謝 斌，李學(xué)坤，郭慧輝

（1.陜西省西安植物園，陜西省植物研究所，陜西西安710061；2.西安文理學(xué)院，陜西西安710065）

響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取甘草渣中甘草總黃酮工藝研究*

謝 斌1*，李學(xué)坤2，郭慧輝2

（1.陜西省西安植物園，陜西省植物研究所，陜西西安710061；2.西安文理學(xué)院，陜西西安710065）

以甘草渣為實(shí)驗(yàn)材料，研究并優(yōu)化利用超聲輔助提取甘草渣中甘草總黃酮的提取工藝。以得率為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法優(yōu)選最佳提取工藝。結(jié)果表明：最優(yōu)提取條件為藥材粉末加37倍量體積分?jǐn)?shù)為67%的乙醇溶液，超聲提取1.2h，甘草總黃酮得率為0.933%。優(yōu)選所得的工藝穩(wěn)定可行，可作為甘草總黃酮的提取工藝。

甘草渣；甘草總黃酮；提取工藝；響應(yīng)面法

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）是中國傳統(tǒng)中藥的一種，因其味甘、性平，調(diào)和諸藥并且可以解毒，享有“中藥之王”的美譽(yù)[1]。甘草酸是從甘草水提物中分離出來的，用作甜味劑。甘草渣是大多數(shù)甘草加工企業(yè)提取甘草中的甘草酸后產(chǎn)生的廢棄物，甘草渣中還含有大量脂溶性的甘草黃酮。甘草黃酮是甘草中的主要成分之一，其具有良好的藥理活性，用于化妝品業(yè)，具有抗衰老作用和抗艾滋病病毒作用[2]。目前，對于甘草黃酮提取分離的研究大多是對新鮮采集的甘草原材料，往往忽視了甘草在提取甘草酸后產(chǎn)生的廢渣，導(dǎo)致了較嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。對于日益高漲的市場需求而言，從甘草渣中提取分離甘草黃酮是對直接從甘草原料中獲得甘草黃酮的補(bǔ)充和加強(qiáng)。

響應(yīng)面法在小區(qū)域內(nèi)用簡單的多元二次回歸方程建立關(guān)于因素與影響值的函數(shù)關(guān)系[3]，通過響應(yīng)面分析法可以找到最佳點(diǎn)，并靈敏考察各因素之間的交互作用[4]，具有試驗(yàn)周期短、回歸方程精度高等優(yōu)點(diǎn)[5]。本文對甘草渣中甘草總黃酮的提取條件進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化，對乙醇的體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間以及液固比這些提取條件做了系統(tǒng)的研究，對上述提取條件實(shí)現(xiàn)了優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及藥品

雙光紫外可見分光光度計(jì)（UV2550，島津）；超聲波清洗儀（SQ-250DE型，昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV10，IKA）。

無水乙醇（市售分析純）、蘆丁對照品（ARO，Sigma）；

甘草藥材采自新疆阿克蘇地區(qū)。洗凈，50℃干燥后用萬能粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，除去其中甘草酸，過濾、烘干、放置于干燥器中備用。

1.2 方法

1.2.1 甘草總黃酮的紫外分光光度法測定本實(shí)驗(yàn)甘草總黃酮含量采用NaNO2-Al（NO3）3比色法在選定波長360nm處進(jìn)行測定[6]。對不同濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品測定其吸光度，得到吸光度Y與蘆丁含量X（mg·mL-1）間的回歸方程Y=14.435X+0.0525，R2=0.981，在0.004～0.02mg·mL-1范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系[7]。

圖1 蘆丁和甘草黃酮的最大吸收波長Fig.1 Maximum absorption wavelength of rutin and flavonoids

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of rutin

取配制好的樣品溶液，在選定波長360 nm處測定吸光度（參比溶液為空白），代入回歸方程中求甘草渣中黃酮類物質(zhì)的含量（質(zhì)量濃度），計(jì)算甘草渣中黃酮類物質(zhì)的得率[8]：

W=（C×F×V）/m×100%

式中W：總黃酮含量%；C：溶液濃度mg·mL-1；F:溶液稀釋倍數(shù)；V:溶液體積mL；m：樣品質(zhì)量mg。1.2.2甘草總黃酮的提取本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助提取的方法，在甘草渣粉末中加入乙醇，在250W的超聲清洗儀中提取，過濾即得甘草總黃酮濾液。

2 結(jié)果與討論

2.1 甘草總黃酮含量測定方法學(xué)考察

2.1.1 精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性取同一蘆丁對照品溶液，測定吸光度，重復(fù)6次，其RSD為1.16%；取供試樣品溶液1份，重復(fù)測定6次，12、24、36、48h同法測定，發(fā)現(xiàn)甘草總黃酮含量日內(nèi)和日間標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.24%和1.53%。表明供試樣品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定性較好，重現(xiàn)性好，精密度較高。

2.1.2 加樣回收率精密吸取已測定甘草總黃酮的供試液3份，加入3個(gè)不同濃度的蘆丁對照品溶液，按給定的分光光度法測定的吸光度，計(jì)算甘草總黃酮回收率。結(jié)果表明，平均回收率為98.68%，說明本方法準(zhǔn)確可靠。

2.2 不同工藝結(jié)果對比

通過對比實(shí)驗(yàn)可知超聲提取法所得甘草總黃酮的平均得率（0.819%），優(yōu)于熱回流（0.725%）及索氏提?。?.736%）的方法，因此，后續(xù)采用超聲提取法進(jìn)行研究。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過對提取過程中乙醇體積分?jǐn)?shù)、時(shí)間、液固比這些因素對實(shí)驗(yàn)的影響考察，可知乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%～70%、提取時(shí)間0.5～1.5h、液固比在20∶1～40∶1的范圍內(nèi)提取效果較好。

2.4 因素水平的選擇

乙醇的體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（B）和液固比（C）是決定得率的重要因素。在單因素篩選的基礎(chǔ)上，擬按3因素3水平試驗(yàn)，根據(jù)響應(yīng)面RSM中Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[9]設(shè)計(jì)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.1 Experimental factors and levels

應(yīng)用響應(yīng)面軟件對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，并對所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果回歸分析，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見表2、3。

表2 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Box-Behnken response values

6 6 5 1 . 0 3 0 0 . 9 2 6 7 7 0 1 . 0 4 0 0 . 9 1 3 8 6 0 1 . 0 4 0 0 . 8 1 4 9 6 5 1 . 5 4 0 0 . 8 6 6 1 0 7 0 0 . 5 3 0 0 . 8 6 2 1 1 6 5 0 . 5 2 0 0 . 7 2 3 1 2 6 5 1 . 0 3 0 0 . 9 1 4 1 3 7 0 1 . 5 3 0 0 . 8 9 5 1 4 6 5 0 . 5 4 0 0 . 8 4 8 1 5 6 0 0 . 5 3 0 0 . 6 9 2 1 6 6 0 1 . 0 2 0 0 . 6 9 3 1 7 6 0 1 . 5 3 0 0 . 7 3 2

表3 提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Tab.3 Result of analysis of variance

由表3可知，提取過程數(shù)學(xué)模型的F值=111.58＞F0.01（9,7）=6.71，顯著性水平P值＜0.0001，說明該模型是極顯著的，即用該模型來分析各因素對黃酮得率的影響是合理的。失擬項(xiàng)顯著水平P值0.1775，大于0.05，說明失擬項(xiàng)不顯著。方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)都是顯著的，說明各試驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響并非簡單線性關(guān)系。由F值比較得出，總黃酮得率因素影響的大小依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取液固比、提取時(shí)間。

對二次回歸方程的響應(yīng)面分析結(jié)果見圖3。

圖3 提取各因素對甘草總黃酮得率響應(yīng)曲面圖Fig.3 Response surface Chart of the effect of extraction ingredients to the yield of Licorice flavonoids（A:The volume fraction of ethanol;B:time;C:solid-liquid ratio.）

由圖3 a和b可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，得率增加明顯，曲面陡峭，即微小增量都能明顯提高得率，說明乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響最為顯著；由圖3 b和c圖可以看出，隨著固液比的增加，得率的增加也較為明顯，曲面陡峭，說明液固比的影響也較為顯著；圖3 a和c圖上反映出的提取時(shí)間對得率的影響較乙醇體積分?jǐn)?shù)和液固比來說顯著性不強(qiáng)，曲面較為平緩，與表3中數(shù)據(jù)吻合，因此，總黃酮得率因素影響的大小依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取液固比、提取時(shí)間，與表3中結(jié)果一致。從響應(yīng)曲面投影等高線圖3上可以初步分析：在一定范圍內(nèi)，總黃酮得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高、提取時(shí)間的增加和液固比溫度增加而增加。經(jīng)軟件對各因素回歸擬合后，得到回歸方程：

R=0.92+0.077A+0.020B+0.044C-0.002AB-0.021AC-0.013BC-0.055A2-0.072B2-0.043C2

根據(jù)所得到的模型，預(yù)測在穩(wěn)定狀態(tài)下的最大總黃酮得率為0.940%，優(yōu)化條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為67%、提取時(shí)間1.2 h，液固比37.06：1 L·g-1。采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行甘草總黃酮的提取，考慮到實(shí)際操作的便利，將提取液固比調(diào)整為37：1 L·g-1，共進(jìn)行了3次平行試驗(yàn)，得率分別為0.942%、0.929%和0.928%，平均值為0.933%，與預(yù)測值接近，且均高于探索試驗(yàn)，重復(fù)性好。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)為甘草渣中甘草總黃酮的提取提供了較優(yōu)化的工藝條件，即甘草渣粉末在液固比為37∶1（L· g-1）的67%的乙醇溶劑內(nèi)，超聲提取1.2h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的0.70%得率相比較，甘草總黃酮的得率有明顯的提高，達(dá)到0.933%?；貧w分析和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明了該響應(yīng)面法的合理性和可行性。

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Optimization extracting the licorice flavonoids from residue of glycyrrhiza using response surface analysis*

XIE Bin1*,LI Xue-kun2,GUO Hui-hui2
（1.Xi′an Botanical Garden of Shaanxi Province，Institute of Botany of Shaanxi Province，Xi′an 710061,China;2.Xi′an University,Xi′an 710065,China）

The residue of Glycyrrhiza was taken as test materials.Ultrasonic-assisted extracting licorice flavonoids from the residue of Glycyrrhiza was studied and optimized.Taking the yield of flavonoids as index,the response surface analysis was applied for optimizing the extracting technology.The results showed licorice flavonoids were extracted by which 37 times 67%ethanol was added to the residue powder,then it was extracted by ultrasonic for 1.2h.The yield of licorice flavonoids was 0.933%.The optimized technique was available and stable, which can be applied as the extracting technology of licorice flavonoids.

the residue of Glycyrrhiza;licorice flavonoids;extracting technology;response surface analysis

R284.2；TQ041+.8

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20170313

2017-01-17

陜西省科學(xué)院科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2014K-28）

謝斌（1985-），男，臺(tái)灣臺(tái)南人，碩士，主要從事植物化學(xué)方面的研究。