秦丹卿 何天文 尹愛華

述 評

地中海貧血產(chǎn)前基因診斷技術(shù)的臨床應(yīng)用

秦丹卿1，2何天文1，2尹愛華1，2

地中海貧血是全球廣為流行的遺傳性溶血性疾病，是最常見的單基因遺傳病之一。因缺乏理想的治療手段，在高發(fā)地區(qū)通過對高風(fēng)險夫婦進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷以避免重癥地中海貧血患兒的出生，是國際上公認(rèn)的首選預(yù)防措施。目前，臨床廣泛應(yīng)用侵入性手術(shù)取得胎兒DNA并采用多種分子檢測技術(shù)進(jìn)行基因診斷，但有一定胎兒流產(chǎn)和宮內(nèi)感染的風(fēng)險。以胎兒游離DNA為檢測標(biāo)靶的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)的迅速發(fā)展，為建立一種安全快速、簡便準(zhǔn)確的早期地中海貧血產(chǎn)前基因診斷方法帶來可能。本文就目前應(yīng)用于地中海貧血產(chǎn)前基因診斷的多種技術(shù)作一述評。

地中海貧血；產(chǎn)前基因診斷；分子檢測；無創(chuàng)產(chǎn)前診斷

地中海貧血（地貧）是我國南方地區(qū)高發(fā)的遺傳性血液病，由于其嚴(yán)重的致殘、致死后果對家庭及社會帶來的沉重負(fù)擔(dān)，在包括我國南方在內(nèi)的東南亞地區(qū)、地中海地區(qū)、印度、中東、北非等該病的高發(fā)地區(qū)，地貧已經(jīng)成為這些地區(qū)的公共衛(wèi)生問題。我中心此前對隨機(jī)抽取的14 332個廣東省戶籍家庭的40 808個血樣進(jìn)行的大樣本分子流行病學(xué)調(diào)查提示，廣東省人口地貧基因致病突變攜帶率約為16.83%，相當(dāng)于平均每6個人里就有一個攜帶地貧基因致病突變［1］。

因為缺少經(jīng)濟(jì)、有效的治療手段，通過產(chǎn)前診斷避免重型地貧患兒的出生是目前國際上公認(rèn)的首選預(yù)防措施［2-3］。地貧病因主要是由于珠蛋白基因發(fā)生缺陷導(dǎo)致相應(yīng)的珠蛋白肽鏈合成減少或缺失，從而造成α和β珠蛋白肽鏈比例失衡而引起溶血性貧血［4］。根據(jù)珠蛋白肽鏈合成受到抑制的類型，主要可以分為α-地中海貧血（α-地貧）和β-地中海貧血（β-地貧）2類。地貧產(chǎn)前基因診斷的目的就是防止重型α-地貧又稱Hb Bart's胎兒水腫綜合征以及β珠蛋白基因突變純合子或雙重雜合子引起的重型β-地貧患兒的出生。進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷需要獲得足量的胎兒DNA樣本，目前臨床上廣泛應(yīng)用的是侵入性（有創(chuàng)性）取材，根據(jù)不同孕周分別于11～14周行絨毛穿刺活檢、16周之后行羊水穿刺或24周之后行臍帶血穿刺。本文主要針對目前地貧產(chǎn)前基因診斷技術(shù)進(jìn)行評述。

1 地中海貧血產(chǎn)前基因診斷技術(shù)

地貧基因診斷經(jīng)過多年不斷地研究，已有多種成熟的分子檢測技術(shù)手段可應(yīng)用于臨床檢測。目前臨床上通過侵入性取材方式獲得胎兒樣本并進(jìn)行DNA提取，應(yīng)用多種基于PCR方法的分子檢測技術(shù)對胎兒DNA進(jìn)行α-或β-等珠蛋白基因突變的檢測以明確胎兒的基因型，防止重型β-地貧患兒的出生、給予地貧高風(fēng)險妊娠夫婦更多生下健康下一代的機(jī)會。

1.1 跨越斷裂點聚合酶鏈反應(yīng)（Gap-polymerase chain reaction，Gap-PCR）

Gap-PCR是一種簡便、快速、經(jīng)濟(jì)的檢測基因大片段缺失的方法。其原理是：于缺失序列的兩端設(shè)計一對引物，在正常序列中這對上下游引物間相距過遠(yuǎn)，以至超出有效擴(kuò)增范圍而不能生成擴(kuò)增產(chǎn)物。大片段缺失的存在會使斷端連接，上下游引物靠近，可以生成特定長度的擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物可通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。Gap-PCR方法的優(yōu)勢是可以建立多重檢測體系同時檢測多種大片段缺失類型，在多種缺失類型的共同區(qū)域可以設(shè)計一對內(nèi)對照引物以區(qū)分檢測到的缺失類型是雜合子、純合子或雙重雜合子。我國南方地區(qū)應(yīng)用這種多重Gap-PCR同時檢測多種缺失型 α-地貧包括-α3.7/、-α4.2/、--SEA/、--THAI/等［5-6］，以及2種中國人群中常見的以高Hb F為表型的大片段β-珠蛋白基因簇缺失突變包括中國型Gγ（+Aγδβ）0缺失和東南亞型HPFH缺失［7-8］。但是此種方法僅限于斷裂點已知的大片段缺失突變。

1.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-反向斑點雜交（polymerase chain reaction-reverse dot blot，PCR-RDB）

RDB技術(shù)是將待測突變位點的等位基因特異性寡核苷酸（allele-specific oligonucleotide，ASO）探針（包括野生型和突變型）固定在雜交膜上，根據(jù)野生型探針還是突變型探針與PCR擴(kuò)增靶序列DNA結(jié)合，以確定此樣本中該位點是否突變以及確定是純和還是雜合突變［9］。

該技術(shù)是當(dāng)前臨床所采用的常規(guī)檢測方法，在臨床實踐中已應(yīng)用20多年，可以在一個樣本中同時檢測多種突變類型，結(jié)果可靠、準(zhǔn)確性高。在我國南方常用于檢測南方人群常見的β-珠蛋白基因17種點突變類型以及α-珠蛋白基因3種點突變類型［10］。缺點是雜交操作過程繁復(fù)，耗時長，大批量檢測時保證檢測質(zhì)量有難度。

1.3 多重連接依賴性探針擴(kuò)增（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA）

當(dāng)懷疑樣本可能存在罕見大片段缺失突變，而缺失序列的斷裂點未知，不能應(yīng)用Gap-PCR方法檢測時，可以應(yīng)用MLPA技術(shù)。MLPA技術(shù)是設(shè)計多組專一的與目的序列互補(bǔ)的探針組，探針組范圍覆蓋整個目的序列。此技術(shù)的關(guān)鍵點是只有每對探針與目的序列完全互補(bǔ)雜交時，此對探針才可在連接酶作用下連接成為一條完整的核酸單鏈，之后再以連接完好的探針而不是目的序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增［11］。因每組探針長度不同，故其擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度也不同，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離，通過相關(guān)軟件分析目的序列與正常對照序列的產(chǎn)物峰高，并計算比值。

MLPA技術(shù)是單管一次性的進(jìn)行連接和PCR反應(yīng)，可以一次完成50個核苷酸序列的檢測。該方法可以對α、β珠蛋白基因簇進(jìn)行相對定量分析，雖然不能判斷確切的缺失類型，但能準(zhǔn)確反映整個α、β珠蛋白基因簇及其上下游調(diào)控序列的重復(fù)、缺失突變，以及α、β珠基因拷貝數(shù)的變化。此方法技術(shù)平臺建立要求略高，需自動測序儀進(jìn)行片段分析，并且對DNA質(zhì)量要求較高。近年來，多篇文獻(xiàn)報道應(yīng)用此技術(shù)確診了多例罕見α或β珠蛋白基因簇的缺失、重復(fù)或重排等突變類型的病例［12-14］，此技術(shù)作為傳統(tǒng)基因診斷技術(shù)的補(bǔ)充，可以提高產(chǎn)前基因診斷的準(zhǔn)確率。

1.4 珠蛋白基因測序（globin gene sequencing）

對于臨床表型和篩查結(jié)果提示疑為地貧基因突變攜帶者而已經(jīng)排除常見突變類型的樣本，提示此樣本可能存在罕見基因突變類型或尚未發(fā)現(xiàn)的新發(fā)突變類型，可以考慮對α-或β-珠蛋白基因進(jìn)行測序分析。目前臨床基因測序診斷主要是Sanger雙脫氧鏈終止法。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序除可檢測到常見類型的點突變外，還可檢測出不常見或者罕見類型的點突變、微缺失或者插入突變。當(dāng)血紅蛋白電泳分析提示有異常血紅蛋白區(qū)帶時，也可通過此方法進(jìn)行異常血紅蛋白的基因型精確診斷。珠蛋白基因測序既可以確定突變位點又可以確定突變類型，是突變驗證、確認(rèn)以及新基因突變鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。但此技術(shù)儀器成本昂貴，操作步驟繁瑣，需專業(yè)人員判讀結(jié)果，這些不足極大地限制了其在臨床診斷中的大范圍應(yīng)用。

1.5 擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）

點突變類型的檢測除了可以采用RDB等方法外，也可以采用ARMS法，也稱為等位基因特異性PCR（allele specific PCR，AS-PCR）。這是一種通過設(shè)計3’-端堿基特異性引物來檢測DNA序列已知點突變的方法。針對已知突變，同時設(shè)計野生和突變序列的2條引物，它們分別與一條共同引物配對。這2條引物的3’-端堿基是分別與野生和突變序列特異性互補(bǔ)，因PCR對引物3’-端與模板的互補(bǔ)性要求較高，所以野生序列引物與野生序列模板互補(bǔ)，突變序列引物與突變序列模板互補(bǔ)［15］。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分析。若只有野生引物擴(kuò)增，則提示無相應(yīng)突變；若野生和突變引物均擴(kuò)增，則提示為突變雜合子；若只有突變引物擴(kuò)增，則提示為突變純合子。

此技術(shù)因快速簡便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點，已在一些國家或地區(qū)在多種遺傳病及多態(tài)分析中推廣應(yīng)用［16-17］。其缺點是不能一次性同時檢測過多突變位點，所以仍不能代替RDB方法在臨床α-或β-珠蛋白基因點突變類型的檢測。

1.6 高分辨率熔解曲線（high-resolution melting analysis，HRMA）

HRMA技術(shù)是近年來興起的一種用于突變篩查和基因分型的新型遺傳學(xué)分析技術(shù)。該技術(shù)是在實時熒光PCR反應(yīng)前將飽和熒光染料加入反應(yīng)體系中，PCR反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物直接運行高分辨率熔解，根據(jù)熒光信號變化繪制出不同形狀的溫度熔解曲線，以此區(qū)分不同基因型［18］。HRMA技術(shù)高特異性、高靈敏度、高通量、高重復(fù)性和低成本的特點，使該技術(shù)已廣泛用于基因分析、突變篩查、人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antige，HLA）配型以及甲基化分析等。

近年來國內(nèi)外多項研究將HRMA技術(shù)應(yīng)用于β-地貧的基因診斷及產(chǎn)前基因診斷［19-21］，與傳統(tǒng)的RDB方法相比較，HRMA技術(shù)具有操作簡便快捷大大縮短產(chǎn)前診斷時間、真正的閉管操作避免污染以及結(jié)果判讀簡易等突出優(yōu)勢［21］。

1.7 液相芯片技術(shù)（suspension array）

液相芯片技術(shù)也稱懸浮陣列技術(shù)（suspension array），本中心自主發(fā)明設(shè)計了一種基于液相芯片系統(tǒng)診斷地貧的試劑盒并已應(yīng)用于臨床［22］。此發(fā)明針對常見的23種α-和β-珠蛋白基因突變類型設(shè)計探針并分別與不同顏色的熒光編碼微球交聯(lián)混合后，制備成用于檢測的液相芯片系統(tǒng)。將利用特異性引物擴(kuò)增后得到的PCR產(chǎn)物與液相芯片進(jìn)行雜交，用藻紅蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，通過液相芯片檢測儀讀取結(jié)果。此技術(shù)極大地縮短了地貧的檢測時間，具有高通量、自動化、高靈敏度和靈活等特點，尤其適用于大樣本量的實驗室檢測。

1.8 母體細(xì)胞污染（maternal cell contamination，MCC）分析技術(shù)

應(yīng)用分子檢測技術(shù)手段對侵入性取材獲得的胎兒標(biāo)本進(jìn)行檢測時，因取材過程中可能附帶的母親外周血或蛻膜組織等會造成不同程度的MCC，對產(chǎn)前基因診斷的結(jié)果有誤診的風(fēng)險。隨著高敏感性PCR擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，微量的MCC即可導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果而造成誤診。因此，常規(guī)建議對進(jìn)行單基因遺傳病基因診斷的同一份胎兒樣本要進(jìn)行MCC分析，并且母親標(biāo)本（一般為外周血）需平行分析以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性［23］。

在選擇MCC檢測方法時，可以通過混合母體和胎兒DNA建立多種濃度MCC梯度模型。原則上建議所選用的MCC分析方法可以檢測到最低10%濃度MCC［24］。目前，臨床主要檢測MCC的方法是選取人類不同染色體上的多個短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR），對這些多態(tài)位點進(jìn)行熒光定量PCR（quantitative fluorescent PCR，QFPCR）擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物通過毛細(xì)管電泳分離，此方法可以檢測到最低5%MCC［25］。理想的MCC分析方法對于產(chǎn)前基因診斷方法應(yīng)該具有相等或者更高的敏感性，在地貧的產(chǎn)前基因診斷中，常規(guī)的RDB技術(shù)敏感性高于QF-PCR技術(shù)，當(dāng)RDB結(jié)果提示某些胎兒樣本有極微量MCC而QF-PCR結(jié)果未提示時，這種情況下建議更換另外的基因診斷方法以確認(rèn)基因型結(jié)果［23］。針對這個問題，本中心最近的一項研究［26］通過建立MCC程度梯度模型，初步建立了微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，DD-PCR）技術(shù)鑒定產(chǎn)前診斷樣本MCC的方法。研究結(jié)果顯示，在反應(yīng)條件一致的情況下，DD-PCR技術(shù)可檢測到低至1.562 5%的MCC，而QF-PCR可檢測到最低6.25%MCC，說明與傳統(tǒng)技術(shù)比較，檢測極微量MCC樣本，DD-PCR技術(shù)具有更高的敏感性。此外，因MLPA技術(shù)可對靶序列的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行相對定量分析，因此在一定程度上可以甄別微量外源污染。陳亞軍等［27］利用MLPA檢測出樣本的α1和α2基因的相對定量值判斷出拷貝數(shù)，可以解決一些GAP-PCR法檢測結(jié)果矛盾或無法確診的病例確診基因型。說明GAP-PCR法聯(lián)合α-珠蛋白基因MLPA法檢測α-地貧基因缺失，在一定程度上可以有效排除產(chǎn)前診斷胎兒標(biāo)本的外源或母源污染影響，防止誤診。

2 展望

除母體細(xì)胞污染導(dǎo)致的基因型誤診風(fēng)險，侵入性手術(shù)取材方式還有一定的流產(chǎn)和宮內(nèi)感染風(fēng)險，所以尋找安全、無創(chuàng)、準(zhǔn)確、簡便的早期基因診斷方法一直是地貧產(chǎn)前基因診斷的熱門研究方向。近年，通過分離孕婦外周血漿中胎兒游離DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）而實現(xiàn)的NIPT成為國內(nèi)外研究的熱點領(lǐng)域，為地貧的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷提供了新的思路。該技術(shù)已在檢測性別決定基因（sex-detemining region Y，SRY）以排除X連鎖遺傳病、RH血型分析和染色體非整倍體的診斷等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用［28］。目前，NIPT在地貧產(chǎn)前診斷的研究方向主要包括排除性診斷和確定性診斷。

2.1 排除性診斷

排除性診斷都是通過檢測父源性突變位點，如父母雙方攜帶不同突變，則通過父源性突變位點陰性結(jié)果就可以排除胎兒純合子的可能，其基因型只有母源性突變位點雜合子或野生純合子2種可能。此種方法診斷相對簡單，Chiu等［29］和Li等［30］報道的β-地貧無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷采用了此種方法。如父母雙方攜帶同型突變，則需要借助區(qū)分父母的與致病突變連鎖的STR/SNP位點，以此排除父源性突變［31］。利用東南亞型α-地貧（--SEA/）缺失范圍內(nèi)STR或SNPs位點排除父源性水腫胎的多個研究證實了此種方法診斷率受STR或SNPs位點位置和數(shù)量的影響較大［32-33］。Chan等［34］也將這種方法應(yīng)用于中國南方人群β-地貧的產(chǎn)前診斷。但這類研究方向需要建立一組與致病突變連鎖的有診斷價值的SNPs數(shù)據(jù)庫，且未對母源性突變位點進(jìn)行分析，所以臨床應(yīng)用受到很大限制。

2.2 確定性診斷

確定性診斷指的是基于SNP位點或單體型的相對含量計算。應(yīng)用數(shù)字PCR（digital PCR，DPCR）技術(shù)對母體血漿總游離DNA進(jìn)行含SNP位點目的序列的定量擴(kuò)增，再應(yīng)用相對突變劑量（relative mutation dosage，RMD）方 法 進(jìn) 行 分析［35］。此方法尤其適用于父母雙方攜帶同型突變的常染色體隱性遺傳病，在β-地貧的無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷方面也有相關(guān)研究報道［36］。隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，采用二代測序技術(shù)進(jìn)行全基因組水平的高通量測序，可以一次性完成所需序列信息的采集，然后用相對單體型劑量（relative haplotype dosage，RHDO）分析法對孕婦血漿中單體型的相對含量進(jìn)行計算［36］。這些后續(xù)研究極大地推動了NIPT在地貧產(chǎn)前基因診斷方面的應(yīng)用。但二代測序技術(shù)成本昂貴、cffDNA含量較低導(dǎo)致擴(kuò)增效率低、數(shù)據(jù)分析方法復(fù)雜等問題使NIPT在地貧產(chǎn)前診斷方面還無法付諸臨床實踐。

理想的產(chǎn)前診斷方法需要診斷精確，保證母胎安全以及具備廣泛的應(yīng)用性。目前地貧產(chǎn)前基因診斷仍然要依賴基于侵入性取材的基因技術(shù)手段進(jìn)行檢測。因地貧基因突變類型的多樣性和復(fù)雜性，在保證排除母體細(xì)胞污染的前提下，應(yīng)該采用多種檢測方法相輔相成，以確保診斷的精確性。無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的安全性和早期診斷的特點，使其成為地貧產(chǎn)前診斷未來的重要發(fā)展方向。隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新和完善，希望地貧無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷能盡早地應(yīng)用于臨床。

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The clinical applications of prenatal genetic diagnosis for thalassemia

QIN Danqing1，2，HE Tianwen1，2，YIN Aihua1，2
（1.Medical Genetics Center of Guangdong Women and Children Hospital，Guangzhou，Guangdong，China，511442； 2.Maternal and Children Metabolic-Genetic Key Laboratory of Guangdong， Guangzhou，Guangdong，China，511442）

Thalassemia is one of the most common monogenic inherited diseases,with the highest prevalence in the world.Due to the lack of an ideal treatment,currently the first-choice method is the prevention of births of children with severe cases as detected by prenatal genetic diagnosis for high-risk couples in high-prevalence areas.Currently,the widely used invasive operation used to obtain fetal genetic material for genetic diagnosis has the risk of miscarriage or intrauterine infection.Since the cell-free fetal DNA-based noninvasive prenatal diagnosis technology has been rapidly developed,it is likely to establish a safe,rapid,simple and accurate method for early prenatal diagnosis of thalassemia in future.In this review,the applications of the molecular tests currently used for prenatal genetic diagnosis of thalassemia are briefly reviewed.

Thalassemia;Prenatal genetic diagnosis;Molecular test;Non-invasive prenatal diagnosis

國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFC1000703）

1.廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東，廣州511442

2.廣東省婦幼代謝與遺傳病醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣東，廣州511442

尹愛華，E-mail：yinaiwa@126.com