應趙建， 黃曉敏， 余埡妮， 林曉曉， 陳 晶， 李文君， 董 年， 陳成水

(溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，浙江 溫州 325000)

PI3K/CTGF信號通路在TGF-β1誘導A549細胞表達collagen I過程中的作用*

應趙建， 黃曉敏▲， 余埡妮， 林曉曉， 陳 晶， 李文君， 董 年△， 陳成水△

(溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，浙江 溫州 325000)

目的： 研究磷脂酰肌醇3-激酶/結(jié)締組織生長因子(PI3K/CTGF) 信號通路在轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導人肺腺癌A549細胞表達I型膠原蛋白(collagen I)過程中的分子機制。方法: 體外培養(yǎng)A549細胞，予TGF-β1刺激，觀察CTGF和collagen I的mRNA和蛋白表達及PI3K信號通路的活化；PI3K抑制劑LY294002預先處理A549細胞后，觀察TGF-β1刺激下CTGF和collagen I mRNA和蛋白表達的變化；CTGF特異性siRNA干擾A549細胞中CTGF的表達后，觀察TGF-β1刺激下collagen I mRNA和蛋白表達的變化和PI3K信號通路的活化。結(jié)果: TGF-β1可以誘導A549細胞中CTGF和collagen I的mRNA和蛋白表達以及PI3K信號通路的活化；PI3K特異性抑制劑LY294002可以部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導的A549細胞中CTGF和Collagen I mRNA和蛋白表達的升高。干擾CTGF可以降低TGF-β1誘導的A549細胞collagen I mRNA和蛋白表達，而不影響PI3K信號通路的活化。結(jié)論: CTGF是TGF-β1/PI3K信號通路調(diào)控的即刻早期反應效應蛋白，參與了TGF-β1誘導的A549細胞中collagen I表達。

轉(zhuǎn)化生長因子β1； I型膠原蛋白； 結(jié)締組織生長因子

細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)代謝異常是腫瘤的重要特征之一，肺癌是高度纖維化的腫瘤，以I型膠原蛋白(collagen I)為代表的ECM過度沉積在肺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色[1-2]。既往認為腫瘤間質(zhì)中成纖維細胞的激活及表型轉(zhuǎn)化是ECM沉積的中心環(huán)節(jié)，目前認識到肺癌細胞在轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)誘導下可以向成纖維細胞等間質(zhì)細胞分化從而參與ECM的異常沉積[3-4]。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是新近發(fā)現(xiàn)的早期即刻反應蛋白，是TGF-β1調(diào)控的效應蛋白，可以協(xié)同TGF-β1促進細胞表型轉(zhuǎn)化和ECM沉積[5]，然而關于其在肺癌ECM代謝異常中的確切機制尚不清楚。結(jié)合我們之前的研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl-inositol 3-kinase，PI3K)信號通路的活化與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和ECM的沉積密切相關[6-7]，本研究擬進一步探討PI3K信號通路和效應蛋白CTGF在TGF-β1誘導人肺腺癌A549細胞 collagen I表達中的潛在角色，闡明TGF-β1/PI3K/CTGF信號通路在A549細胞ECM合成的調(diào)控機制。

材 料 和 方 法

1 細胞

人肺腺癌細胞A549細胞購于上海中科院細胞庫。

2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；人重組TGF-β1購自PeproTech；PI3K抑制劑LY294002購自Biovision；BCA蛋白濃度測定試劑盒、預染蛋白Marker和ECL發(fā)光液購自Thermo；兔抗人p-Akt和Akt單抗購自CST；兔抗人CTGF和collagen I單抗購自Abcam；TRIzol購自Invitrogen；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa；其它生化試劑購自上海生工生物工程公司。Real-time PCR引物由上海生工生物工程公司設計合成，見表1；siRNA-CTGF由上海吉凱基因技術有限公司設計合成，見表2。

表1 Real-time PCR引物序列

表2 CTGF干擾RNA序列

3 方法

3.1 細胞培養(yǎng) A549細胞株使用包含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.2 細胞干預 取生長狀態(tài)良好處于對數(shù)生長期的細胞，接種于12孔板(抽提RNA)或6孔板(抽提蛋白)，待細胞長至孔板面積80%時，進行分組干預，每個分組設立3個復孔，每個實驗重復3次。

3.3 Real-time PCR實驗 按照TRIzol說明書提取細胞總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。取總RNA 2 μg反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以適量cDNA為模板進行real-time PCR實驗。PCR反應條件為95 ℃10 min； 95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參照，對目的基因進行相對定量。

3.4 Western blot實驗 收集各組細胞，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每組取30 μg蛋白進行凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h， Ⅰ抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜10 min、3次，Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1.5 h，再用TBST緩沖液洗膜10 min×3次，ECL化學發(fā)光法顯影。以β-actin為內(nèi)參照，結(jié)果以各蛋白與β-actin灰度值比值表示。

3.5 siRNA轉(zhuǎn)染 siRNA轉(zhuǎn)染方法按照Lipofectamine 2000產(chǎn)品說明書進行，提前1 d將1×105個細胞接種于24孔板，次日按照24孔板每孔取2 μL CTGF-siRNA、1 μL Lipofectamine 2000和50 μL Opti-MEM I的比例配制CTGF-siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合液，將siRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合液添加入細胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后更換為含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。

4 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(mean±SD)，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 TGF-β1誘導collagen I表達升高

選取不同濃度的TGF-β1刺激A549細胞不同時間， real-time qPCR和Western blot法檢測collagen I的mRNA和蛋白的表達。結(jié)果顯示，TGF-β1可以誘導A549細胞中collagen I的表達，呈現(xiàn)濃度和時間依賴性升高，其中5 μg/L TGF-β1是最適刺激濃度，TGF-β1刺激48 h collagen I升高最為顯著，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The expression of collagen I induced by TGF-β1. A: the mRNA expression of collagen I induced by TGF-β1 at different doses for the indicated time; B: the protein level of collagen I changed by TGF-β1 at different doses for 48 h; C: the protein level of collagen I changed by TGF-β1 at 5 μg/L for the indicated time. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 h; #P<0.05, ##P<0.01 vs 0 μg/L.

2 TGF-β1誘導CTGF的即刻早期表達

選取5 μg/L TGF-β1刺激A549細胞不同時間，結(jié)果顯示TGF-β1可以誘導A549細胞中CTGF即刻早期表達，mRNA和蛋白在TGF-β1刺激3 h時即發(fā)生升高，TGF-β1刺激6 h時CTGF蛋白表達最高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The expression of CTGF induced by TGF-β1. A: the mRNA expression of CTGF induced by TGF-β1 at different doses for the indicated time; B: the protein level of CTGF changed by TGF-β1 at different doses for 48 h; C: the protein level of CTGF changed by TGF-β1 at 5 μg/L for the indicated time. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs 0 h group; #P<0.05, ##P<0.01 vs 0 μg/L.

3 TGF-β1活化PI3K信號通路,PI3K抑制劑逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導的CTGF和collagen I表達升高

選取不同濃度的TGF-β1刺激A549細胞不同時間，用Western blot法檢測，可見TGF-β1可以激活PI3K信號通路，呈現(xiàn)濃度和時間依賴性。使用不同濃度的PI3K抑制劑LY294002預先處理A549細胞，再使用5 μg/L TGF-β1刺激48 h，結(jié)果可見PI3K抑制劑 LY294002可以逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導的A549細胞中CTGF和collagen I表達，呈現(xiàn)劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.TGF-β1 induced PI3K/Akt signaling pathway activation, and PI3K inhibitor reversed the expression of CTGF and collagen I induced by TGF-β. A: the protein levels of Akt and p-Akt changed by with the vehicle or TGF-β1 at different doses for 10 min; B: the protein levels of Akt and p-Akt changed by TGF-β1 at dose of 5 μg/L for different time; C: the mRNA and protein levels of CTGF were measured after incubation with PI3K inhibitor LY294002 at different doses and TGF-β1 (5 μg/L) for 6 h; D: the mRNA and protein levels of collagen I were measured after incubation with PI3K inhibitor LY294002 at different doses and TGF-β1 (5 μg/L) for 48 h. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs Con (control) group; △△P<0.01 vs 0 min group; #P<0.05, ##P<0.01 vs TGF-β1 group.

4 siRNA-CTGF-2是最佳干擾序列并影響collagen I的基礎表達

4條不同的干擾序列siRNA-CTGF轉(zhuǎn)染A549細胞24 h后，用real-time qPCR和Western blot分別檢測CTGF的mRNA和蛋白表達，結(jié)果可見siRNA-CTGF-2干擾A549細胞中CTGF表達的效果最佳，見圖4A。與對照組及siRNA陰性對照組相比，siRNA-CTGF-2組的collagen I基礎表達降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4B。

Figure 4.siRNA-CTGF-2 was the best interference sequence and impaired the basal collagen I synthesis. A: the mRNA and protein expression of CTGF modified by different siRNAs; B: the mRNA and protein expression of collagen I were measured after CTGF interference by siRNA-CTGF2. Mean±SD. n=3. *P<0.05,**P<0.01 vs Con (control) group; #P<0.05, ##P<0.01 vs siRNA-Con group.

5 干擾CTGF表達影響TGF-β1誘導的collagen I表達升高而不影響PI3K信號通路的活化

siRNA-CTGF-2轉(zhuǎn)染24 h干擾A549細胞中CTGF的表達，再用5 μg/L TGF-β1刺激10 min，結(jié)果顯示siRNA-CTGF-2轉(zhuǎn)染并不影響TGF-β1活化PI3K信號通路，差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖5A。然而，siRNA-CTGF-2轉(zhuǎn)染明顯降低TGF-β1誘導的collagen I表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5B。

Figure 5.Interference of CTGF expression impaired TGF-β1-induced collagen I synthesis but not PI3K/AKT signaling pathway activation. A: the protein levels of Akt and p-Akt changed by the vehicle or TGF-β1 at dose of 5 μg/L for 10 min after CTGF interference; B: TGF-β1-induced mRNA and protein expression of collagen I was measured after CTGF interference. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs Con (control) or siRNA-Con group; ##P<0.01 vs siRNA-CTGF-2 group; △P<0.05, △△P<0.01 vs TGF-β1+siRNA-Con group.

討 論

既往認為腫瘤間質(zhì)中成纖維細胞的激活及表型轉(zhuǎn)化是腫瘤胞外基質(zhì)代謝異常的關鍵[8]，目前逐漸認識到腫瘤細胞可以發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化不僅扮演了ECM沉積啟動細胞，釋放的TGF-β1等轉(zhuǎn)化生長因子參與腫瘤間質(zhì)中成纖維細胞的活化，更扮演了繼發(fā)受體的角色，其分泌的炎癥因子可以以自分泌或旁分泌的方式作用于自身[9]。TGF-β1是關鍵的促纖維化因子，主要激活經(jīng)典的Smad通路和非經(jīng)典Smad通路共同介導ECM中膠原蛋白(collagen)和纖連蛋白(fibronectin)等的沉積[10-11]。近來的研究揭示非經(jīng)典Smad通路PI3K的過度活化參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展，我們之前的實驗發(fā)現(xiàn)PI3K抑制劑可以逆轉(zhuǎn)慢性氣道重塑中膠原的沉積，然而關于PI3K如何參與肺癌胞外機制代謝異常研究甚少。CTGF屬于早期即刻反應蛋白，影響成纖維細胞的活性，在纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[12-13]。作為TGF-β1的調(diào)控蛋白，研究報道TGF-β1主要是經(jīng)Smad通路調(diào)控CTGF，然而有報道稱哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制劑可以反向激活PI3K通路促進肺癌細胞中CTGF的過度表達，協(xié)同TGF-β1參與了ECM沉積[14-15]。本研究旨在探究PI3K信號通路和效應蛋白CTGF在TGF-β1誘導A549細胞的collagen I表達中的的潛在角色，為未來針對肺癌ECM代謝異常揭示潛在的干預靶點。

我們研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可以誘導A549細胞的collagen I的表達升高，與之前的研究報道類似，除此之外，TGF-β1可以誘導CTGF的早期表達和PI3K信號通路的活化。使用PI3K抑制劑可以逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導的CTGF的早期表達和collagen I的表達升高，提示我們PI3K信號通路和經(jīng)典的Smad通路共同參與了TGF-β1調(diào)控的CTGF早期表達。我們進一步經(jīng)siRNA-CTGF特異性降低A549細胞中CTGF的表達，發(fā)現(xiàn)A549細胞的collagen I基礎表達及TGF-β1誘導的collagen I表達同時發(fā)生了降低，而不影響TGF-β1活化PI3K信號通路。

總而言之，我們研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1經(jīng)活化PI3K信號通路調(diào)控A549細胞中collagen I的表達升高，CTGF是TGF-β1/PI3K信號通路潛在的調(diào)控蛋白，協(xié)同TGF-β1誘導A549細胞中collagen I的表達升高，初步闡述了TGF-β1/PI3K/CTGF信號通路在調(diào)控A549細胞collagen I表達中的分子機制。CTGF和PI3K信號通路可能是未來針對肺癌ECM過度沉積的潛在干預靶點。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of PI3K/CTGF signaling pathway on TGF-β1-induced collagen I expression in A549 cells

YING Zhao-jian, HUANG Xiao-min, YU Ya-ni, LIN Xiao-xiao, CHEN Jing, LI Wen-jun, DONG Nian, CHEN Cheng-shui

(DepartmentofPulmonaryandCriticalCareMedicine,TheFirstAffiliatedHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail:wzmudongnian@foxmail.com;wzchencs@163.com)

AIM: To investigate the molecular mechanism of transforming growth factor β1/phosphatylinositol 3-kinase/connective tissue growth factor (TGF-β1/PI3K/CTGF) signaling pathway in the induction of collagen I expression in human lung adenocarcinoma A549 cells. METHODS: The A549 cells were culturedinvitroand stimulated by TGF-β1. The expression of CTGF and collagen I at mRNA and protein levels as well as the activation of PI3K was measured. The A549 cells were pre-treated with PI3K inhibitor LY294002, the expression of CTGF and collagen I at mRNA and protein levels was measured upon TGF-β1 stimulation. Under the condition ofCTGFinterference by siRNA-CTGF, the expression of collagen I at mRNA and protein levels as well as the activation of PI3K by TGF-β1 stimulation was measured. RESULTS: TGF-β1 stimulated the expression of CTGF and collagen I at mRNA and protein levels as well as the activation of PI3K at a dose- and time-dependant manner. PI3K inhibitor LY294002 partly reversed TGF-β1-induced CTGF and collagen I expression. Interference ofCTGFdown-regulated TGF-β1-induced collagen I expression without the effect on the activation of PI3K. CONCLUSION: PI3K signaling pathway plays a pivotal role in TGF-β1-induced collagen I expression in the A549 cells. CTGF is an immediate early response effector protein of TGF-β1/PI3K signaling pathway and synergizes with TGF-β1 in the induction of collagen I expression in the A549 cells.

Transforming growth factor β1; Collagen I; Connective tissue growth factor

1000- 4718(2017)03- 0489- 06

2016- 09- 21

2016- 12- 01

國家自然科學基金資助項目(No. 81270131； No. 81570075)

△通訊作者 董 年 Tel: 0577-86352962; E-mail: wzmudongnian@foxmail.com; 陳成水 Tel: 0577-55578186; E-mail: wzchencs@163.com

▲并列第1作者

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.017