邵維在，段治尚，萬(wàn)德生，闕玉玲，周永斌

（云南騰藥制藥股份有限公司研發(fā)部，云南騰沖679100）

清肺抑火片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

邵維在，段治尚，萬(wàn)德生，闕玉玲，周永斌

（云南騰藥制藥股份有限公司研發(fā)部，云南騰沖679100）

目的：修訂提高清肺抑火片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用顯微鑒別法、薄層色譜（TLC）法對(duì)制劑中的大黃、桔梗、黃柏、苦參進(jìn)行定性鑒別；采用HPLC法對(duì)黃芩中的黃芩苷進(jìn)行定量分析，色譜柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 m）；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸溶液（53：47）；流速：0.6 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30℃。結(jié)果：在顯微鑒別中檢出草酸鈣簇晶大，直徑60~ 140 μm（大黃）、菊糖扇形或類(lèi)圓形（桔梗）；在TLC色譜中檢出大黃、黃柏、苦參；黃芩苷進(jìn)樣量在0.025~4.000 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，r=0.999 8；平均加樣回收率99.8%，RSD=0.34%（n=9）。結(jié)論：所建立的方法可靠、準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng)，可控制該制劑的質(zhì)量。

清肺抑火片；顯微；薄層色譜；高效液相色譜；黃芩苷

清肺抑火片為云南騰藥制藥股份有限公司的普藥大品種，源于1963年版《中國(guó)藥典》“清肺抑火丸”〔1〕處方增加片劑規(guī)格申報(bào)生產(chǎn)，由黃芩、梔子、黃柏、大黃、苦參、天花粉、知母、桔梗、前胡共9味藥組成，現(xiàn)行版標(biāo)準(zhǔn)收載于《部頒標(biāo)準(zhǔn)》第二冊(cè)〔2〕。具有清肺止嗽，降火生津。用于治療肺熱咳嗽，痰延壅盛，口鼻生瘡，牙根出血，牙齒疼痛，咽喉腫痛，小便赤黃，大便干燥等癥狀?，F(xiàn)在執(zhí)行的“清肺抑火片”質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)偏低，為控制其產(chǎn)品質(zhì)量，筆者采用顯微鑒別、薄層鑒別對(duì)方中大黃、桔梗、黃柏、苦參進(jìn)行鑒別；采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)黃芩所含主要成分黃芩苷的含量進(jìn)行定量測(cè)定?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與試藥

雙目生物顯微鏡XSP-18B（南京江南光電股份有限公司）；三用紫外儀ZF-2型（上海市安亭電子儀器廠）；美國(guó)Agilent-1100液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；UV1700紫外分光光度計(jì)（島津蘇州有限公司）；用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；SK5200H型超聲儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；電子分析天平AE240（梅特勒托利多儀器上海有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋DRHH-S4（上海雙捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；大黃對(duì)照藥材（批號(hào)：120902-201010）；鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713-201212）；苦參堿對(duì)照品（批號(hào)：110805-200508）；黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-201117，供含量測(cè)定用）；上述所用的對(duì)照品均購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)食品藥品檢定研究院〔3〕。清肺抑火片（批號(hào)：120437、120438、120439）由云南騰藥制藥股份有限公司生產(chǎn)；HPLC用甲醇為色譜純，水為娃哈哈飲用純凈水（大理娃哈哈食品有限公司制造），其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1大黃、桔梗顯微鑒別取本品，置顯微鏡下觀察：草酸鈣簇晶大，直徑60~140 μm（大黃），菊糖扇形或類(lèi)圓形（桔梗）〔4〕。見(jiàn)圖1。

圖1 大黃、桔梗顯微圖

2.2大黃的薄層鑒別取本品適量于乳缽中研細(xì)，稱(chēng)取0.6 g置150 mL平底燒瓶中，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，放冷，濾過(guò)，濾液置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，再加鹽酸1 mL，轉(zhuǎn)移至三角燒瓶中，于水浴上加熱回流30 min，立即冷卻，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中加乙醚震搖提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得供試品溶液。另取不含大黃的陰性對(duì)照品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。再取大黃對(duì)照藥材0.5 g，按照上述方法制備對(duì)照藥材溶液〔4〕。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板（羧甲基纖維素鈉為黏合劑）上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15：5：1）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色熒光主斑點(diǎn)，置氨蒸氣中熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榧t色。陰性對(duì)照品無(wú)干擾，具有專(zhuān)屬性，見(jiàn)圖2～3。

圖2 大黃紫外光燈（365 nm）TLC圖

圖3 大黃氨蒸氣熏TLC圖

2.3黃柏薄層鑒別取本品適量于乳缽中研細(xì)，稱(chēng)取1.2 g置150 mL平底燒瓶中，滴加氨溶液5 mL充分濕潤(rùn)，加二氯甲烷30 mL，超聲處理15 min，濾過(guò)，濾液置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得供試品溶液。另取不含黃柏的陰性對(duì)照品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。再取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液〔4〕。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》附錄VI B）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液、對(duì)照品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上（以羧甲基纖維素鈉溶液為黏合劑），以正丁醇-冰乙酸-水（7：1：2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。陰性對(duì)照品無(wú)干擾，具有專(zhuān)屬性，見(jiàn)圖4。

圖4 黃柏紫外光燈（365 nm）TLC圖

2.4苦參薄層鑒別供試品溶液的制備：取“2.3”項(xiàng)下的供試品溶液，作為苦參薄層鑒別項(xiàng)的供試品溶液。另取不含苦參的陰性供試品，按上述“2.3”項(xiàng)方法，同法制備陰性對(duì)照品溶液。再取苦參堿對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中國(guó)藥典》附錄VI B）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液、對(duì)照品溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板薄層板上（以2%的氫氧化鈉溶液制備），以甲苯-丙酮-甲醇（8：3：0.5）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀試液〔4-5〕。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性對(duì)照品無(wú)干擾，具有專(zhuān)屬性，見(jiàn)圖5。

圖5 苦參TLC圖

2.5黃芩苷的含量測(cè)定方法與結(jié)果

2.5.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性色譜柱：Agilent TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；甲醇-0.4%磷酸溶液（53：47）為流動(dòng)相；流速：0.6 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30℃。進(jìn)樣量：10 μL；理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000〔4，6-7〕。

色譜條件選擇：以流動(dòng)相為溶劑配制的對(duì)照品溶液，測(cè)定其紫外吸收光譜，從圖6中看出，黃芩苷有兩個(gè)最大吸收峰，第一個(gè)吸收峰與溶劑的最大吸收峰比較接近，第二個(gè)最大吸收峰波長(zhǎng)為277.7 nm，參照中國(guó)藥典“黃芩”項(xiàng)下的條件，確定280 nm波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。見(jiàn)圖6。

圖6 黃芩甘紫外光譜吸收?qǐng)D

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取黃芩苷對(duì)照品適量，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL含25 μg的對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

2.5.3 供試品溶液的制備取本品20片，研細(xì)，取粉末約0.5g，精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，加甲醇約30 mL，超聲處理30 min，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，作為供試品溶液，即得〔4〕。

2.5.4 缺黃芩陰性樣品的制備按處方比例，稱(chēng)取除黃芩外的其余藥材，制備缺黃芩陰性對(duì)照品，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制備缺黃芩的陰性對(duì)照溶液。其在與黃芩苷對(duì)照品色譜圖中相同的保留時(shí)間處無(wú)吸收峰，表明陰性對(duì)照品無(wú)干擾，見(jiàn)圖7。

圖7 清肺抑火片HPLC圖

2.5.5 線(xiàn)性關(guān)系考察精密稱(chēng)取對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含黃芩苷2.5、5、10、25、50、100、150、200、400 μg的溶液，測(cè)定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程：Y＝77.088 321 4X-38.857 937（r＝0.999 8），理論板數(shù)平均為9 360。結(jié)果表明黃芩苷在0.025～4.000 μg之間與峰面積呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

2.5.6 精密度試驗(yàn)精密吸取清肺抑火片（批號(hào)：120437）的供試品溶液10 μL，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果，RSD=0.33%（n=6），表明本方法精密度較好。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液（批號(hào)：120437），分別于0、2、4、6、8、12、24 h按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣1次，測(cè)定峰面積。結(jié)果，RSD=1.34%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)峰面積基本穩(wěn)定。

2.5.8 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品，分別精密稱(chēng)取0.5、0.6、0.7 g各3份，按“2.5.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，并按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定其黃芩苷含量。結(jié)果，RSD=0.02%（n=9），結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.9 加樣回收率試驗(yàn)取已測(cè)定含量的同一批（批號(hào)：120437，含黃芩苷約10.4 mg/份）樣品9份，每份約0.5 g，精密稱(chēng)定，精密加入一定量的對(duì)照品（含黃芩苷：1.00 mg/mL）8、10、12 mL，按供試品溶液的制備方法處理，依法測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，見(jiàn)表1。

表1加樣回收測(cè)定結(jié)果

2.5.10 樣品含量測(cè)定依法對(duì)3批樣品（120437、120438、120439）進(jìn)行含量測(cè)定，見(jiàn)表2。

表2 3批樣品含量測(cè)定

3 結(jié)論

清肺抑火片是我企業(yè)常年生產(chǎn)的品種，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較低，沒(méi)有鑒別項(xiàng)及含量測(cè)定項(xiàng)。為了能更全面的控制清肺抑火片的質(zhì)量，我們?cè)黾狱S芩苷含量測(cè)定，大黃、黃柏、苦參薄層鑒別，及大黃、桔梗顯微鑒別。黃芩是本品君藥，清熱燥濕，瀉火解毒，其黃芩苷含量是評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，故選作含量測(cè)定指標(biāo)。大黃、桔梗是藥品中以藥粉投料的兩味藥材，故建立顯微鑒別項(xiàng)。其次是大黃、黃柏、苦參定性鑒別方法成熟，專(zhuān)屬性強(qiáng)，故建立薄層鑒別項(xiàng)。

〔1〕國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)臨床用藥須知（2010年版）：化學(xué)藥和生物制品卷〔M〕.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2011.

〔2〕衛(wèi)生部.中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，1964.

〔3〕苗明三，李振國(guó).現(xiàn)代實(shí)用中藥質(zhì)量控制技術(shù)〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2000：89.

〔4〕國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部〔S〕.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：22-287.

〔5〕韓頌，于喜水，趙敏.苦參藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究〔J〕.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2009，37（2）：40-42.

〔6〕李曉梅，趙琪鐘，衛(wèi)舒帆.HPLC法測(cè)定清肺抑火片中黃芩苷的含量〔J〕.中國(guó)藥師，2007，10（4）：358-359.

〔7〕李應(yīng)芬，李照宏，朱正華.清肺抑火片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究〔J〕.中成藥，2008，30（2）：301-302.

Study on the Quality Standard of Qingfei Yihuo Tablet

Shao Weizai,Duan Zhishang,Wan Desheng,Que Yuling,Zhou Yongbin
（The Research and Development Department,Yunnan Tengyao Pharmaceutical Co.,Ltd.,Tengchong,Yunnan 679100,China）

Objective:To develop a method for revising and improving the quality standards of the Qingfei Yihuo Tablet.Methods:Microscopic identification and TLC method were adopted to identify the quality of the Dahuang,Jugeng,Huangbo and Kusheng in preparation and analyzing the Huangqigan in Huangqi by the method of HPLC.The analysis was performed on an Agilent TC-C18column with the mobile phase consisting of methanol（A）?0.4%phosphate acid（53：47）by gradient elution at a flow rate of 0.6 mL/min.The detection wavelength was set at 280 nm and the column temperature was 30℃.Results:Calcium oxalate crystal clusters were checked out by the method of microscopic identification,the diameter of Dahuang was 60-140 microns and the shape of Jugeng was inulin fan or quasi-circular.Additional,Dahuang,Huangbo and Kusheng were detected out by the methods of TLC and the HPLC results showed that the linear ranges were 0.025-4.000 μg/mL（r=0.999 8）for Huangqigan.The average recoveries（n=9）were 99.8%,RSD=0.34%.Conclusion:The developed method is accurate,reproducible and specific and the quality of the preparation can be controlled.

Qingfei Yihuo Tablet;microscopic identification;TLC;HPLC;Huangqigan

R284.1

A

2096-2266（2017）02-0020-04

10.3969/j.issn.2096-2266.2017.02.004

（責(zé)任編輯 李楊）

2015-06-16

2015-10-10

邵維在，工程師，主要從事中藥新產(chǎn)品研發(fā)、產(chǎn)品工藝優(yōu)化、中藥治療標(biāo)準(zhǔn)研究.