常 媛，楊興堂，姜傳英，姚志紅，賈 讓，任龍輝，張榮沭

(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

一株能拮抗3種土傳病害病原真菌的長枝木霉

常 媛，楊興堂，姜傳英，姚志紅，賈 讓，任龍輝，張榮沭

(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

為了豐富生防木霉菌(Trichodermaspp.)種資源，在園林植物八寶景天(Sedumspectabile)根際土壤中分離得到一株優(yōu)勢木霉。根據(jù)該菌株菌落的形態(tài)特征、形態(tài)學(xué)顯微觀察、菌株rDNA-ITS序列分析以及鄰接法同源性比對等結(jié)果判定木霉菌株種類。采用平板對峙法將該菌株與3種土傳病害病原菌[(Sclerotiniasclerotiorum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)和細(xì)鏈格孢菌(Alternariaalternata)]進(jìn)行對峙培養(yǎng)。并用該木霉誘導(dǎo)山新楊(Populusdavidiana×P.albavar.Pyramidalis)組培苗，觀察離體葉片抵抗細(xì)鏈格孢菌侵染的能力。結(jié)果表明，此木霉為長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)，命名為Tl-70。該菌株對3種土傳病害病原真菌均有較明顯的拮抗作用。對核盤菌的抑菌率最高為77.71%，顯著高于對細(xì)鏈格孢菌和立枯絲核菌的抑制率(P<0.05)；對立枯絲核菌的抑菌率為58.56%，顯著高于對細(xì)鏈格孢菌的抑制率(P<0.05)；對細(xì)鏈格孢菌的抑菌率最低，為53.32%。并且，該木霉能提高山新楊組培苗葉片拮抗細(xì)鏈格孢菌侵染的能力。說明此菌株是具有潛力的生防菌株。

木霉菌；形態(tài)特征；ITS序列分析；系統(tǒng)發(fā)育樹；拮抗作用；山新楊

木霉菌(Trichodermaspp.)是世界上公知的、重要的植物真菌病害防治菌，它的生防優(yōu)勢在于不僅具有殺真菌與促生長的作用，還具有改良土壤等多種功效[1-5]。既能防治農(nóng)作物及林木生長期真菌引起的病害，還能防治采摘后的水果蔬菜及園藝花卉材料的存儲(chǔ)期病害[6-8]；同時(shí)還具有誘導(dǎo)植物免疫反應(yīng)、降解土壤中的鹽類化合物、農(nóng)藥殘留物及重金屬等功能[4,9-12]。因而，對木霉菌的研究越來越受到重視。

木霉菌廣泛存在于土壤及其它基質(zhì)中, 其生存能力強(qiáng), 適應(yīng)性廣[13]。趙曉燕等[14]在中國13個(gè)省(自治區(qū))的采集總土樣647份，分離的木霉菌株總數(shù)為827株，并發(fā)現(xiàn)在土壤中比水樣中更容易分離出木霉菌[14]。景天屬植物以其觀賞價(jià)值高、抗旱、耐寒、耐貧瘠性強(qiáng)、少病蟲害、維護(hù)成本低、繁殖容易等優(yōu)點(diǎn)，成為節(jié)水、節(jié)能、節(jié)材、節(jié)力型生態(tài)園林建設(shè)不可或缺的優(yōu)良地被植物[15-16]。八寶景天(Sedumspectabile)，是景天科景天屬多年生宿根肉質(zhì)草本植物，主要分布于東北、華北、華東及華中各地[14]。對八寶景天的研究主要集中在生藥學(xué)、植物源農(nóng)藥和觀賞綠化等方面[17]。鑒于八寶景天具有多種抗逆特性，期望在八寶景天根際土壤中可以分離獲得能拮抗常見土傳植物病害的木霉菌株，為生物防治植物土傳病害提供物質(zhì)資源。核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)和細(xì)鏈格孢菌(Alternariaalternata)是常見的土傳植物病害病原菌，能引發(fā)多種林木、農(nóng)作物和觀賞植物的枯萎病、根腐病、立枯病和猝倒病等病害[18-21]，本研究鑒定了一株從八寶景天根際土壤中分離獲得的木霉菌，采用平板對峙法觀察該菌株對3種土傳病原菌的抑制效果；并用該木霉誘導(dǎo)山新楊(Populusdavidiana×P.albavar.Pyramidalis)，觀察木霉誘導(dǎo)對山新楊拮抗細(xì)鏈格孢菌侵染能力的影響，以期為確定該菌株的生防作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

八寶景天根際土壤： 采集于哈爾濱市道里區(qū)兆麟公園內(nèi)步行道路邊，光照充足。將八寶景天全株拔出，剪下根部，置于無菌PE袋中，置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，備用。

供試病原菌：核盤菌、立枯絲核菌和細(xì)鏈格孢菌均由東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院劉志華博士提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與純化 將八寶景天帶土的根部放入無菌蒸餾水中，按照劉志華等[22]的植物根際木霉分離方法進(jìn)行分離，將獲得的菌落在無菌條件下分別單獨(dú)接種于PDA(potato dextrose agar)平板培養(yǎng)基(直徑9 cm)上，25 ℃恒溫全光照培養(yǎng)。待剛長出菌絲時(shí)，挑取菌絲接種在新的PDA培養(yǎng)基上。如此操作，直至獲得無雜菌污染的單菌落。最后，將純化菌株轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基中，4 ℃儲(chǔ)存留做鑒定。

1.2.2 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 將待鑒定菌株接種到PDA平板上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)和顏色。另緊貼平板內(nèi)緣在培養(yǎng)基上平鋪一張蓋玻片，待菌絲生長覆蓋蓋玻片后，取蓋玻片使用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲隔膜、分生孢子梗、瓶梗和分生孢子等顯微結(jié)構(gòu)的形態(tài)，并在TrichodermaandHypocreaTaxonomy網(wǎng)站(http://nt.ars-grin.gov/taxadescriptions/keys/TrichodermaIndex.cfm)與木霉的形態(tài)特性進(jìn)行比較，從形態(tài)上對菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

1)收集菌株的菌絲體：將待鑒定菌株的分生孢子(1×104cfu·mL-1200 μL)在無菌條件下接種至PDB培養(yǎng)基內(nèi)，25 ℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)4 d后，用安子旋等[23]的方法收集菌絲體。將獲得的菌絲置于液氮中速凍，置于-80 ℃冰箱中備用。

2)菌株的基因組rDNA提取、ITS序列擴(kuò)增及測序：采用CTAB法[24]提取木霉菌的基因組rDNA，利用通用引物對ITS1/ITS4擴(kuò)增ITS片段。引物序列為，ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；IST4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。采用TaKaRa Ex Taq?(寶生物工程(大連)有限公司)試劑盒,按照說明書步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為50 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用Trans2k Plus DNA Marker(Beijing Transgen Biotech Co., Ltd.)指示擴(kuò)增產(chǎn)物分子量的大小。采用Promega Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega)試劑盒，按照說明書步驟回收PCR產(chǎn)物。序列測定由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。

3)基因比對及進(jìn)化樹分析：將測得的序列提交到ISTH網(wǎng)站(http://www.isth.info/)進(jìn)行TrichOKEY分類鑒定，來確定待鑒定菌株的菌種。并將測序結(jié)果在TrichoBLAST的ITS Database數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對。用MEGA6.06軟件與已知菌種ITS序列作同源性比較，并對檢索獲得的同源性較近的菌株采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(Bootstrap=1 000)，分析親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育。

1.2.4 平板對峙培養(yǎng) 先將已鑒定的木霉菌株與3種病原真菌同步活化4 d，至菌落分布均勻，用直徑6 mm的打孔器打取菌碟，試驗(yàn)組分別將木霉菌和每種病原菌菌碟同時(shí)接種在內(nèi)徑9 cm的PDA平板上，菌碟圓心相聚5 cm，連線經(jīng)過平板圓心；對每種病原菌設(shè)置對照組，接種方法同試驗(yàn)組，不接種木霉菌。接種后的平板靜置于培養(yǎng)箱內(nèi)，25 ℃培養(yǎng)144 h。每個(gè)對峙試驗(yàn)做3個(gè)重復(fù)。在96和144 h觀察木霉菌與病原菌的生長狀況，在144 h測量病原菌對照菌落半徑和病原菌落指向木霉菌的半徑，按下式計(jì)算待鑒定菌株對3種病原真菌的抑菌率[25]。

抑菌率=[(病原菌對照菌落半徑-病原菌落指向木霉菌的半徑)×病原菌對照菌落半徑-1]×100% 。

1.2.5 木霉菌與山新楊組培苗互作后拮抗細(xì)鏈格孢菌的能力 山新楊組培苗按照呂曼曼等[26]的方法繁殖。配制濃度為1×105cfu·mL-1的Tl-70的分生孢子溶液。取200 μL該溶液加入到裝有20 mL WPM液體培養(yǎng)基的試管中，將山新楊組培苗根部在無菌條件下植入，進(jìn)行Tl-70與楊樹苗根組織互作，設(shè)為處理組；同時(shí)，以只加200 μL無菌水培養(yǎng)基培養(yǎng)的山新楊組培苗為對照，處理和對照組均在溫度為26 ℃的生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，此時(shí)可見山新楊根部已纏繞Tl-70的菌絲體。

無菌條件下，分別取處理和對照組中山新楊大小相近的成熟葉片，置于9 cm的無菌平皿中完全濕潤的濾紙上。在葉片相同位置上接種直徑為5 mm的細(xì)鏈格孢菌菌餅，封口后置于溫度為26 ℃的生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別以沒接種病原菌的木霉處理過的和未處理的葉片為對照，每處理3次重復(fù)，每個(gè)培養(yǎng)皿中3個(gè)葉片。觀察接種病原菌5 d后葉片染病情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測得的數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2007軟件包及Minitab 16統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析處理。對不同菌株抑菌率的差異顯著性(P<0.05)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)鑒定

在八寶景天根際土壤中共分離得到27個(gè)木霉菌落，對生長在平板PDA培養(yǎng)基上的這些單菌落按形態(tài)特征進(jìn)行比較鑒別，共有5種木霉，分別有11、6、5、3、2個(gè)菌落。本研究選取得到11個(gè)菌落的一種木霉(優(yōu)勢木霉)進(jìn)行菌種鑒定和拮抗作用研究。為了后續(xù)研究及保存，將此菌株命名為Tl-70。

25 ℃全光照條件下，木霉Tl-70的菌落生長初期菌絲白色，繼續(xù)生長產(chǎn)生分生孢子，分生孢子綠色，以接種點(diǎn)為圓心呈同心紋狀分布，分生孢子堆呈黑綠色(圖1 A)。平板背面可見以接種點(diǎn)為中心產(chǎn)生黃色的可擴(kuò)散色素(圖1 B)。菌落生長迅速，有明顯的輪紋，周圍有白色菌絲的生長帶，最后整個(gè)菌落全都變成黑綠色。顯微(100×)觀察可見(圖1 C)：分生孢子橢圓形或細(xì)長橢圓形，光滑，大小為(2.0～3.2) μm×(1.5～2.3) μm。典型的分生孢子梗包括發(fā)育強(qiáng)壯的中軸，在中軸上向頂端產(chǎn)生單生的瓶梗，隨著離頂端距離的延伸，產(chǎn)生成對的長度逐漸增加的二次分枝；瓶梗直接著生在二次分枝上。瓶梗主要為單生，典型形狀為圓柱形，呈渦狀排列時(shí)中間部分膨大，直或彎曲成鉤狀。參照TrichodermaandHypocreaTaxonomy網(wǎng)站對長枝木霉菌落形態(tài)分類鑒定的描述，初步確定為長枝木霉(T.longibrachiatum)。

2.2 菌株分子鑒定

木霉Tl-70的ITS基因片段PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，條帶清晰單一，大小約600bp。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序，結(jié)果長度為637 bp，與木霉ITS序列長度理論值一致。

圖1 觀察的Tl-70菌落形態(tài)和顯微形態(tài)特性

注：A為平板培養(yǎng)72-144 h的菌落形態(tài)；B為平板背面，示黃色素；C為顯微(100×)結(jié)構(gòu)：a，分生孢子；b，瓶梗；c，分生孢子梗；d，菌絲隔膜。

Note: A， Colonial morphology of Tl-70 cultured for 72 to 144 h (obverse side)； B， reverse sides of dishes of Tl-70 (shows yellow pigment, cultured from 72 to 144 h)； C， micro-morphology of Tl-70 observed using optical microscopy (100× magnification). a, Conidium; b, phialides; c, conidiophore; d, Hyphae septum.

將木霉Tl-70的ITS基因片段測序結(jié)果提交到ISTH網(wǎng)站(http://isth.info/)的TrichOKEY中進(jìn)行比對鑒定。共發(fā)現(xiàn)5個(gè)特異種源標(biāo)記(anchors)，位置分別在Tl-70序列的第74、98、280、438和532堿基處。種屬鑒別為長枝木霉(T.longibrachiatum)或東方肉座菌(Hypocreaorientalis)。種屬鑒定的可靠性均為高。

將木霉Tl-70的ITS基因序列提交到ITS Database中進(jìn)行TrichoBLAST同源性搜索(Expect=0.0)，獲得數(shù)據(jù)庫中一致性高的ITS1和ITS2序列共11條，分值范圍在882～735。這些序列與Tl-70的ITS基因序列在覆蓋序列長度為445～437 bp范圍內(nèi)的一致性在96～100%，Tl-70的ITS基因序列與長枝木霉(T.longibrachiatum, ATCC18648)的一致性最高，達(dá)到100%(表1)。而與東方肉座菌(H.orientalis, GJS88-81)的一致性為99%。因此，綜合在TrichOKEY和TrichoBLAST中比對的結(jié)果，判定Tl-70為長枝木霉。

將木霉Tl-70和在ISTHDatabase中搜索到的與其親緣關(guān)系近的11個(gè)菌種的ITS基因序列作同源性比較，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖2)。上述12種菌株聚類為2組，Tl-70位于Ⅱ組，與長枝木霉ATCC18648(Z31019)和東方肉座菌H.orientalis為一組。Tl-70與長枝木霉ATCC18648(Z31019)的親緣關(guān)系最近；有研究者[8]認(rèn)為,東方肉座菌包含長枝木霉集合種的一部分，遺傳上H.orientalis與T.longibrachiatum非常接近，本研究鑒定結(jié)果與此一致。然而，木霉Tl-70與紅褐肉座菌(H.jecorina)/李氏木霉[T.reesei(ATCC13631)]、栗褐肉座菌(H.schweinitzii)、橘綠木霉[T.citrinoviride(CBS258.85)]、木霉MA3642和加納木霉T.ghanense(GJS95-137)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

表1 用Tl-70的ITS基因序列進(jìn)行同源性搜索獲得的同源菌種及信息

圖2 Tl-70菌株與高同源性菌株ITS基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 平板對峙培養(yǎng)及抑菌率分析

對峙培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：木霉Tl-70對3種病原菌均具有拮抗作用。在對峙培養(yǎng)96 h時(shí)，病原菌菌落均已與Tl-70的菌落邊緣發(fā)生接觸，但3種病原菌生長受到木霉菌抑制的程度不同(圖3)。觀察發(fā)現(xiàn)，3種病原菌菌絲生長速度為立枯絲核菌>核盤菌>細(xì)鏈格孢菌(圖3a、b、c)。細(xì)鏈格孢菌生長速度最慢，對峙培養(yǎng)中細(xì)鏈格孢菌菌落周圍尚有木霉菌絲沒有蔓延過去的空間，這或許是細(xì)鏈格孢菌能分泌某種揮發(fā)性物質(zhì)，影響了Tl-70的生長和產(chǎn)孢(圖3d)。同時(shí)，由于立枯絲核菌生長速度最快，與Tl-70對峙培養(yǎng)時(shí)先占據(jù)了平板的大部分營養(yǎng)和空間，使Tl-70生長空間受到侵占，2個(gè)菌株的菌落邊緣已完全接觸，Tl-70的產(chǎn)孢量與圖3d和f相比最少。但是，在Tl-70與立枯絲核菌交界處已見少量木霉菌分生孢子寄生在立枯絲核菌的菌絲體上，說明Tl-70菌株具有重寄生作用(圖3e)。此外，盡管核盤菌的菌絲生長較快，但其與Tl-70對峙培養(yǎng)96 h時(shí)，已被限制在較小的營養(yǎng)和空間內(nèi)，說明Tl-70與核盤菌對峙時(shí)呈優(yōu)勢生長(圖3f)。

對峙培養(yǎng)144 h時(shí)，病原菌菌落所占據(jù)的空間與96 h時(shí)觀察的結(jié)果相比均已縮小，并且Tl-70的產(chǎn)孢量在增加、分生孢子的顏色變成深綠色(圖3j、k、l)。由Tl-70與細(xì)鏈格孢菌的對峙培養(yǎng)可見，Tl-70菌株占據(jù)了空余的營養(yǎng)和環(huán)境空間，細(xì)鏈格孢菌的生長受到限制。Tl-70對細(xì)鏈格孢菌抑菌作用最弱，抑菌率為53.32%(圖3f)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Tl-70已經(jīng)控制立枯絲核菌生長，使其不再擴(kuò)大生長，Tl-70對立枯絲核菌的抑菌率為58.56%，方差分析結(jié)果顯示顯著高于對細(xì)鏈格孢菌的抑菌率(P<0.05)(圖3 k)。此外，優(yōu)勢生長的Tl-70菌株已將核盤菌限制在一個(gè)很小的空間區(qū)域內(nèi)，對核盤菌的抑菌率最高，為77.71%，顯著高于對立枯絲核菌和細(xì)鏈格孢菌的抑菌率(P<0.05)(圖3l)。

2.4 木霉Tl-70與山新楊組培苗互作后拮抗細(xì)鏈格孢菌的能力

在Tl-70處理和未處理的山新楊組培苗葉片上接種細(xì)鏈格孢菌3 d時(shí)，可見細(xì)鏈格孢菌菌絲開始生長。但對照組葉片比處理組菌絲生長早，且病斑出現(xiàn)快。接種細(xì)鏈格孢菌5 d時(shí)，與Tl-70互作后楊樹苗葉片上的病斑明顯小于對照葉片上的病斑(圖4 C和D)。對照組比處理組葉片上病斑的平均半徑約大1.7 mm(n=9)，存在顯著差異(P<0.05)。說明與Tl-70互作能增強(qiáng)山新楊對細(xì)鏈格孢菌侵染的抵抗能力。

3 討論與結(jié)論

本研究根據(jù)木霉Tl-70菌落的形態(tài)特征、形態(tài)學(xué)顯微觀察、菌株rDNA-ITS序列分析以及鄰接法同源性比對等結(jié)果進(jìn)行分類鑒定，確定分離獲得的木霉為長枝木霉。觀察發(fā)現(xiàn)，該菌株對3種土傳病害病原真菌均有較明顯的拮抗作用。對核盤菌的抑菌率最高為77.71%，顯著高于對細(xì)鏈格孢菌和立枯絲核菌的抑制率(P<0.05)；對立枯絲核菌的抑菌率為58.56%，顯著高于對細(xì)鏈格孢菌的抑制率(P<0.05)；對細(xì)鏈格孢菌的抑菌率最低，為53.32%。此外，Tl-70誘導(dǎo)山新楊組培苗后能增強(qiáng)其葉片對細(xì)鏈格孢菌侵染的抵抗能力。說明木霉Tl-70是具有潛力的生防菌株。

長枝木霉作為木霉屬中重要的一種，能對小麥葉斑病菌(Bipolaristriticicola)、小麥赤霉病菌(Fusariumsporotrichioides)、南瓜葉枯病菌(A.cucumerina)、黃瓜枯萎病菌(F.oxysporum)、西瓜枯萎病菌(F.oxyspornum)、大豆根腐病菌(F.solani)、百合枯萎病菌(F.oxysporum)、棉花立枯病菌(R.solani)、蘋果樹腐爛病菌(Valsaceratosperma)、甘草葉斑病菌(A.azukiae)、獨(dú)活葉斑病菌(Septoriadearnessii)和大黃葉斑病菌(Ascochytarhei)12種植物病原菌生長具有抑制作用[27]，已經(jīng)引起國內(nèi)外很多學(xué)者的重視[28]。本研究分離得到長枝木霉菌Tl-70，將為開發(fā)木霉生防制劑提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖4 組培苗葉片拮抗細(xì)鏈格孢菌能力

注：A，對照組葉片；B，木霉處理組葉片；C，對照組葉片接種細(xì)鏈格孢菌；D，木霉處理組葉片接種細(xì)鏈格孢菌

Notes：A) Leaves of untreated tissue-cultured seedlings (control group), B) leaves of seedlings inoculated with Tl-70 (T group),C) leaves of control group infected withAlternariaalternata, and D) leaves of T group infected withAlternariaalternata

研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌生物防治機(jī)制存在多種形式，包括定殖在植物根際的木霉菌通過對營養(yǎng)和空間的競爭來抑制病原真菌的生長和繁殖[27]，木霉菌對病原真菌的重寄生[28-29]，木霉菌發(fā)酵產(chǎn)生抗生素等活性物質(zhì)來抑制或殺死病原真菌[29-30]，及木霉菌促進(jìn)植物生長誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗病性等[31-32]。其中競爭、重寄生、發(fā)酵產(chǎn)物殺菌等機(jī)制是生防菌與病原微生物單一的作用過程。平板對峙培養(yǎng)法便于觀察拮抗菌占領(lǐng)營養(yǎng)和空間的能力、重寄生或溶菌現(xiàn)象。Tl-70在72 h時(shí)已占據(jù)整個(gè)培養(yǎng)皿的空間并產(chǎn)生大量的分生孢子(圖1)。而這3種病原菌菌絲在96 h時(shí)還沒有占據(jù)整個(gè)培養(yǎng)皿的生長空間(圖3)。因此，相對于病原菌，Tl-70具有很好的營養(yǎng)和空間競爭優(yōu)勢。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，木霉Tl-70和3種不同病原菌對峙培養(yǎng)144 h內(nèi)，Tl-70菌絲生長、產(chǎn)孢速度和最終對病原菌產(chǎn)生的拮抗效果不同。與細(xì)鏈格孢菌對峙，菌絲生長、產(chǎn)孢速度慢于與核盤菌的對峙培養(yǎng),表現(xiàn)為逐漸占據(jù)大部分生長空間。而與核盤菌的對峙培養(yǎng)中，在144 h內(nèi)一直表現(xiàn)出很好的競爭作用(圖3)。在與立枯絲核菌對峙培養(yǎng)時(shí)，最初雖然沒占據(jù)空間優(yōu)勢，在144 h時(shí)，Tl-70大量產(chǎn)孢?？傊?，盡管Tl-70占據(jù)空間的大小不同，但一直表現(xiàn)為良好的生長狀態(tài)。雖然對峙培養(yǎng)不能全面反映田間施用拮抗菌的實(shí)際情況，但揭示了Tl-70對病原菌可能的拮抗作用和途徑、以及木霉菌與病原菌接觸時(shí)的生長狀態(tài)，這些結(jié)果將對木霉Tl-70的開發(fā)應(yīng)用起到積極的指導(dǎo)作用。

現(xiàn)有的研究[29-31]認(rèn)為,木霉菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性的機(jī)制涉及植物多種信號途徑和代謝途徑，十分復(fù)雜，尚未闡明。已有較多文獻(xiàn)報(bào)道木霉誘導(dǎo)產(chǎn)生的植物系統(tǒng)抗病性主要依賴于jasmonate-ethylene途徑，同時(shí)伴隨多個(gè)抗病基因的短期表達(dá)[32-33]。而采用抑制消減雜交方法驗(yàn)證長枝木霉MK1能通過活躍活性氧信號途徑和加固細(xì)胞壁來提高番茄(Solanumlycopersicum)對灰霉病菌(Botrytiscinerea)的防御能力[34]。將分離得到的長枝木霉Tl-70與洋蔥(Alliumcepa)共生互作，通過影響洋蔥的抗氧化能力、以及碳水化合物、木質(zhì)素、硫同化的代謝途徑，提升了洋蔥生長速率和對尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)的防御能力[35]。以上研究表明，在不同的木霉菌株誘導(dǎo)不同植物提高其系統(tǒng)抗病性的過程中，可能既有共通機(jī)制，又有特異機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)長枝木霉Tl-70誘導(dǎo)后,山新楊組培苗葉片抵抗細(xì)鏈格孢菌侵染能力明顯增強(qiáng)。長枝木霉Tl-70與山新楊互作后影響了哪些代謝途徑,從而使其提高對細(xì)鏈格孢菌的抗性有待于深入研究。

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(責(zé)任編輯 茍燕妮)

ATrichodermalongibrachiatumstrain with antagonistic effects against three soil-borne pathogenic fungi

Chang Yuan, Yang Xing-tang, Jiang Chuan-ying, Yao Zhi-hong, Jia Rang, Ren Long-hui, Zhang Rong-shu

(College of Landscape Architecture, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

To enrich the microbial resources ofTrichodermaspp. for biocontrol, a dominantTrichodermastrain was isolated from the rhizosphere soil of a landscape plant, Sedum spectabile Boreau. The isolatedTrichodermastrain was identified using colonial-and micro-morphological observations, ribosomal DNA (rDNA)-internal transcribed spacer (ITS) sequence alignment, and homology analysis using a Neighbour-Joining method. An agar disk diffusion method was used to investigate the antagonism between the isolatedTrichodermastrain and three other soil-borne pathogenic fungi,Sclerotiniasclerotiorum,Rhizoctoniasolani, andAlternariaalternata. The tissue-cultured plantlets ofPopulusdavidiana×P.albavar.Pyramidaliswere further inoculated with the isolatedTrichodermastrainand the resistance of the inoculated seedling leaves againstA.alternatawas evaluated in vitro. The results demonstrated that the isolatedTrichodermastrain wasTrichodermalongibrachiatum and it exhibited evident and differential antagonistic effects against each of the three tested soil-borne pathogenic fungi. We designated the isolated Trichoderma strain as Tl-70. The antifungal activity of Tl-70 againstS.sclerotiorumwas a 77.71% inhibition, which was the highest and significantly higher than that againstR.solaniorA.alternata(P<0.05). The antifungal activity againstR.solaniwas a 58.56% inhibition, and significantly higher than that againstA.alternata(P<0.05, 53.32%), which was the lowest of the three tested strains. Moreover, inoculation with Tl-70 enhanced the disease resistance of the leaves of tissue-culturedPopulusdavidiana×P.albavar.Pyramidalisseedlings against the pathogenA.alternata. Our results suggest that Tl-70 is a potential biocontrol strain.

Trichoderma; morphology; ITS sequence analysis; Phylogenetic tree; antagonistic effect;Populusdavidiana×P.albavar.Pyramidalis

Zhang Rong-shu E-mail:zrs6504@sina.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0234常媛，楊興堂，姜傳英，姚志紅，賈讓，任龍輝，張榮沭.一株能拮抗3種土傳病害病原真菌的長枝木霉.草業(yè)科學(xué),2017,34(2)：246-254.

2016-05-06接受日期：2016-11-17

2015年國家級本科生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201510225062)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)專項(xiàng)E類預(yù)研項(xiàng)目(2572015EY01)；國家自然科學(xué)基金(31370642)

常媛(1993-)，女，河南濟(jì)源人，在讀本科生，主要從事園林植物種質(zhì)資源研究及植物病害生物防治。E-mail：630603391@qq.com

張榮沭(1965-)，女，黑龍江哈爾濱人，副教授，博士，主要從事園林植物種質(zhì)資源研究及植物病害生物防治。E-mail：zrs6504@sina.com

S432.4+4

A

1001-0629(2017)2-0246-09

Chang Y,Yang X T,Jiang C Y,Yao Z H,Jia R,Ren L H,Zhang R S.ATrichodermalongibrachiatumstrain with antagonistic effects against three soil-borne pathogenic fungi.Pratacultural Science，2017,34(2)：246-254.