唐 斌， 張金國， 譚洪勇， 尉希清

(1山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012； 2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)二科，山東 濟(jì)寧 272092)

黃芪甲苷對慢性心衰大鼠心肌纖維化及能量代謝的影響*

唐 斌1,2， 張金國2△， 譚洪勇2， 尉希清2

(1山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)二科，山東 濟(jì)寧 272092)

目的： 研究黃芪甲苷對慢性心衰大鼠心肌纖維化的影響，初步探討其具體機(jī)制。方法: 采用腹主動脈縮窄法(AAC)建立大鼠慢性心衰模型，建模成功后隨機(jī)分為模型組、纈沙坦組及黃芪甲苷組，另建立假手術(shù)組。纈沙坦組和黃芪甲苷組分別給予2 mg·kg-1·d-1的纈沙坦及30 mg·kg-1·d-1的黃芪甲苷灌胃，假手術(shù)組及模型組給予生理鹽水灌胃。8周后收集心臟結(jié)構(gòu)及血流動力學(xué)參數(shù)，留取心肌染色后觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，Western blot和RT-qPCR檢測長鏈脂酰輔酶A脫氫酶(LCAD)、6-磷酸果糖激酶1(PFK1)的蛋白及mRNA表達(dá)情況。結(jié)果: 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的左室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)、膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)、左室后壁厚度(LVPWD)、PFK1蛋白及mRNA表達(dá)均升高(P<0.05)，LCAD蛋白及mRNA表達(dá)均下降(P<0.05)。與模型組相比，纈沙坦組及黃芪甲苷組LVMI、CVF、LVPWD、PFK1蛋白及mRNA表達(dá)均下降(P<0.05)，LCAD蛋白及mRNA表達(dá)升高(P<0.05)。結(jié)論: 黃芪甲苷可以抑制慢性心衰大鼠心肌纖維化，其機(jī)制可能是通過上調(diào)LCAD、下調(diào)PFK1、糾正能量代謝異常實(shí)現(xiàn)的。

能量代謝； 黃芪甲苷； 慢性心力衰竭； 心肌纖維化

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是多種心血管疾病的終末階段，CHF患者可出現(xiàn)肺循環(huán)和體循環(huán)淤血的臨床表現(xiàn)，如咳嗽、咳痰、呼吸困難、下肢水腫、消化功能下降等，其治療方式目前以對癥處理、改善心功能為主，尚無有效根治措施[1-2]。目前全球大約有4千萬CHF患者，截止到2011年僅美國就有570萬CHF患者且每年新增病例達(dá)到87萬[3]。心肌纖維化是CHF發(fā)生發(fā)展的重要病理變化之一，其主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞壞死凋亡、膠原纖維增生、室壁厚度增加、心臟變大[4-5]。抑制心肌纖維化可以明顯延緩心衰的發(fā)生發(fā)展，對改善心衰患者的預(yù)后具有重要意義。黃芪甲苷(astragaloside IV，AS-IV)是中藥黃芪的提取物，其具有多種藥理作用，如改善心功能、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能、神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)等[6-8]。相關(guān)研究表明黃芪甲苷可以抑制CHF大鼠心肌纖維化、改善心功能，但其具體機(jī)制尚未明確[9]。本文以腹主動脈縮窄法(abdominal aorta constriction，AAC)誘導(dǎo)的CHF大鼠為研究對象，探討黃芪甲苷對CHF大鼠纖維化心肌的保護(hù)作用，并從心肌能量代謝的角度初步探討其可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑

8周齡雄性SD大鼠80只，體重(230±10) g，購自山西醫(yī)科大學(xué)動物中心(許可證號為SCXJ晉20150001)；黃芪甲苷購自南京春秋生物工程有限公司；兔抗鼠長鏈脂酰輔酶A脫氫酶(long-chain acyl-CoA dehydrogenase，LCAD)及6-磷酸果糖激酶1(6-phosphofructokinase-1，PFK1)多克隆抗體分別購自武漢博士德生物工程有限公司及Thermo；兔抗鼠肌動蛋白β-actin抗體及羊抗兔 Ⅱ 抗購自武漢博士德生物工程有限公司；RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科技有限公司；UltraSYBR Mixture購自康為世紀(jì)；Masson 染色試劑盒購自上海歌凡生物科技有限公司。

2 方法

2.1 模型的建立及分組 采用AAC的方式建立CHF模型大鼠60只，6周后通過超聲心動圖結(jié)合大鼠癥狀判斷模型是否建立成功。將建模成功的大鼠通過隨機(jī)數(shù)字表分為CHF模型組、纈沙坦(valsartan, Val)組及AS-IV組。另外建立假手術(shù)(sham)組。

2.2 藥物干預(yù) 模型建立成功后，纈沙坦及黃芪甲苷組大鼠分別給予2 mg·kg-1·d-1和30 mg·kg-1·d-1的纈沙坦及黃芪甲苷灌胃，假手術(shù)組及模型組給予相同體積的生理鹽水灌胃。連續(xù)干預(yù)8周后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 收集心臟結(jié)構(gòu)及血流動力學(xué)參數(shù) 干預(yù)結(jié)束后，各組大鼠進(jìn)行心臟超聲及左心室插管，收集各組大鼠左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)、左室后壁厚度(left ventricular posterior wall depth，LVPWD)、左心室舒張末期壓力(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左心室收縮壓(left ventricular end-systolic pressure，LVSP)等參數(shù)。

2.4 留取標(biāo)本進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 左室插管結(jié)束后，留取心肌測定游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)及葡萄糖水平。大劑量水合氯醛處死大鼠后留取心臟，分析天平稱量左心室及全心重量，計(jì)算右室質(zhì)量指數(shù)(right ventricular mass index，RVMI)及左室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)，部分左心室組織于4%甲醛中固定，部分左心室組織于液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱中保存。

2.5 心肌形態(tài)學(xué)檢查 左室心肌經(jīng)過固定、脫水、包埋、切片的標(biāo)準(zhǔn)程序制成病理切片，然后進(jìn)行HE及Masson染色，觀察心肌細(xì)胞肥大程度及膠原纖維增生情況，通過IPP 6.0圖像分析系統(tǒng)對Masson染色的切片進(jìn)行膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)測定[10]。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測LCAD及PFK1的mRNA表達(dá)水平 分別提取各組大鼠心肌總RNA，然后將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為RT-qPCR的模板。由上海生工設(shè)計(jì)并合成LCAD和PFK1的引物序列(表1)，以β-actin作為內(nèi)參照，通過2-ΔΔCt法[11]比較各組大鼠心肌中mRNA的相對含量。

表1 RT-qPCR中各引物序列

2.7 Western blot檢測LCAD和PFK1的表達(dá) 提取心肌組織中的總蛋白，進(jìn)行定量及變性后通過Wes-tern blot檢測各組大鼠心肌中LCAD及PFK1的表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參照，定量計(jì)算并比較各組大鼠Western blot條帶灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本研究所有數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，首先通過單因素方差分析(one-way ANOVA)判斷各組間差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然后采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠基線情況

所有大鼠在實(shí)驗(yàn)前均進(jìn)行心臟超聲檢查，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)各組大鼠基線情況基本一致，未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。

2 實(shí)驗(yàn)中大鼠死亡情況

實(shí)驗(yàn)期間模型組大鼠死亡2只，余組未見死亡，死亡原因考慮與手術(shù)感染、心力衰竭及呼吸衰竭等有關(guān)。模型大鼠從AAC術(shù)后3周開始逐漸出現(xiàn)呼吸急促、對外界刺激反應(yīng)淡漠、精神萎靡、食欲不振等癥狀，黃芪甲苷或纈沙坦干預(yù)后大鼠上述癥狀有所改善，假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)上述癥狀。

表2 各組大鼠基線情況

3 模型評價(jià)

大鼠在AAC術(shù)后6周行心臟超聲檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AAC大鼠LVEDD[(5.75±0.22)mm]較假手術(shù)組[(5.11±0.32)mm]升高(P<0.05)，LVESD[(2.97±0.31)mm]較假手術(shù)組[(2.50±0.33)mm]升高(P<0.05)，LVPWD[(1.49±0.21)mm]較假手術(shù)組[(1.06±0.30)mm]升高(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;同時(shí)AAC大鼠表現(xiàn)出疲乏、呼吸困難、精神萎靡、食欲降低等癥狀，基本符合Bishop提出的實(shí)驗(yàn)動物心衰標(biāo)準(zhǔn)[12]。

4 干預(yù)結(jié)束后大鼠心臟結(jié)構(gòu)及血流動力學(xué)參數(shù)

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠LVEDP、LVSP、LVEDD、LVESD和LVPWD明顯升高，左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，纈沙坦組及黃芪甲苷組大鼠LVEDP、LVSP、LVEDD、LVESD和LVPWD出現(xiàn)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1及表3、4。

Figure 1.The cardiac structure change after intervention.

表3 各組大鼠干預(yù)結(jié)束后左室結(jié)構(gòu)及血流動力學(xué)變化

**P<0.01vssham group;△△P<0.01vsCHF group.

5 大鼠心臟重構(gòu)的情況

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠LVMI及RVMI較之升高(P<0.01)，提示模型建立成功；與模型組LVMI及RVMI相比，纈沙坦組僅LVMI降低，而黃芪甲苷組則LVMI及RVMI均明顯降低，提示黃芪甲苷可以明顯改善CHF大鼠心室重構(gòu)，見圖2。

6 各組大鼠心肌形態(tài)學(xué)檢查

表4 各組大鼠干預(yù)結(jié)束后左心室結(jié)構(gòu)的變化

**P<0.01vssham group;△P<0.05,△△P<0.01vsCHF group.

Figure 2.The results of LVMI (left ventricular weight/body weight) and RVMI (right ventricular weight/body weight) after intervention. Mean±SD. n=18～20. **P<0.01 vs sham group; △P <0.05, △△ P<0.01 vs CHF group.

HE染色切片示與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌HE染色示心肌細(xì)胞肥大,排列紊亂,細(xì)胞間質(zhì)增多,同時(shí)有炎細(xì)胞浸潤；與模型組相比，纈沙坦及黃芪甲苷組大鼠心肌細(xì)胞未見明顯肥大,排列較為規(guī)則，細(xì)胞間質(zhì)未見顯著變化；Masson染色切片經(jīng)過CVF計(jì)算后發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠心肌CVF[(7.89±0.39)%]較假手術(shù)組大鼠CVF[(1.83±0.59)%]明顯升高(P<0.01)，纈沙坦及黃芪甲苷組大鼠心肌CVF[分別為(5.46±0.51)%和(4.25±0.35)%]較模型組CVF明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且黃芪甲苷比纈沙坦有更好的抑制膠原纖維增生的效果，見圖3。

Figure 3.The morphological change (HE staining) and collagen proliferation (Masson’s trichrome staining) of myocardial tissue after intervention (×200). Red indicates cardiac muscle fibers and blue indicates collagen.

7 各組大鼠心肌中LCAD及PFK1 mRNA表達(dá)情況

與假手術(shù)組相比，模型組LCAD mRNA表達(dá)降低，而PFK1 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，纈沙坦組及黃芪甲苷組LCAD mRNA表達(dá)明顯升高，而PFK1 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The mRNA expression levels of LCAD and PFK1. Mean±SD. n=3. △P<0.05, △△P<0.01 vs CHF group.

8 各組大鼠心肌組織中LCAD和PFK1蛋白表達(dá)情況

經(jīng)計(jì)算Western blot條帶灰度值后發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組LCAD的表達(dá)明顯降低而PFK1的表達(dá)則明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，纈沙坦組LCAD表達(dá)升高(P<0.05)，黃芪甲苷組LCAD表達(dá)明顯升高(P<0.01)，纈沙坦組PFK1表達(dá)下降(P<0.05)，黃芪甲苷組PFK1表達(dá)明顯下降(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5。這與mRNA的結(jié)果相吻合。

9 干預(yù)結(jié)束后各組大鼠心肌FFA及葡萄糖水平

各組大鼠干預(yù)結(jié)束后留取心肌，勻漿后測定FFA及葡萄糖水平，結(jié)果表明與假手術(shù)組相比，模型組大鼠FFA水平升高而葡萄糖水平降低(P<0.01)，與模型組大鼠相比，黃芪甲苷組及纈沙坦組大鼠FFA水平下降而葡萄糖水平升高(P<0.05)。這一結(jié)果提示CHF大鼠對FFA的利用率下降而對葡萄糖的利用率上升，黃芪甲苷則可以改善這種異常狀態(tài)，見圖6。

Figure 5.The protein expression levels of LCAD and PFK1.Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs sham group; △P<0.05, △△P<0.01 vs CHF group.

Figure 6.The FFA and glucose levels after intervention. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs sham group; △P<0.05, △△P<0.01 vs CHF group.

討 論

CHF是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，患者生活質(zhì)量及壽命受到嚴(yán)重影響，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢[13-15]。有研究表明，CHF患者心肌細(xì)胞能量代謝出現(xiàn)異常，由主要依靠脂肪酸氧化供能轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕揽刻墙徒夤┠躘16]。本研究通過對大鼠心肌FFA及葡萄糖的測定證實(shí)了這一觀點(diǎn)。正常的心肌細(xì)胞主要以脂肪酸代謝作為能量來源，而在CHF的心肌能量來源主要為糖酵解[17]。LCAD在脂肪酸的β-氧化過程中發(fā)揮重要作用，其功能主要是把酯酰輔酶A轉(zhuǎn)變?yōu)榉处?烯酰輔酶A，這也是脂肪酸β-氧化的第一步反應(yīng)。PFK1是糖酵解最重要的關(guān)鍵酶，它可以催化6-磷酸果糖轉(zhuǎn)變?yōu)?,6-二磷酸果糖，這也是糖酵解最重要的限速步驟之一[18]。本研究通過AAC增加大鼠后負(fù)荷，以壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的CHF大鼠模型為研究對象，以黃芪甲苷為干預(yù)措施，從心臟結(jié)構(gòu)、血流動力學(xué)及心肌形態(tài)學(xué)變化等方面多角度研究黃芪甲苷對CHF大鼠心臟的影響，并從心肌細(xì)胞能量代謝方面初步探討其可能機(jī)制。

纈沙坦具有抑制心室重構(gòu)的作用，可以改善慢性心衰患者的長期預(yù)后，在臨床上使用較為廣泛，因此本研究以纈沙坦為標(biāo)準(zhǔn)對照，證實(shí)了黃芪甲苷可以抑制CHF大鼠的心肌纖維化，改善心功能，其效果并不劣于纈沙坦，這可能與藥物劑量有關(guān)。本研究通過Western blot及RT-qPCR檢測了各組大鼠心肌中LCAD及PFK1的蛋白及mRNA相對含量，其結(jié)果表明藥物干預(yù)后，與脂肪酸代謝相關(guān)的酶LCAD蛋白及mRNA含量均升高，與糖酵解相關(guān)的酶PFK1蛋白及mRNA含量均降低，且黃芪甲苷這一效應(yīng)較纈沙坦更為明顯，其原因可能與黃芪甲苷抑制心肌纖維化、改善心室重構(gòu)及心衰的效果較纈沙坦明顯有關(guān)。這一結(jié)果提示黃芪甲苷可以提高CHF大鼠心肌細(xì)胞對脂肪酸的代謝能力，降低對糖酵解的過分依賴，從而糾正CHF大鼠心肌細(xì)胞的能量代謝異常。為了證實(shí)這一觀點(diǎn)，本研究對各組大鼠FFA及葡萄糖進(jìn)行了測定，結(jié)果提示黃芪甲苷可以改善CHF大鼠心肌對FFA的利用率，抑制其對葡萄糖的利用。Kato等[19]以鹽敏感性大鼠建立的CHF模型為研究對象，發(fā)現(xiàn)CHF時(shí)心肌對脂肪酸的利用減少，對葡萄糖的利用增加。Ping等[20]以異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心衰大鼠模型為研究對象，同樣發(fā)現(xiàn)在心衰的大鼠心肌中，對脂肪酸的利用減少而對葡萄糖的利用增加。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

由此可見，能量代謝異常在CHF的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，恢復(fù)能量代謝異?？梢悦黠@減輕CHF的進(jìn)展，因此糾正能量代謝異?？梢宰鳛橹委烠HF的研究方向之一[21]。有研究表明，可以激活心肌細(xì)胞脂肪酸代謝關(guān)鍵酶的PPARα可以緩解CHF的進(jìn)展[22]，相關(guān)PPARα的激活劑如非諾貝特等也可以抑制CHF的進(jìn)展[23]。

綜上所述，黃芪甲苷可以從多方面抑制CHF的發(fā)生發(fā)展，其具體機(jī)制可能與糾正心肌細(xì)胞能量代謝異常有關(guān)，這一機(jī)制的發(fā)現(xiàn)為CHF的治療提供了新的思路，可以作為一個新的方向加以深入研究。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of astragaloside IV on myocardial fibrosis and energy metabolism in chronic heart failure rats

TANG Bin1, 2, ZHANG Jin-guo2, TAN Hong-yong2, WEI Xi-qing2

(1SchoolofMedicine,ShandongUniversity,Jinan250012,China;2SecondDepartmentofCardiology,AffiliatedHospitalofJiningMedicalCollege,Jining272092,China.E-mail:cck112000@aliyun.com)

AIM: To observe the effects of astragaloside IV (AS-IV) on myocardial fibrosis in chronic heart failure (CHF) rats and to explore the underlying mechanism preliminarily. METHODS: Chronic heart failure model rats established by abdominal aorta constriction (AAC) were divided into CHF group, valsartan group and AS-IV group. Sham operation group was also established. The rats in valsartan group and AS-IV group received valsartan and AS-IV at 2 and 30 mg·kg-1·d-1, respectively. The rats in sham operation group and CHF group received normal saline. After 8 weeks of treatment, the cardiac structure and the hemodynamic parameters were measured. The morphologic changes of myocardial tissue were observed after staining. The expression of long-chain acyl-CoA dehydrogenase (LCAD) and 6-phosphofructokinase-1 (PFK1) at mRNA and protein levels was determined by RT-qPCR and Western blot. RESULTS: Compared with sham operation group, left ventricular mass index (LVMI), collagen volume fraction (CVF), left ventricular posterior wall depth (LVPWD), and the mRNA and protein of PFK1 in CHF group were increased (P<0.05), while the mRNA and protein levels of LCAD were decreased (P<0.05). Compared with CHF group, the LVMI, CVF, LVPWD, and the mRNA and protein levels of PFK1 in valsartan group and AS-IV group were decreased (P<0.05), while the mRNA and protein levels of LCAD were increased (P<0.05). CONCLUSION: AS-IV inhibits myocardial fibrosis in the CHF rats, the mechanism of which might be associated with up-regulating the expression of LCAD, down-regulating the expression of PFK1 and normalizing the myocardial energy metabolism.

Energy metabolism; Astragaloside IV; Chronic heart failure; Myocardial fibrosis

1000- 4718(2017)03- 0411- 06

2016- 10- 09

2016- 11- 21

山東省高校優(yōu)秀科研創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃資助項(xiàng)目(魯教科字[2012]8號)； 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)科研計(jì)劃(No. JY2013KJ015)

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R541; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.03.005