錢國強， 張小照， 丁晶晶， 尹曉峰

(黃淮學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 駐馬店 463000)

蟲草素預(yù)處理減輕SD大鼠心肌缺血再灌注損傷*

錢國強△， 張小照， 丁晶晶， 尹曉峰

(黃淮學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 駐馬店 463000)

目的： 研究大鼠心肌缺血再灌注(IR)損傷中，蟲草素(cordycepin，Cordy)能否通過調(diào)節(jié)微小RNA-455(miR-455)的表達(dá)和減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)引起的凋亡發(fā)揮心肌保護作用。 方法：體重250～300 g的SD大鼠隨機分為3組：對照(control)組，大鼠只進行開胸手術(shù)；IR組，大鼠心肌缺血30 min，再灌注120 min；蟲草素治療組(IR+Cordy組)：大鼠缺血再灌注前給予蟲草素(10 mg/kg)股靜脈注射，每天1次，共注射1周。全自動化學(xué)分析法檢測大鼠血清中乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)活性。TUNEL試劑盒檢測心肌內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, EC)凋亡率，電鏡觀察EC超微結(jié)構(gòu)的改變。RT-qPCR法檢測心肌組織miR-455及ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號通路的標(biāo)志物葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78(glucose-regulated protein 78，Grp78)和 caspase-12 的 mRNA表達(dá)。 結(jié)果：與control組比較，IR組EC的凋亡率明顯升高(P<0.05)；與IR組比較，蟲草素組EC的凋亡率明顯下降(P<0.05)。與control組比較，IR組的EC線粒體腫脹，膜不規(guī)整，內(nèi)皺疏松有空泡，基粒消失，核膜不規(guī)整，染色質(zhì)濃集、邊集，核仁消失，甚至出現(xiàn)凋亡小體；IR+Cordy組與IR組比較癥狀大為改善。與control組比較，IR組心肌組織Grp78和caspase-12的mRNA及miR-455含量均升高(P<0.05)；與IR組比較，IR+Cordy組Grp78和caspase-12的mRNA及miR-455的含量均降低(P<0.05)。 結(jié)論：蟲草素可有效減輕心肌IR后大鼠心肌EC凋亡，降低心肌組織miR-455表達(dá)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

蟲草素； 缺血再灌注損傷； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； 微小RNA-455； 細(xì)胞凋亡

冠心病是目前中老年人多發(fā)病，致殘致死率高，為防治該病，消耗了大量的醫(yī)療資源[1]，其病理生理機制為缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)損傷。心肌細(xì)胞凋亡是影響缺血再灌注損傷后心功能能恢復(fù)的重要因素[2]，如何減輕心肌IR損傷引起的細(xì)胞凋亡、保護心功能，仍然是心血管領(lǐng)域臨床研究的重要課題。蟲草素(cordycepin，Cordy)為中藥冬蟲夏草的主要活性成分，對心、腦、腎缺血再灌注損傷及心律失常有明顯防治作用，研究表明蟲草素可顯著降低缺血再灌注心肌的丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，改善心肌的能量代謝從而減輕缺血再灌注損傷，抑制IR誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[3-4]，但確切機制尚未明確。過強和持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可引起細(xì)胞死亡[5]。研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)控miR-455的表達(dá)，可減少ERS引起的心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心臟保護作用[6-7]。本研究觀察蟲草素能否通過影響miR-455表達(dá)水平，減少心肌過度ERS，發(fā)揮其對IR心肌的保護作用。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠30只，體重250～300 g，雌雄不拘，由廣東省實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2008-0002。飼養(yǎng)條件：溫度25 ℃，濕度36%，自由飲水、進食。

2 藥物、試劑及實驗器材

蟲草素購自中國藥品生物制品檢定所。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒和肌酸激酶MB同工酶(creatinine kinase MB isoenzyme，CK-MB)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TRIzol RNA試劑盒和Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒(Tiangen)；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒(凱基公司)；兔抗鼠血管性血友病因子(von Willebrand Factor， vWF)抗體(DAKO)；過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(Jackson)；DAB染色試劑盒(中杉金橋公司)；電熱恒溫風(fēng)干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)；TC-1205型智能程控生物組織自動脫水機/TB-718D生物組織包埋機(湖北泰維醫(yī)療科技有限公司)；AS-325切片機(Leica)。

3 方法

3.1 實驗分組 30只雄性SD大鼠分為3組，每組10只。Control組：大鼠只進行開胸手術(shù)[將大鼠稱重，注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，固定大鼠仰臥于手術(shù)臺；剪除頸部和胸部被毛，碘伏消毒，縱形剪開頸部皮膚約1.5～2 cm；分離皮下組織及肌肉，鈍性分離氣管，剪開氣管半周，氣管插管，接呼吸機；調(diào)整呼吸頻率每分鐘60～80次、通氣量40 mL/kg,呼吸比為2∶1，予呼氣末持續(xù)正壓通氣；于胸骨左緣3 mm縱形剪開胸部皮膚約4 cm，鈍性分離皮下、胸大肌與前鋸肌，撐開胸大肌及前鋸肌，顯露肋骨及肋間肌，三肋間逐步剪開肋間肌；顯露胸膜，以止血鉗于呼氣時刺破胸膜，進入胸腔]，未做缺血再灌注處理。IR組：開胸后，撐開肋骨，以小鑷子撕破心包，顯露心臟；探查確定左心耳，結(jié)扎位置為肺動脈圓錐與左心耳交界處下方2 mm；結(jié)扎大鼠冠脈左前降支；疊一0.8～1 mm的絲線折疊物放置于5-0線結(jié)扎線內(nèi)，出針打結(jié)，5-0線結(jié)扎；缺血30 min，松開結(jié)扎，再灌注120 min。 IR+Cordy組：股靜脈注射蟲草素(10 mg/kg)，每天1次，持續(xù)1周，最后1次于實驗前30 min注射，心肌缺血30 min再灌注120 min取材。模型復(fù)制的可靠性用連續(xù)監(jiān)視心電圖 Ⅱ?qū)?lián)的變化來判斷，以ST段抬高為心肌缺血存在,以ST段回落1/2為再灌注成功。

3.2 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡 TUNEL 凋亡檢測試劑盒嚴(yán)格按照原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，滴加抗vWF(內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物)抗體稀釋液(1∶200)，4 ℃濕盒孵育過夜；滴加相應(yīng)的過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶250)，4 ℃暗室孵育1 h；DAB染色，顯微鏡下檢測并拍照，內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)及胞膜呈黃褐色，胞核呈棕色。檢測前對石蠟切片進行微波修復(fù)，按照試劑盒說明書操作。陽性細(xì)胞核和(或)細(xì)胞碎片呈深淺不一的棕黃色，每張切片于缺血部位隨機選取8個高倍視野(×200)，分別記數(shù)凋亡內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)和內(nèi)皮細(xì)胞總數(shù)并進行匯總，以凋亡細(xì)胞數(shù)占內(nèi)皮細(xì)胞總數(shù)的百分比作為凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。

3.3 電子顯微鏡切片制作及觀察步驟 取心肌組織修成1 mm×1 mm×1 mm形狀， 4%戊二醛固定液固定2 h，0.1 mmol/L磷酸緩沖液沖洗 10 min、3 次，1% OsO4浸泡2 h，0.1 mmol/L磷酸緩沖液沖洗 10 min×3 次，50%乙醇浸泡15 min，70%和90% 乙醇各浸泡15 min，90% 丙酮與90% 乙醇1∶1混合浸泡15 min，90% 丙酮浸泡15 min，100% 丙酮浸泡10 min×3次，100% 丙酮與包埋劑1∶1混合液中過夜，純包埋劑2 h，包埋劑進入膠囊浸透(烤箱40 ℃)過夜，聚合24 h(60 ℃)，超薄切片后鉛染色，電鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變。

3.4 mRNA檢測方法 用TRIzol一步法提取心肌總RNA，按照Tiangen試劑盒說明書操作進行逆轉(zhuǎn)錄，獲取cDNA。應(yīng)用RT-qPCR法測定葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78, Grp78)和caspase-12的miRNA表達(dá)量及miR-455的表達(dá)水平。引物序列見表1。

3.5 LDH和CK-MB的檢測方法 血液標(biāo)本靜置30 min，以3 000 r/min，4 ℃離心15 min，取血清按照試劑盒說明書操作。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 15.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析及Bonferroni檢驗進行兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 RT-qPCR的引物序列

F: forward; R: reverse.

結(jié) 果

1 心肌IR模型大鼠的心電圖改變

心電圖可見ST段明顯抬高≥0.1 mV或T波高聳，心肌顏色變暗紅色為結(jié)扎成功標(biāo)志；30 min后松開結(jié)扎線, 抬高的ST段下降在 1/2以上者為缺血再灌注成功，見圖1。

Figure 1.The ST segment elevation was more than 0.1 mV or T wave ascended, the myocardial turning dark and red was the symbol of success of ligation. 30 min after ligature was released, the ST elevation decreased more than 1/2 proved ischemia reperfusion model was successful.

2 蟲草素對IR大鼠心肌內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及血清LDH和CK-MB活性的影響

由圖2及表2可見，與control組比較，IR組心肌內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率明顯升高(P<0.05)；與IR組比較，IR+Cordy組心肌內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率明顯下降(P<0.05)。與control組比較，IR組血清LDH和CK-MB的活性均升高(P<0.05)，與IR組比較，IR+Cordy組的血清LDH和CK-MB活性均降低(P<0.05)，見表2。

Figure 2.The representitive images of the TUNEL staining to determining the apoptosis of the myocardial endothelial cells in the rats treated with cordycepin (Cordy) before IR injury (×200).

表2 血清LDH和CK-MB活性及心肌內(nèi)皮細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsIR group.

3 電鏡下心肌內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化的觀察

電鏡觀察可見，control組的心肌內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜規(guī)整，嵴粒存在，內(nèi)皺緊密，無空泡，核膜規(guī)整，染色質(zhì)均勻，無濃集現(xiàn)象，核仁存在；IR組線粒體腫脹，膜不規(guī)整，內(nèi)皺疏松有空泡，基粒消失，核膜不規(guī)整，染色質(zhì)濃集、邊集，核仁消失，甚至出現(xiàn)凋亡小體； IR+Cordy組與IR組比較癥狀大為改善，見圖3。

4 大鼠心肌Grp78和caspase-12的mRNA表達(dá)及miR-455水平的比較

由表3可見，與control組比較，IR組大鼠心肌Grp78和caspase-12 的mRNA表達(dá)及miR-455 的水平均明顯升高(P<0.05)；與IR組比較，IR+Cordy組Grp78的和caspase-12 的mRNA及miR-455的水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Figure 3.The images of myocardial endothelial cells in the rats with different treatments observed under transmission electron microscope (×12 500).

表3 大鼠心肌Grp78和caspase-12 mRNA表達(dá)及miR-455水平的比較

*P<0.05vscontrol group;△P<0.05vsIR group.

討 論

蟲草素是冬蟲夏草的主要活性成分，其主要的藥理作用有抗腫瘤、抗白血病、調(diào)節(jié)人體內(nèi)分泌、增強人體免疫功能、抗菌、消炎、降血脂、降血糖、延緩衰老抑制ROS介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞反應(yīng)、阻礙新生內(nèi)膜形成等[8-10]。蟲草素顯著對抗心肌IR損傷，其保護作用可能是通過激活A(yù)kt/GSK-3β/p70S6K信號通路，抑制Bax裂解和caspase-3表達(dá)以及增加Bcl-2表達(dá)及Bcl-2/Bax比值來完成[4]。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞內(nèi)死亡程序激活而導(dǎo)致的細(xì)胞 “自殺”行為。本研究觀察到，IR時心肌內(nèi)皮細(xì)胞損傷加重，線粒體明顯損傷，出現(xiàn)凋亡；蟲草素可以明顯改善內(nèi)皮細(xì)胞的功能，減輕內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是蛋白質(zhì)合成的主要場所,蛋白質(zhì)在其中折疊變化最終成為成熟蛋白質(zhì)，病理條件下，未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在ER內(nèi)大量堆積會損傷ER的正常生理功能，發(fā)生ERS[11]。過強和持續(xù)的ERS可引起細(xì)胞死亡[5]，Grp78被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志物[12]，caspase-12是觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡信號通路的特異基因[13]。miRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平特異性識別靶基因的3’UTR相應(yīng)靶點，并通過堿基互補配對方式與之結(jié)合，從而抑制或加速降解特定靶基因而發(fā)揮作用。研究表明，心肌高表達(dá)或特異表達(dá)的miRNA參與調(diào)控了心臟多種生理和病理過程[14-15]。

本研究結(jié)果表明，蟲草素預(yù)處理能顯著降低IR大鼠心肌內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率，減少CK-MB和LDH釋放。同時，蟲草素減少了心肌IR后ERS標(biāo)志物Grp78和ERS凋亡特異性蛋白caspase-12的表達(dá)，提示蟲草素可減少心肌IR后ERS介導(dǎo)的凋亡。另外，蟲草素降低了心肌IR后miR-455的表達(dá)水平，提示miR-455可能參與了ERS引起的心肌凋亡信號通路的調(diào)節(jié)。本研究為臨床上蟲草素的藥物開發(fā)提供了新的潛在靶點。

[1] Hausenloy DJ, Yellon DM. New directions for protecting the heart against ischaemia-reperfusion injury: targeting the Reperfusion Injury Salvage Kinase (RISK)-pathway[J]. Cardiovasc Res, 2004, 61(3):448-460.

[2] Orogo AM, Gustafsson ?B. Cell death in the myocardium:my heart won’t go on[J]. IUBMB Life, 2013, 65(8):651-656.

[3] 劉鳳芝, 李延平, 黃明莉, 等. 冬蟲夏草醇提物對大鼠缺血再灌注過程心肌保護作用研究[J]. 中國病理生理雜志, 1999, 15(3):240-241.

[4] Park ES, Kang DH, Yang MK, et al. Cordycepin, 3’-deoxyadenosine, prevents rat hearts from ischemia/reperfusion injury via activation of Akt/GSK-3β/p70S6K signaling pathway and HO-1 expression[J]. Cardiovasc Toxicol, 2014, 14(1):1-9.

[5] Miyazaki Y, Kaikita K, Endo M, et al. C/EBP homologous protein deficiency attenuates myocardial reperfusion injury by inhibiting myocardial apoptosis and inflammation[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2011, 31(5):1124-1132.

[6] Belmont PJ, Chen WJ, Thuerauf DJ, et al. Regulation of microRNA expression in the heart by the ATF6 branch of the ER stress response[J]. J Mol Cell Cardiol, 2012, 52 (5):1176-1182.

[7] 康 波, 劉紅明, 洪 江, 等. 硫化氫調(diào)節(jié)miRNA-455表達(dá)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報, 2014, 27(12):1245-1249.

[8] 余伯成, 唐永范, 唐 亮, 等. 蟲草素的藥理作用研究進展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2011, 26(5):351.

[9] Feng X. Regulatory roles and molecular signaling of TNF family members in osteoclasts[J]. Gene, 2005, 350(1):1-13.

[10]Won KJ, Lee SC, Lee CK, et al. Cordycepin attenuates neointimal formation by inhibiting reactive oxygen species-mediated responses in vascular smooth muscle cells in rats[J]. J Pharmacol Sci, 2009, 109(3):403-412.

[11]Yang C, Wang Y, Liu H, et al. Ghrelin protects H9c2 cardiomyocytes from angiotensin II-induced apoptosis through the endoplasmic reticulum stress pathway[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2012,59(5):465-471.

[12]Luo S, Mao C, Lee B, et al． GRP78/BiP is required for cell proliferation and protecting the inner cell mass from apoptosis during early mouse embryonic development[J]．Mol Cell Biol, 2006, 26(15):5688-5697．

[13]Morishima N，Nakanishi K，Takenouchi H，et al． An endoplasmic reticulum stress-specific caspase cascade in apoptosis. Cytochromec-independent activation of caspase-9 by caspase-12[J]. J Biol Chem, 2002, 277(37):34287-34294．

[14]Kang B, Hong J, Xiao J, et al． Involvement of miR-1 in the protective effect of hydrogen sulfide against cardiomyocyte apoptosis induced by ischemia/reperfusion[J]. Mol Biol Rep, 2014, 41(10):6845-6853．

[15]吳錦波, 葉小漢, 冼紹祥, 等. 中藥心康方對心力衰竭大鼠心肌miR-25-3p表達(dá)水平和SERCA2a活性的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(10):1770-1774.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Preconditioning with cordycepin attenuates myocardial ischemia-reperfusion injury in SD rats

QIAN Guo-qiang, ZHANG Xiao-zhao, DING Jing-jing, YIN Xiao-feng

(SchoolofMedicine,HuanghuaiUniversity,Zhumadian463000,China.E-mail:gqqian1@163.com)

AIM: To study whether cordycepin (Cordy) plays a role in myocardial protection by regulating the expression of microRNA-455 (miR-455) and reducing apoptosis induced by endoplasmic reticulum stress in the ischemia-reperfusion (IR) rats. METHODS: SD rats (250～300 g) were randomly divided into 3 groups: control group, the chests of the rats were only opened; IR group, the rats were given myocardial ischemia for 30 min, and then reperfusion for 120 min; IR+Cordy group: before IR, the rats were given Cordy (10 mg/kg) through femoral vein injection once a day for one week, and the last injection was given 30 min before ischemia. Automated biochemical analysis was used to detect rat serum activity of LDH and CK-MB. The myocardial endothelial cell (EC) apoptotic rate was measured by TUNEL, and the ultrastructural changes of the myocardial EC were observed under transmission electron microscope. RT-qPCR was used to detect the expression of miR-455 and the mRNA levels of glucose-regulated protein 78 (Grp78) and caspase-12 in the myocardium. RESULTS: Compared with control group, EC apoptosis in IR group was significantly increased (P<0.05). Compared with IR group, EC apoptosis in IR+Cordy group decreased significantly (P<0.05). Compared with control group, swelling of mitochondria, irregular membrane, loose wrinkles with vacuoles, disappeared matrix granules, irregular nuclear membrane, chromatin condensation, disappeared nucleoli and even small apoptosis body in the EC were found in IR group. Compared with IR group, the symptoms in IR+Cordy group were greatly improved. Compared with control group, the mRNA expression of Grp78 and caspase-12 as well as the miR-455 level in IR group was increased (P<0.05). Compared with IR group, the mRNA expression of Grp78 and caspase-12, as well as the miR-455 level in IR+Cordy group was decreased (P<0.05). CONCLUSION: Cordycepin attenuates myocardial EC apoptosis, down-regulates the expression of miR-455, and inhibits endoplasmic reticulum stress in the myocardium.

Cordycepin; Ischemia-reperfusion injury; Endoplasmic reticulum stress; MicroRNA-455; Apoptosis

1000- 4718(2017)03- 0543- 05

2016- 09- 22

2016- 11- 24

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81173189)； 河南省科技攻關(guān)項目； 河南省高等學(xué)校青年骨干教師培養(yǎng)計劃

△通訊作者 Tel: 0396-2838858; E-mail: gqqian1@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.027