摘要：目的是探討大鼠表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)的方法。方法主要以0 ～7日齡SD大鼠為材料，采用中性蛋白酶和胰蛋白酶分離表皮細(xì)胞，IV型膠原黏附法對(duì)分離的表皮干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其形態(tài)、生長(zhǎng)情況。結(jié)果是培養(yǎng)后的表皮干細(xì)胞胞質(zhì)近中央處有圓形核并開始形成小克隆，細(xì)胞即連接成片，緊密相靠，相互銜接，呈鋪路石狀。結(jié)論為該方法分離培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞純合，呈現(xiàn)典型的上皮型細(xì)胞形態(tài)，可用于皮膚的再生修復(fù)。

關(guān)鍵詞：表皮干細(xì)胞；細(xì)胞分離；細(xì)胞培養(yǎng)

中圖分類號(hào)： Q593. 2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1674-0432（2014）-18-17-1

表皮干細(xì)胞也可稱角質(zhì)干細(xì)胞，不同部位的表皮干細(xì)胞分布存在差異，其主要分布于表皮基底層和毛囊外根鞘隆凸部及皮脂腺邊緣[1]。表皮干細(xì)胞在維持皮膚的自我更新、創(chuàng)傷修復(fù)、皮膚腫瘤的發(fā)生等方面扮演著重要的角色，因此成功地分離、培養(yǎng)表皮干細(xì)胞對(duì)臨床上創(chuàng)傷修復(fù)、皮膚癌的研究起著至關(guān)重要的作用[2]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及用具

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 0～7日齡SD大鼠。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 中性蛋白酶，胰蛋白酶-EDTA消化液，IV型膠原，DMEM培養(yǎng)液，D-Hanks，KSFM培養(yǎng)液，凍存液，75%酒精。

1.1.3實(shí)驗(yàn)用具 剪刀、鑷子、尼龍紗網(wǎng)、手術(shù)刀、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、凍存管、水浴鍋、CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)，電子顯微鏡，離心機(jī)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1表皮細(xì)胞的分離 取0 ～7日齡SD大鼠，脫頸錐處死， 75%酒精清洗，剪取背部皮膚，D-Hanks清洗，將其切割為0.5×1.0厘米的皮膚組織，0.25%中性蛋白酶在4℃處理12～16小時(shí)，吸棄上清液，D-Hanks清洗后分離表皮和真皮。表皮剪碎呈糜狀，以2.5克/升胰酶+0.2克/升 EDTA消化液在37℃條件下消化5～10分鐘，用含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，吹打至懸液，100目尼龍紗網(wǎng)過濾，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄上清液，以培養(yǎng)液重懸制成單細(xì)胞懸液。

1.2.2 膠原黏附法選擇表皮干細(xì)胞 將單細(xì)胞懸液以2×105 個(gè)/毫升的密度接種在鋪被IV型膠原的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育10～15分鐘。吸出細(xì)胞懸液，粘附在膠原被膜上的細(xì)胞則為表皮干細(xì)胞。

1.2.3 表皮干細(xì)胞培養(yǎng) 在去除細(xì)胞懸液鋪被IV型膠原的培養(yǎng)瓶中加入無(wú)血清角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基（KSFM）進(jìn)行培養(yǎng)，12小時(shí)后換液以除去未貼壁的細(xì)胞，以后每2天換液一次，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞

剛剛接種的表皮干細(xì)胞，細(xì)胞均勻分散呈圓形，核大，胞體小，培養(yǎng)一周（圖1）進(jìn)入增殖期，第12天達(dá)到高峰表皮干細(xì)胞漸漸伸展形成扁平的多角狀，胞質(zhì)近中央處有圓形核并開始形成小克隆，細(xì)胞即連接成片，緊密相靠，相互銜接，呈鋪路石狀，匯合成片。

2.2 傳代培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞

原代細(xì)胞接種24小時(shí)后即伸展，相互聚集，粘附在膠原上，呈克隆樣生長(zhǎng)，細(xì)胞聚集在集落中心周圍呈輻射狀生長(zhǎng)，5～6天表皮干細(xì)胞增殖能力加強(qiáng)，達(dá)到融合鋪滿培養(yǎng)瓶的瓶底。

3 結(jié)語(yǔ)

不同的細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)細(xì)胞的黏附作用不同，表皮干細(xì)胞主要通過表達(dá)整合素實(shí)現(xiàn)其對(duì)基底膜的粘附，同時(shí)也是干細(xì)胞維持其特性的基本條件。IV型膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分對(duì)細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)、移行等方面起重要作用，表皮干細(xì)胞不僅對(duì)IV型膠原有較強(qiáng)的粘附性，而且在IV型膠原上能很好的生長(zhǎng)，由此進(jìn)行篩選、培養(yǎng)、純化表皮干細(xì)胞，結(jié)果表明，獲得的表皮干細(xì)胞較純凈，其仍具有較強(qiáng)的分裂增殖能力，于培養(yǎng)后第二天，大量克隆細(xì)胞形成，5～6天匯合成片，可以長(zhǎng)期傳代。該方法操作簡(jiǎn)便，表皮干細(xì)胞生長(zhǎng)良好，具有較高的克隆形成率。

無(wú)血清培養(yǎng)基及其附加的營(yíng)養(yǎng)成分在細(xì)胞生長(zhǎng)與培養(yǎng)液之間提供了較好的平衡體系，有利于表皮干細(xì)胞的增殖及其表型的維持，由于培養(yǎng)基中不含血清，沒有血清中的各種復(fù)雜和不明的成分，排除血清中許多未知因素對(duì)干細(xì)胞分化的影響，是目前培養(yǎng)表皮干細(xì)胞被認(rèn)可的方法[3]。

參考文獻(xiàn)

[1] 孫曉燕，付小兵，孫同柱.表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定，中華實(shí)驗(yàn)外科雜志[J]，2007，24（2）：163-164.

[2] 王海燕.肺出血·腎炎綜合征抗基底膜抗體型.北京人民衛(wèi)生出版社[M]，1998：912-922.

[3] 劉德伍，陳國(guó)安，曹勇，等.人表皮細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[J]，1997，13（6）：419-420.

作者簡(jiǎn)介：馮穎，碩士學(xué)歷，通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，講師，研究方向：生物技術(shù)。