng)典途徑和替代途徑，經(jīng)典途徑占體內(nèi)膽汁酸合成80%以上，該途徑合成的限速酶是膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7α-hydroxylase, CYP7A1)，替代途徑由甾醇27-羥化酶(sterol 27-hydroxylase, CYP27A1)催化，約占總膽汁酸合成的18%。正常情況下人體每天合成膽汁酸約0.2～0.6 g，糞便排出約占體內(nèi)膽汁酸的5%，并通過(guò)腸-肝循環(huán)維持動(dòng)態(tài)平衡[9]。并且當(dāng)血清中膽汁酸升高后，可以通過(guò)上調(diào)SHP負(fù)反饋調(diào)節(jié)CYP7A1，從而維持血清中膽汁酸平衡[10]。盡管臨床研究發(fā)現(xiàn)胃旁路術(shù)后血清總膽汁酸水平顯著升高，但是其具體分子機(jī)制未明。本研究收集并分析2011年6月～2016年6月暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院肥胖2型糖尿病患者共87例術(shù)后血糖恢復(fù)情況及血清總膽汁酸水平變化數(shù)據(jù)，還通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究肥胖2型糖尿病模型大鼠血清總膽汁酸水平的變化，以探討胃旁路手術(shù)后血清總膽汁酸變化的分子調(diào)控機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 臨床研究對(duì)象

收集2011年6月～2016年6月期間暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的胃旁路手術(shù)治療肥胖2型糖尿病患者術(shù)前及術(shù)后半年以上隨訪時(shí)血清總膽汁酸及血糖等相關(guān)數(shù)據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

SPF級(jí)21日齡SD大鼠，購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(粵)2011-0029，飼養(yǎng)于暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)管理中心SPF級(jí)動(dòng)物房，動(dòng)物飼養(yǎng)許可證號(hào)為SCXK(粵)2012-0017。普通飼料參照Research Diets公布的AIN-93M，高脂飼料在此基礎(chǔ)上添加動(dòng)物脂肪(豬油)和蔗糖作為高脂飼料，蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪能量比值為13.9∶45.9∶40.2，飼料由廣州市花都區(qū)華東信華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)加工，許可證號(hào)為SCXK(粵)2009-0023，經(jīng)廣州市華大輻照中心鈷60輻照(輻照劑量25.0 kGy)后送入暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)管理中心SPF級(jí)動(dòng)物房喂養(yǎng)大鼠。

CYP7A1抗體及試劑盒購(gòu)自Millipore;SHP抗體購(gòu)自Santa Cruz;CYP7A1 ELISA試劑盒購(gòu)自Cloud-Clone;HRP標(biāo)記的馬抗山羊IgG購(gòu)自Vector Laboratories;兔抗小鼠Ⅱ抗購(gòu)自DAKO;發(fā)光液購(gòu)自Engreen Biosystem;real-time PCR試劑盒購(gòu)自Roche;BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo。

3 主要方法

3.1 樣本采集及臨床指標(biāo)測(cè)定 所有研究對(duì)象記錄術(shù)前身高、體重，禁食8 h空腹抽取靜脈血，EDTA-K2抗凝管及促凝管測(cè)定空腹血糖和糖化血紅蛋白,全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽汁酸水平。

3.2 動(dòng)物模型制備 參照相關(guān)文獻(xiàn)[11-12]及預(yù)實(shí)驗(yàn)方法制作肥胖2型糖尿病大鼠模型，將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照(normal control，NC)組和高脂飼料組，分別予普通飼料和高脂飼料，飼養(yǎng)8周后，在高脂飼料組稱(chēng)重篩選出體重超過(guò)正常對(duì)照組平均體重20%的大鼠，腹腔注射鏈脲佐菌素40 mg/kg，制作肥胖2型糖尿病模型，按照以禁食8 h空腹血糖大于11.2 mmol/L，且隨機(jī)血糖大于16.7 mmol/L為成模標(biāo)準(zhǔn)[13]，將成模大鼠隨機(jī)分為胃旁路手術(shù)(Roux-en-Y gastric bypass，RYGB)組和假手術(shù)(sham)組，按照相應(yīng)干預(yù)方法進(jìn)行干預(yù)，分別予術(shù)前及術(shù)后第10周，大鼠麻醉后眶上靜脈采血，離心分離血清進(jìn)行生化檢測(cè)，取一部分大鼠肝組織及胰腺組織于4%甲醛溶液中固定，進(jìn)行常規(guī)HE染色，另一部分于-80 ℃凍存進(jìn)行蛋白及mRNA水平檢測(cè)。

3.3 各組動(dòng)物干預(yù)方法

3.3.1 NC組 作為正常對(duì)照，給予普通飼料，不限制飼料和飲水(檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)時(shí)除外)。

3.3.2 RYGB組 根據(jù)大鼠胃解剖的特殊性及參考相關(guān)文獻(xiàn)[14]，采取以下方法：在屈氏韌帶遠(yuǎn)端15 cm處離斷空腸，近端空腸與遠(yuǎn)端空腸下15 cm處行端側(cè)吻合；切除胃大彎大部分胃組織使體積剩余約10%，形成管狀胃，保留幽門(mén)，幽門(mén)口處離斷，近端與上提的遠(yuǎn)端空腸吻合，遠(yuǎn)端縫合形成盲端。

3.3.3 Sham組 分別在胃大彎側(cè)切開(kāi)2 cm切口并縫合，于幽門(mén)口及屈氏韌帶下15 cm處離斷并吻合，延長(zhǎng)麻醉及手術(shù)時(shí)間，使之與同期進(jìn)行胃旁路手術(shù)的大鼠的手術(shù)時(shí)間一致。

3.4 動(dòng)物血糖及糖耐量測(cè)定 通過(guò)Roche卓越型血糖儀檢測(cè)大鼠尾靜脈采血血糖，術(shù)后第10周檢測(cè)大鼠糖耐量，檢測(cè)方法為大鼠禁食不禁水過(guò)夜，用50%葡萄糖以1 g/kg灌胃，尾靜脈采血分別檢測(cè)灌胃前及灌胃后15、30、60、120、180 min時(shí)的血糖。

3.5 動(dòng)物血清及組織處理 術(shù)前及術(shù)后大鼠眶上靜脈采血，血液凝固后于4 ℃、3 500 r/min離心15 min，分離血清用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽汁酸含量。大鼠處死后，迅速取出部分肝組織并置于液氮中，隨后在-80 ℃保存?zhèn)溆茫〕龅牟糠忠认俳M織放入4%甲醛溶液固定，并進(jìn)一步石蠟固定做病理HE染色觀察。

3.6 ELSIA法檢測(cè)肝組織CYP7A1含量 嚴(yán)格按照CYP7A1試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行肝組織CYP7A1檢測(cè)及建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。簡(jiǎn)述步驟如下：精確稱(chēng)取各組大鼠等量肝組織，進(jìn)行肝組織勻漿并離心取上清稀釋后檢測(cè)，采用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔吸光度(A)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)最佳方程式，根據(jù)樣品濃度及稀釋倍數(shù)算得各樣品實(shí)際濃度。

3.7 Real-time PCR檢測(cè)肝組織中mRNA的水平 使用TRIzol試劑盒分離純化術(shù)后第10周大鼠肝組織的總RNA，分光光度法測(cè)定并計(jì)算提取的總RNA含量及濃度。參照One Step real-time PCR試劑盒推薦的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟，在Chromo 4實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR，內(nèi)參照使用β-actin，擴(kuò)增條件為95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，共設(shè)置40個(gè)循環(huán)。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的目的基因cDNA序列，使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，β-actin的上游引物序列為5’-CTGAACCCTAAGGCCAACCG-3’，下游引物序列為5’-GACCAGAGGCATACAGGGACAA-3’；SHP的上游引物序列為5’-GAGCCAGGAAGAAACAGGAACAAG-3’，下游引物序列為5’-CGGGGCTTAGAAGTGTGTAGAGAA-3’；CYP7A1的上游引物序列為5’-CGAAGGCATTTGGACACAGAAG-3’，下游引物序列為5’-ACCCAGGCATTGCTCTTTGATT-3’。以β-actin作為內(nèi)參照，記錄各孔Ct值，取3孔平均值作為最終結(jié)果，并采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

3.8 Western blot檢測(cè)肝組織CYP7A1及SHP蛋白表達(dá)情況 取100 mg大鼠肝組織，提取各組蛋白，BCA法蛋白定量。定量后調(diào)整各蛋白濃度，加上樣緩沖液調(diào)整濃度為5 g/L后混勻、煮沸變性，約5～10 min。使用12%分離膠分離蛋白，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1～2 h，相應(yīng)Ⅰ抗4 ℃孵育過(guò)夜，Ⅱ抗室溫孵育1 h，洗膜3次后加入ECL發(fā)光液，進(jìn)行曝光并記錄條帶的吸光度做定量分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，口服糖耐量數(shù)據(jù)以曲線(xiàn)下面積進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較用單因素方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量的數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 臨床肥胖2型糖尿病患者血清總膽汁酸術(shù)前與術(shù)后變化及相關(guān)數(shù)據(jù)

收集2011年6月～2016年6月期間暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院收治的胃旁路手術(shù)治療肥胖2型糖尿病患者，排除有數(shù)據(jù)缺失的病例后共87例，其中男性55例，女性32例，經(jīng)進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)，平均年齡為(35.1±10.2) 歲，收集術(shù)前及術(shù)后半年以后隨訪時(shí)血糖、糖化血紅蛋白、體重及血清總膽汁酸的數(shù)據(jù)并統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明胃旁路手術(shù)具有較好的減輕體重和控制血糖效果，并且術(shù)后半年以上的血清總膽汁酸水平明顯升高，見(jiàn)表1。

表1 臨床肥胖2型糖尿病患者手術(shù)前后血糖、糖化血紅蛋白、身體質(zhì)量指數(shù)及膽汁酸的變化

*P<0.05vsbefore RYGB.

2 大鼠胃旁路手術(shù)前后體重變化

NC組作為普通飼料喂養(yǎng)對(duì)照組僅作制作模型時(shí)的參照及各種因素干預(yù)后除體重外其它指標(biāo)的對(duì)照，術(shù)前RYGB組體重與sham組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，均高于NC組(P<0.05)。Sham組和RYGB組第4、10周體重均比術(shù)前下降，第10周時(shí)顯著低于NC組(P<0.05)，RYGB組比sham組體重下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示胃旁路手術(shù)能夠明顯降低大鼠體重，見(jiàn)表2。

表2 大鼠胃旁路手術(shù)前后體重

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vssham group.

3 大鼠胃旁路手術(shù)前后空腹血糖變化

與sham組比較，胃旁路術(shù)后第4、10周RYGB組大鼠空腹血糖水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示胃旁路手術(shù)具有治療2型糖尿病的作用，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Fasting blood glucose in rats before and after gastric bypass surgery. Mean±SD. n=8～9. *P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs sham group.

4 大鼠胃旁路手術(shù)后糖耐量變化

空腹糖耐量檢測(cè)顯示，RYGB組胃旁路術(shù)后第10周大鼠糖耐量曲線(xiàn)接近NC組，曲線(xiàn)下面積明顯低于sham組(P<0.05)，提示胃旁路手術(shù)具有確切的長(zhǎng)期改善高血糖狀態(tài)的作用，見(jiàn)圖2。

5 大鼠胃旁路手術(shù)后胰腺組織病理學(xué)改變

術(shù)后第10周胰腺組織病理HE染色，與NC組比較，sham組胰島萎縮，β細(xì)胞凋亡，存留β細(xì)胞肥大代償，部分顆粒脫失，脂質(zhì)沉積；RYGB組胰島細(xì)胞增生，向外分泌部沿伸，提示胃旁路手術(shù)可以促進(jìn)胰島細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡，見(jiàn)圖3。

6 大鼠胃旁路手術(shù)前后血清總膽汁酸水平變化

與NC組比較，術(shù)前RYGB組及sham組血清總膽汁酸水平稍高;術(shù)前RYGB組與sham組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;術(shù)后第10周，RYGB組較sham組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

Figure 2.Glucose tolerance in rats after gastric bypass surgery. AUC: area under the curve. Mean±SD. n=8～9. *P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs sham group.

Figure 3.Pathological changes of pancreatic tissue in rats.

表3 大鼠胃旁路手術(shù)前后血清總膽汁酸水平

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vssham group.

7 雙抗夾心ELISA法檢測(cè)大鼠胃旁路手術(shù)后肝組織CYP7A1含量

雙抗夾心ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，術(shù)后第10周RYGB組與sham組比較肝組織膽汁酸合成限速酶CYP7A1含量明顯降低。RYGB術(shù)后膽汁酸合成應(yīng)該是減少，然而血清膽汁酸水平卻較高，提示有其它途徑導(dǎo)致胃旁路術(shù)后血膽汁酸水平升高，見(jiàn)表4。

表4 大鼠胃旁路手術(shù)后肝組織CYP7A1含量

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vssham group.

8 大鼠胃旁路手術(shù)后肝組織CYP7A1和SHP mRNA相對(duì)水平

Real-time PCR結(jié)果顯示，RYGB組CYP7A1 mRNA水平較sham組顯著降低；RYGB組SHP mRNA水平較sham組顯著增高(P<0.05)，提示胃旁路手術(shù)后肝組織膽汁酸合成經(jīng)典途徑的限速酶CYP7A1受抑制，且負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子SHP激活，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The relative expression levels of CYP7A1 mRNA and SHP mRNA in rat liver tissue after gastric bypass surgery. Mean±SD. n=8～9. *P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs sham group.

9 大鼠胃旁路手術(shù)后肝組織CYP7A1和SHP蛋白水平

Western blot結(jié)果顯示，RYGB組術(shù)后肝組織CYP7A1蛋白表達(dá)低于sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5； RYGB組術(shù)后肝組織SHP蛋白表達(dá)高于sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖6，進(jìn)一步提示胃旁路手術(shù)后肝組織膽汁酸合成經(jīng)典途徑的限速酶CYP7A1受抑制，且負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子SHP激活。

Figure 5.The expression level of CYP7A1 protein in rat liver tissue after gastric bypass surgery. Mean±SD. n=8～9. *P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs sham group.

Figure 6.The expression level of SHP protein in rat liver tissue after gastric bypass surgery. Mean±SD. n=8～9. *P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs sham group.

討 論

大量研究表明，胃旁路手術(shù)后肥胖2型糖尿病患者的體重和高血糖狀態(tài)持續(xù)改善，胃旁路術(shù)后食物攝入量減少，體重明顯降低，高血糖狀態(tài)逐步改善，多數(shù)患者可以停用抗血糖藥物，長(zhǎng)期療效確切[15]。我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示術(shù)后第10周大鼠體重明顯降低，空腹血糖及口服糖耐量接近或達(dá)到正常水平，提供了進(jìn)一步的依據(jù)。在臨床胃旁路手術(shù)后，血清總膽汁酸水平明顯升高是近些年關(guān)注的熱點(diǎn)[16-17]，我們的臨床回顧性研究也證實(shí)了這種結(jié)果。良好的動(dòng)物模型在疾病的研究中具有重要作用，本課題研究采用聯(lián)合高脂飼料和低劑量鏈脲佐菌素的方法，制作肥胖2型糖尿病動(dòng)物模型，該方法造價(jià)便宜，可操作性強(qiáng)，一定程度上符合人類(lèi)糖尿病的生化和病理特征，最為常用[18]。

從本臨床病例回顧研究表明，胃旁路手術(shù)后空腹血糖和糖化血紅蛋白較術(shù)前明顯降低，指標(biāo)多恢復(fù)正常范圍，提示胃旁路手術(shù)具有較好的減輕體重和緩解2型糖尿病的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也表明，胃旁路手術(shù)后大鼠體重明顯降低，低于sham組和NC組，RYGB組術(shù)后胰腺組織病理結(jié)果表明胰島細(xì)胞增殖，向外分泌部沿伸，改變了向萎縮、凋亡的方向發(fā)展，促進(jìn)胰島素的分泌，進(jìn)而調(diào)控空腹血糖及糖耐量，起到良好的治療2型糖尿病的效果，與臨床結(jié)論一致[19]。

CYP7A1作為膽汁酸合成的經(jīng)典途徑的限速酶，在膽固醇的穩(wěn)態(tài)和膽汁酸的平衡中起重要作用，其基因表達(dá)受反饋和負(fù)反饋機(jī)制以及復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的嚴(yán)格控制，膽固醇可以通過(guò)反饋調(diào)節(jié)直接激活CYP7A1的表達(dá)，促進(jìn)膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化；膽汁酸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)有多條通路，主要是通過(guò)激活FXR，誘導(dǎo)靶基因SHP表達(dá)，SHP與LRH-1和LXRα結(jié)合從而抑制CYP7A1的表達(dá)[9]。SHP作為FXR的靶基因，是孤兒受體超家族的一員，但與其它核受體相比缺少DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，因此也是一個(gè)非典型的核受體，SHP在FXR負(fù)反饋調(diào)節(jié)CYP7A1中起到重要的中介作用[10]。

本研究中臨床病例及模型大鼠胃旁路術(shù)后血總膽汁酸水平顯著升高，大鼠肝組織SHP mRNA水平升高，蛋白表達(dá)增加，提示膽汁酸負(fù)反饋通路可能被激活，抑制了膽汁酸合成的限速酶CYP7A1的表達(dá)，本研究結(jié)果也顯示肝組織CYP7A1活性下降，mRNA水平降低，蛋白表達(dá)下降，提示正是這種負(fù)反饋機(jī)制被激活的結(jié)果，膽汁酸的經(jīng)典合成途徑受抑制，但是血中總膽汁酸水平卻顯著升高，有可能因?yàn)槲概月肥中g(shù)改變了膽汁酸的腸-肝循環(huán)，重吸收增加，排泄持續(xù)減少有關(guān)[20]。由于胃旁路手術(shù)即在保留小部分胃底及胃體小彎的方法制作胃小囊，胃小囊與空腸以Roux-en-Y形式吻合，大部分胃、十二指腸全部和近端空腸曠置，食物繞過(guò)該部分直接在下段空腸與排入腸道的膽汁匯合又迅速到達(dá)回腸，膽汁與食糜混合尚未充分即被大量重吸收，從而增加了血膽汁酸水平[21]，然而這種膽汁酸水平的增加從臨床數(shù)據(jù)來(lái)看并不是不受限制的完全病理狀態(tài)的增加，是在逐漸增加到一定范圍后通過(guò)負(fù)反饋?zhàn)饔脤?duì)經(jīng)典合成途徑起到一定抑制，從而使人體總膽汁酸水平達(dá)到一個(gè)相對(duì)高的水平，而具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。血中總膽汁酸水平較高更有利于內(nèi)源性配體激活膽汁酸相關(guān)核受體和膜受體家族相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)體內(nèi)糖脂代謝[22]，維持糖脂代謝平衡。本研究中sham組大鼠血清總膽汁酸含量較NC組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，是由于肥胖2型糖尿病導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積，脂肪和膽固醇沉積肝細(xì)胞促進(jìn)了膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)，并且已有實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)證實(shí)[23-24]。但本研究中胃旁路術(shù)后血清膽汁酸增加與其比較更明顯，且具體機(jī)制不同。

我們的這一研究進(jìn)一步證實(shí)了臨床肥胖2型糖尿病患者術(shù)后半年以上及肥胖2型糖尿病大鼠術(shù)后血清總膽汁酸水平升高，其分子機(jī)制并非膽汁酸的經(jīng)典合成途徑增加，而是有其它途徑，比如有可能膽汁酸的腸-肝循環(huán)過(guò)程中重吸收增加等最終導(dǎo)致血清總膽汁酸水平增加。我們這一發(fā)現(xiàn)為研究膽汁酸在胃旁路手術(shù)治療肥胖合并糖尿病中作用提供了依據(jù)，其分子機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Effects of gastric bypass surgery on serum total bile acid in obese diabetic patients and rats

HE Wei-li1, ZHAI He-ning2, XU Ge-yang3, YANG Jing-ge1, YANG Hua1, WANG Cun-chuan1

(1DepartmentofGeneralSurgery，TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofEndoscopyCenter,TheFirstAffiliatedHospital,3DepartmentofPhysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:yzhn@foxmail.com;twcc@jnu.edu.cn)

AIM: To observe the effects of gastric bypass surgery on the levels of serum total bile acid in the obese diabetic patients and rats. METHODS: Anthropometric data of obese diabetic patients with gastric bypass surgery from June 2011 to June 2016 were collected in the First Affiliated Hospital of Jinan University. Obese diabetic animal mo-del was established in SD rats by high-fat diet feeding combined with intraperitoneal injection of low-dose streptozocin. Gastric bypass surgery or sham operation was performed on the rats with successful modeling. The levels of serum total bile acid were measured by a Hitachi automatic biochemistry analyzer， and the content of hepatic cholesterol 7α-hydroxylase (CYP7A1) was detected by ELISA. The expression of hepatic CYP7A1 and small heterodimer partner (SHP) at mRNA and protein levels was determined by real-time PCR and Western blot, respectively. RESULTS: The serum levels of total bile acid were significantly increased in postoperative obese diabetic patients and rats as compared with control groups. Gastric bypass surgery inhibited rat hepatic CYP7A1 content, mRNA level and protein level, but stimulated hepatic SHP expression. CONCLUSION: Total serum bile acid increases in both patients and rats after gastric bypass surgery by non-typical bile acid synthesis pathway.

Gastric bypass; Obesity; Type 2 diabetes mellitus; Bile acid

1000- 4718(2017)03- 0462- 07

2017- 01- 05

2017- 01- 18

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 31401001)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2016A030310086);廣州市科技計(jì)劃(No. 2014Y2-00097); 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(No. 21615333)；暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院科研培育專(zhuān)項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(No. 2013104)

△通訊作者 翟賀寧 Tel： 020-38688447； E-mail： yzhn@foxmail.com； 王存川 Tel： 020-38688685； E-mail： twcc@jnu.edu.cn

R363; R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.013