周秀敏，李強(qiáng)子，畢英杰，任衛(wèi)合，張麗

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030）

荷斯坦牛LF基因5’UTR區(qū)多態(tài)性分析

周秀敏，李強(qiáng)子，畢英杰，任衛(wèi)合，張麗

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030）

本研究采用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)303頭奶牛的乳鐵蛋白基因5’UTR區(qū)進(jìn)行遺傳多態(tài)性檢測(cè)，以確定其等位基因數(shù)以及核苷酸變異位點(diǎn)，探討其遺傳特性結(jié)果表明，LF基因在擴(kuò)增區(qū)域的64bp處發(fā)生G→C的突變，形成AA、AB、BB三種基因型，其基因型頻率分別為0.2541、0.4455和0.3004，等位基因A和B的頻率分別為0.4796和0.5231。群體遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)荷斯坦牛LF基因的有效等位基因數(shù)(Ne)、遺傳雜合度(He)和多態(tài)信息含量（PIC）分別是0.4989、0.4455和0.3745。經(jīng)卡方適合性檢驗(yàn)表明該群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。中國(guó)荷斯坦牛LF基因5’UTR區(qū)的多態(tài)性相對(duì)較高，遺傳變異相對(duì)較大，提示該位點(diǎn)有望作為荷斯坦牛乳腺炎抗病育種的標(biāo)記位點(diǎn)之一。

荷斯坦牛；LF基因；PCR-SSCP；遺傳多態(tài)性

乳鐵蛋白( Lactoferrin, LF)作為轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的成員，不僅具有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)、抗病毒、免疫調(diào)控的作用[1～3]，同時(shí)還能刺激免疫應(yīng)答及溶菌酶再生等生理功能[4]。LF基因被定位于牛的第22號(hào)染色體上，包括17個(gè)外顯子和16個(gè)內(nèi)含子[5]。近年來大量學(xué)者對(duì)荷斯坦牛乳鐵蛋白及其編碼基因進(jìn)行了研究。Sordillo等[6]研究發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白的濃度是可遺傳的。Molenaar等[7]表明LF基因的表達(dá)與炎癥反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。Dinesh[8]等發(fā)現(xiàn)摩拉水牛LF基因第7外顯子上存在的SNPs與乳腺炎顯著相關(guān)；Carvajal等[9]報(bào)道LF基因啟動(dòng)子區(qū)c.-28A＞C 突變位點(diǎn)與乳腺炎抗性相關(guān)；Singh等[10]發(fā)現(xiàn)，在瘤牛LF基因上的g.31566A＞T、g.31649A＞C和g.31566A＞T三個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)SCC的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）；陳仁金等[11]報(bào)道，在LF基因外顯子1發(fā)現(xiàn)的c.63C＞G突變與乳腺炎抗性相關(guān)。

本研究通過PCR-SSCP技術(shù)對(duì)荷斯坦牛LF基因5’UTR區(qū)進(jìn)行了多態(tài)性分析，旨在豐富荷斯坦牛乳鐵蛋白基因庫，并為有關(guān)抗病性基因的篩選提供分子理論資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及基因組DNA提取

試驗(yàn)所用血樣采自寧夏賀蘭山奶業(yè)有限公司的303頭荷斯坦牛，用醫(yī)用采血管尾靜脈采血10mL，-20℃保存。采用試劑盒法從凍存牛血中提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

根據(jù)牛已知的L F基因序列（G e n B a n k no.∶ AY319306），應(yīng)用Primer6.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，用于擴(kuò)增荷斯坦牛L F基因5’U T R區(qū)。其上下游引物序列分別為：5’-TGGATAAAGGGACGCAGAACG-3’，5’-CACTGAGGGGTGAGGGGACT-3’，該引物由大連寶生物公司合成。PCR擴(kuò)增體系總體積為20μL：基因組DNA模板2μL，上下游引物各1μL，Taq PCR MasterMix 10μL，ddH2O 6μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存，并用1%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 SSCP分析與等位基因序列的回收測(cè)定

取3μL的PCR產(chǎn)物，加入7μL變性上樣緩沖液（0.025%溴酚藍(lán)、98%去離子甲酰胺、10mmol/L EDTA、0.025%二甲苯氰），98℃變性10min后再立即冰浴10min。將變性后的PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣至10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上（Acr∶Scr=39∶1），160V電壓室溫電泳2～3h。結(jié)束后用銀染法染色，確定PCR產(chǎn)物的基因型。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過SSCP確定基因型后，純合子PCR產(chǎn)物用試劑盒回收后直接送北京華大公司測(cè)序。而雜合子個(gè)體則參照Hu等[12]介紹的方法進(jìn)行處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用Popgene32軟件計(jì)算出LF基因不同突變位點(diǎn)的等位基因頻率、基因型頻率、有效等位基因數(shù)(Ne)、遺傳雜合度(He)和多態(tài)信息含量（PIC），并對(duì)該位點(diǎn)基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)及核苷酸序列的比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 荷斯坦牛LF 基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)303頭荷斯坦牛的DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠（100V，30min）電泳檢測(cè)后均得到一條如圖1所示的特異性好、條帶清晰、長(zhǎng)度約為215bp的PCR產(chǎn)物，且與預(yù)期的目的片段大小一致，可用于SSCP檢測(cè)。

圖1 荷斯坦牛LF基因5’UTR 區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

2.2 PCR-SSCP檢測(cè)及序列測(cè)定結(jié)果

荷斯坦LF基因5’UTR區(qū)序列區(qū)域共檢測(cè)到2種等位基因A和B，共形成AA、BB、AB三種基因型（圖2），其中等位基因A和B均具有純合型個(gè)體。PCR產(chǎn)物純化克隆后的測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為215bp，在GenBank中基因引物擴(kuò)增區(qū)域核苷酸序列與荷斯坦牛LF基因序列的同源性在97%以上，表明擴(kuò)增產(chǎn)物的確為荷斯坦牛LF基因。與普通牛LF 基因（GenBank no. AY319306）序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)在擴(kuò)增區(qū)域的64bp處發(fā)生了一個(gè)G→C的堿基突變（圖3）。

圖2 荷斯坦牛LF基因5’UTR區(qū) PCR產(chǎn)物SSCP檢測(cè)結(jié)果

圖3 荷斯坦牛和普通牛LF基因5’UTR區(qū)等位基因序列比對(duì)

2.3 遺傳參數(shù)分析

荷斯坦牛LF基因5’UTR區(qū)基因型頻率、基因頻率以及各遺傳多態(tài)性指標(biāo)見表1和表2。等位基因A和B的頻率分別為0.4769和0.5231，AA、BB和AB基因型的頻率分別為0.2541、 0.3004和0.4455。本研究中，荷斯坦牛LF基因的有效等位基因數(shù)(Ne)、遺傳雜合度(He)和多態(tài)信息含量（PIC）分別是0.4989、0.4455和0.3745。0.25＜PIC≤0.5屬于中度多態(tài)，說明該位點(diǎn)遺傳多態(tài)性較豐富。經(jīng)χ2適合性檢測(cè)表明，荷斯坦牛在該位點(diǎn)未偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

表1 荷斯坦牛LF 基因5’UTR區(qū)的基因型頻率和等位基因頻率

表2 荷斯坦牛LF 基因5’UTR區(qū)遺傳多態(tài)性分析

3 討論

有關(guān)荷斯坦牛LF基因多態(tài)性的研究報(bào)道頗多。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)LF基因c.+33C＞A、c.-28C＞A、c.-810C＞T、c.-838G＞T、c.-926G＞A、c.-915T＞G、c.460G＞C、c.1062G＞T、c.1119C＞T、c.1176T＞C、c.1889T＞C共11個(gè)SNPs，其研究結(jié)果與Seyfert. H[14]研究報(bào)道的基本一致。李國(guó)華等[15]在外顯子7和12上沒有發(fā)現(xiàn)SNPs，而Dinesh[8]在水牛LF基因外顯子7和12上發(fā)現(xiàn)2個(gè)SNPs。Kaminski等[16]發(fā)現(xiàn)LF基因上存在與Li[13]相同的c.+33C＞A位點(diǎn)；郭亮等[17]在荷斯坦牛LF基因上共檢測(cè)到6個(gè)SNPs，其中c.+33C＞A、c.-926G＞A、c.-28C＞A與 Li[13]研究結(jié)果一致，c.-945G＞A、c.439A＞G，c.1889T＞C為3個(gè)新發(fā)現(xiàn)的SNPs。Kathiravan等[18]在水牛LF基因檢測(cè)到c.1437G＞A、c.1298G＞A 2個(gè)SNPs。本研究通過對(duì)寧夏荷斯坦牛LF基因5’UTR區(qū)遺傳多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段64bp處發(fā)生G→C的突變，但是在其外顯子1上并未發(fā)現(xiàn)陳仁金[11]的c.63C＞G突變位點(diǎn)，這可能是由于所研究荷斯坦牛群體的遺傳背景和基因與環(huán)境相互作用不同而造成的差異。

本研究通過對(duì)荷斯坦牛LF基因5’UTR區(qū)進(jìn)行的遺傳多態(tài)性分析結(jié)果表明，該群體未偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05），PIC介于0.25～0.5之間，表現(xiàn)為中度多態(tài)，這極可能是選擇壓造成的。由此看出荷斯坦牛群體在此位點(diǎn)的多態(tài)性相對(duì)較高，遺傳變異相對(duì)較大，提示該位點(diǎn)有望作為荷斯坦牛乳腺炎抗病育種的標(biāo)記位點(diǎn)之一。

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Polymorphism Analysis of LF Gene 5’UTR Region in Holstein Cattle

ZHOU Xiu-min, LI Qiang-zi, BI Ying-jie, REN Wei-he, ZHANG Li
(College of Life Science and Engineering, Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030)

Polymorphism,allele number,nucleotide polymorphism sites and amino acid polymorphism sites of LF gene 5’UTR region in 303 Holstein cows were studied. Polymorphisms of LF gene 5’UTR region were detected by polymerase chainreaction-single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP) . The results showed that LF gene was identifted of having a G to C mutation at position 64. Three genotypes were found and genotypic frequencies of AA , AB and BB were 0.2541、0.4455 and 03004, erspectively. The allele frequencies of A and B were 0.4796 and 0.5231.Chi-square test Indicated that the polymorphic locus in Chinese Holstein cattle population ftted Hardy-Weinberg equilibrium(P＞0.05). The fnding showed that polymorphism of LF gene 5’UTR region in Holstein cattle was medium, it was expected to be a marker for anti-mastitis disease breeding in Holstein cattle.

Holstein cattle; LF gene; PCR-SSCP;Polymorphism

S823.3

A

1004-4264（2017）03-0013-03

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.03.004

2016-10-31

西北民族大學(xué)引進(jìn)人才科研項(xiàng)目（xbmuyjrc201316），西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院眾創(chuàng)空間扶持項(xiàng)目。

周秀敏（1996-），女，江蘇鹽城人，在讀本科生。

張麗。