陳志　申才良

摘要：目的 通過比較由單獨神經干細胞（NSCs）移植治療大鼠脊髓損傷（SCI）和由骨髓間充質干細胞（BMSCs）與NSCs序貫治療大鼠SCI的脊髓恢復情況不同，研究BMSCs對大鼠脊髓微環(huán)境的影響以及序貫治療的可行性和優(yōu)勢。方法 體外分離，培養(yǎng)，純化NSCs和BMSCs，改良Allen法制造大鼠脊髓損傷（SCI）模型，48只大鼠隨機分為單獨標記神經干細胞移植組（A組，n=24），間充質干細胞+標記神經干細胞序貫移植組（B組，n=24）。分別于移植后3 d、1 w、2 w，3 w、4 w、6 w、8 w取脊髓組織，觀察脊髓空洞形成情況，神經干細胞分化生長情況，以及脊髓膠質疤痕大小。結果 序貫移植組BBB評分比單獨神經干細胞移植組高（P<0.05）；觀察大鼠在治療后1，2，3，4，6，8 w時的神經元細胞數目，血管生長情況，膠質疤痕以及脊髓空洞大小A，B組之間有顯著性差異（P≤0.05）。結論 BMSCs可促進了NSCs的有效分化，減少膠質化傾向，改善了脊髓的微環(huán)境有利于治療SCI，骨髓間充質干細胞與神經干細胞序貫移植對大鼠脊髓損傷的療效優(yōu)于單獨移植神經干細胞。

關鍵詞：脊髓損傷；細胞培養(yǎng)；移植；慢病毒轉染；序貫移植

中圖分類號：R651.2 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1959（2017）20-0038-05

Abstract：Objective To compare by separate neural stem cells（NSCs）transplantation for the treatment of spinal cord injury（SCI）and bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）and NSCs sequential therapy of SCI rats spinal cord recovery，effects of BMSCs on rat spinal cord microenvironment and sequential treatment of culture method of feasibility and advantage.Methods In vitro，separation，purification of NSCs and BMSCs in rats with spinal cord injury，manufacturing method of modified Allen（SCI）model，48 rats were randomly divided into separate labeled neural stem cells transplantation group（group A，n=24），Mesenchymal stem cells+labeled neural stem cells in the sequential transplantation group （group B，n=24）.The spinal cord tissue was observed at 3 d，1 w，2 w，3 w，4 w，6 w and 8 w after transplantation.The formation of spinal cord formation， the growth of neural stem cells and the size of glial scar were observed.Results The BBB score of the sequential transplantation group was higher than that of the neural stem cell transplantation group（P<0.05）.The number of neuronal cells，the growth of the blood vessels were observed at 1，2，3，4，6 and 8 w after treatment.There was a significant difference between the quality scar and the size of the syringia in group A and B（P≤0.05）.Conclusion BMSCs can promote the differentiation of NSCs effectively，reduce glial tendency，improve the micro environment of the spinal cord is conducive to the treatment of SCI，bone marrow mesenchymal stem cells and neural stem cells transplantation on curative effect is better than that of sequential injury of rat spinal cord neural stem cells transplantation alone.

Key words：Spinal cord injury；Cell culture；Transplantation；Lentivirus transfection；Sequential transplantation

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）可導致嚴重的運動、感覺和自主神經功能障礙，它是一種高花費、高致殘率的疾病，目前，對受傷的脊髓還沒有有效的治療方法[1]。脊髓損傷的治療一直是骨科醫(yī)生的研究熱點和重點，然而手術只能解除對脊髓的壓迫和恢復脊柱的穩(wěn)定性，還無法使損傷的脊髓恢復功能[2]，而應用SCs的多向分化潛能，可生成各種組織細胞，特別是特定的神經細胞，這使得修復損傷的脊髓組織，恢復脊髓功能成為可能，應用SCs移植有可能治愈SCI，是最具潛力的治療方法。近年來多項研究已經發(fā)現(xiàn)神經干細胞和骨髓間充質干細胞局部移植均可促進脊髓損傷的修復[3-4]，但深入研究發(fā)現(xiàn)：移植的NSCs在體內存活較少，且即使存活分化也存在困難，原因是脊髓損傷后微環(huán)境不利于NSCs的存活，定植及分化。在2013年，F(xiàn)orostyak提出了間充質干細胞能改善脊髓損傷的微環(huán)境[5]。同時我們體外實驗發(fā)現(xiàn)：MSCs促進了NSCs的有效分化[6-7]。那么，其在體內是否顯示同樣的效應？為了探明在動物體內間充質干細胞是否對脊髓微環(huán)境起改善作用以及間充質干細胞對神經干細胞分化的影響，探索序貫移植的有效性及其方法，我們利用大鼠的脊髓損傷模型分別進行了序貫移植與單獨神經干細胞移植治療大鼠SCI的動物實驗。endprint

1 材料與方法

1.1實驗材料

實驗所用SPF大鼠均由安徽醫(yī)科大學動物實驗中心提供，4 w雌性大鼠5只，SPF級，重（100 ±10）g；新生大鼠5只，SPF級；成年雌性大鼠48只，SPF級，重（230±20）g。主要試劑與儀器：胎牛血清FBS（美國Gibco公司）；慢病毒載體（上海吉凱基因公司）；B-27（美國Invitrogen公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋）。

1.2實驗方法

1.2.1 大鼠NSCs的培養(yǎng)、轉染、鑒定 新生SPF級大鼠腹腔麻醉（10%水合氯醛），剪刀離斷頭顱，75%酒精浸泡5 min，紫外線照射30 min，取大鼠全腦，Hank's液漂洗三次，剪碎全腦，加入神經元基礎培養(yǎng)基5 ml，加入胰酶細胞消化液1 ml，消化5 min，加入10%胎牛血清培養(yǎng)基終止消化；70 μm孔徑的篩網過濾，制成單細胞懸液，1000 r/min離心10 min，棄上清液， 反復吹打單細胞懸液，加入2 ml無血清培養(yǎng)基 （含有 DMEM/F-12 + 2 %B-27 + 20 ng/mlEGF + 20 ng/mlbFGF + 青霉素100 U/ml + 鏈霉素0.1 mg/ml），1000 r/min離心3 min，棄上清液， 加入無血清培養(yǎng)基，吹打單細胞懸液，計數。將單細胞懸液以1×106/ ml接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）培養(yǎng)， 每3 d換液1次。2～3 d后鏡下觀察，可見懸浮生長的細胞球，7 d后，600 r/min離心5 min，吸棄上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，長頸吸管反復吹打細胞球，制成單細胞懸液，分別接種到兩個新培養(yǎng)瓶中，1×105個細胞/瓶，培養(yǎng)條件不變。每3 d換液1次，每7 d傳代1次。提取2瓶傳代培養(yǎng)三代的NSCs，分別倒入兩只25 ml試管中，3000 r/min離心5 min，吸棄上清液，將細胞沉淀接種于6孔板上（接種體積2 ml+病毒量160 μl+ENi.S.液160 μl）。經轉染后的神經干細胞繼續(xù)置入37 ℃、5 %CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，，每3 d換液1次。神經干細胞培養(yǎng)7 d后鏡下觀察轉染后神經干細胞的分化情況。

1.2.2 大鼠BMSCs的培養(yǎng)與鑒定 取4 w左右SPF級大鼠的雙側下肢骨，打開骨髓腔，10 ml培養(yǎng)液（含1萬U肝素）沖洗，加入3 ml Ficoll-Paque分離液，梯度離心，吸取中間界面層，PBS液沖洗3次，制成單細胞懸液，接種于aMEM培養(yǎng)基（含有10%FBS，100 U/ml青霉素，100 mg/ml鏈霉素），置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃、5 %CO2），每3 d換液1次，去除未貼壁細胞，至細胞融合時胰蛋白酶消化收集，傳代并檢測CD29，CD34，CD90。

1.2.3 大鼠SCI模型的創(chuàng)建、分組及序貫移植治療 實驗所用器械、場地均由安徽醫(yī)科大學動物實驗中心提供，取250 g左右的SPF級大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，暴露胸9脊髓（見圖1），采用改良的Allen裝置制作大鼠脊髓損傷模型。脊髓損傷局部明膠海綿填塞止血，常規(guī)肌肉、筋膜、表皮3層縫合。術后3 d每天予青霉素（50000 U/Kg）在大腿處肌注。每6 h人工輔助排小便1次直至恢復自主排便。將48只脊髓損傷大鼠隨機分配為對照組和實驗組，每組各24只，分籠飼養(yǎng)，實驗大鼠出現(xiàn)死亡后以同樣標準再次建模遞補。序貫移植治療：對照組（標記神經干細胞移植組，A組，24只）：T9脊髓損傷后3 d經尾靜脈注射含單細胞濃度為1×106/ml的POLY-M慢病毒轉染后的NSCs條件培養(yǎng)液2 ml；實驗組（序貫移植組，B組，24只）：T9脊髓損傷后1 d經尾靜脈注射含單細胞濃度為1×106/ml的BMSCs條件培養(yǎng)液1ml，脊髓損傷后3d經尾靜脈注射含單細胞濃度為2×106/ml的POLY-M慢病毒轉染后的NSCs條件培養(yǎng)液1 ml。

1.2.4 大鼠神經功能評價 由本課題組兩名熟悉BBB標準得分的研究生對A、B 兩組大鼠進行BBB評分：將大鼠放入一開口大盆，輕敲盆壁使它爬行，觀察它的臀部、后肢關節(jié)、爪的置放在行走時與軀干的關系情況。術前3 d，每天早晨9點將大鼠放入大盆中，使其熟悉環(huán)境。在術后24 h、72 h、1 w、2 w、3 w、4 w、6 w、8 w時每日晨9點分別對A、B 組進行盲法評分（兩位觀察者未參與建模，兩組大鼠觀察前后由實驗者抓?。恐恍栌^察5 min，由實驗者記錄評分。

1.2.5大鼠脊髓標本制備和組織學檢測 分別于移植后1 w，3 w，6 w，8 w處死大鼠，用10%福爾馬林進行灌注固定，以T9脊髓損傷處為中心取長2 cm脊髓，連續(xù)20 μm厚度縱切SCI處脊髓標本，行蘇木精-伊紅（HE）染色和MAP-2、GFAP、RECA免疫熒光染色，觀察脊髓空洞形成情況，神經干細胞分化生長情況，以及脊髓膠質疤痕大小。

1.2.6 計算脊髓空洞體積 在移植后6 w處死大鼠，經灌注法獲得 A、B組脊髓標本， 制成石蠟切片張切片脊髓空洞的面積，計算出每個標本損傷區(qū)中心的脊髓空洞體積。

1.2.7 免疫組化染色和光密度分析 將A、B組的脊髓切片60 ℃烘烤60 min；二甲苯浸泡10 min，更換二甲苯浸泡10 min；分別用無水、95%、85%、70%乙醇浸泡5 min；PBS浸泡5 min，清洗3次；將切片放入耐高溫塑料染色架，再將耐高溫塑料染色架放入燒杯中，加入抗原修復緩沖液，高火煮沸，保持微沸狀態(tài)20 min，而后將裝有玻片的燒杯浸入流水中，自然冷卻；PBS浸泡5 min，清洗3次；3%H2O2-甲醇溶液浸泡15 min；PBS浸泡5min，清洗3次；加入一抗 100 μl，37 ℃，濕盒孵育2 h；PBS浸泡5 min，清洗3次；加入增強劑50 μl，37 ℃濕盒孵育20 min；加入酶標二抗50 μl， 37 ℃濕盒孵育20 min；PBS浸泡5 min，清洗5次；每張片子加2滴新鮮配制的DAB溶液；鏡下觀察染色深淺，染好立即中止，用自來水輕柔沖洗15 min用蒸餾水終止顯色反應；蘇木素染液染色。分別用70%、85%、95%、無水乙醇各浸泡5 min。兩次二甲苯浸泡，各10 min。晾干后在切片上加中性樹膠，加蓋玻片。應用美國Media Cybernetics 公司專業(yè)圖片分析軟件Image-Pro Plus 6.0分別對A、B組切片進行免疫組化光密度分析 。endprint

1.3統(tǒng)計學處理

本實驗所得數據均采用SPSS 19軟件進行統(tǒng)計分析，數據以（x±s）表示，多組均數之間比較采用方差分析，兩組均數間比較行t檢驗，結果以（P≤0.05） 為差異有顯著性意義。

2結果

2.1 NSCs的形態(tài)觀察及鑒定

原代NSCs細胞接種3 d后鏡下觀察：可見NSCs呈多個懸浮細胞團，到第7 d時培養(yǎng)瓶內可見球狀的細胞集落，生長數目達數十甚至上百個， 細胞團狀似桑葚，有較強折光性，少數細胞貼壁，未見明顯細胞突起形成，見圖2。將培養(yǎng)7 d的懸浮NSCs進行慢病毒轉染實驗，確定神經干細胞最佳的MOI值為10，見圖3。

2.2大鼠行為學評價結果

脊髓損傷3 d內，兩組大鼠的BBB評分都較低差異沒有統(tǒng)計學意義，自大鼠脊髓損傷1 w后，間充質干細胞與神經干細胞序貫移植處理的實驗組大鼠BBB評分高于神經干細胞靜脈移植處理的對照組，差異有統(tǒng)計學意義（t=-5.818， P=0.004），見表1。

2.3脊髓空洞體積

對NSCs/序貫移植術后1 w，6 w的A組和B組大鼠行經心臟灌注法處死，固定脊髓段，切片制作標本并進行 HE 染色后，用 Image J1.38檢測損傷區(qū)脊髓空洞體積顯示：1 w時，A 、B兩組大鼠脊髓損傷區(qū)可見明顯的脊髓空洞，體積差異無統(tǒng)計學；6 w時，B組大鼠脊髓損傷區(qū)脊髓空洞（0.17±0.08）mm3 較A組（0.39±0.09）mm3 體積小，見圖4，得知對照組和實驗組之間的差別具有統(tǒng)計學意義（t=3.164， P=0.034）。

2.4組織學評價結果

2.4.1 MAP-2結果及光密度分析 對NSCs/序貫移植術后3 w的A組和B組大鼠行經心臟灌注法處死，固定脊髓段，切片制作標本并進行MAP-2染色后，鏡下觀察序貫移植組損傷區(qū)及周圍MAP-2陽性表達排列完整呈短束狀，染色較強，形態(tài)規(guī)則，染色均勻；而NSCs移植組損傷區(qū)及周圍MAP-2陽性表達排列紊亂，染色明顯較少較淡。用 Image-Pro Plus 6.0檢測損傷區(qū)MAP-2光密度顯示，經過序貫靜脈移植處理的實驗（B）組大鼠脊髓損傷區(qū)MAP-2陽性積分光密度（129765±9617）較對照（A）組（90806± 9046）體積大，見圖5，得知對照組和實驗組之間的差別具有統(tǒng)計學意義（t=-5.315，P=0.006）。

2.4.2 GFAP染色結果及光密度分析 對NSCs/序貫移植術后3 w的A組和B組大鼠行經心臟灌注法處死，固定脊髓段，切片制作標本并進行GFAP染色后，鏡下觀察可見序貫移植組與NSCs靜脈移植處理的對照組GFAP皆呈點狀表達，而對照組表達高于序貫移植組。 用Image-Pro Plus 6.0檢測損傷區(qū)GFAP光密度顯示，經過序貫靜脈移植處理的實驗（B）組大鼠脊髓損傷區(qū)GFAP陽性積分光密度（37462±4230）較對照（A）組（89288±3992）體積小，見圖6，得知對照組和實驗組之間的差別具有統(tǒng)計學意義（t=15.868，P=0.001）。

由兩組SCI大鼠術后BBB評分對比可知：在損傷3 d內兩組大鼠的運動功能均未恢復，3 d后兩組大鼠運動功能開始恢復且序貫組大鼠比對照組大鼠恢復更快，至第8 w兩組大鼠BBB評分趨于穩(wěn)定，序貫組大鼠的神經功能恢復更好；由兩組SCI大鼠治療后脊髓損傷區(qū)脊髓空洞結果對比可知：在1 w時，兩組大鼠脊髓損傷區(qū)的脊髓空洞體積差異不大，而在6 w時，序貫移植組脊髓空洞體積較對照組更?。挥蓛山MSCI大鼠治療后脊髓損傷區(qū)MAP-2、GFAP免疫組化染色對比可知：序貫組大鼠脊髓損傷區(qū)神經元特異標記物MAP-2的細胞明顯增多，而星形膠質細胞的特異性標記物GFAP的細胞明顯減少，可見NSCs向神經元分化增多，而向星形膠質細胞分化減少。

3討論

脊髓損傷后損傷部位會形成抑制NSCs的存活，定植及分化的微環(huán)境：脊髓損傷后局部的出血、炎癥、缺血、乏氧及高酸性環(huán)境影響NSCs的生存和定植 ；如前炎癥因子：腫瘤壞死因子a（tumor necrosis factor-alpha TNFa）可通過激活Bcl-2家族的PUMA誘導神經前體細胞的凋亡[4]；而損傷后免疫系統(tǒng)的激活加重了對NSCs的損害；其又可通過加重膠質疤痕的形成阻礙已分化神經細胞的生長[8]，當神經細胞觸及到膠質疤痕后即引發(fā)生長的停滯[9]；而由此引起脊髓空洞的擴大干擾了NSCs的生存、分化及神經元軸突的延伸，使得神經干細胞主要分化為膠質細胞，形成大量瘢痕組織，而極少分化為神經元[4，10]。

在2013年，F(xiàn)orostyak提出了間充質干細胞能改善脊髓損傷的微環(huán)境。同時在體外，本課題組已證實大鼠的BMSC-CM能夠促進NSCs貼壁分化為神經元和神經膠質細胞。眾所周知，神經元細胞是脊髓中主要的功能細胞，有利于脊髓損傷功能的改善；而星形膠質細胞主要形成膠質疤痕，其增多不利于SCI的修復和功能改善。本實驗證明在體內，MSCs與NSCs序貫移植后大鼠脊髓損傷區(qū)NSCs向神經元分化增多，而向星形膠質細胞分化減少，序貫移植治療能夠促進脊髓損傷后神經功能的恢復、減小脊髓空洞體積?？梢哉J為MSCs可促進了NSCs的有效分化，減少膠質化傾向，有利于治療SCI。

目前關于序貫治療仍是一片空白，本實驗組提出的這種觀點是基于以往的多項研究成果，既然間充質干細胞可以改變脊髓損傷區(qū)的微環(huán)境從而減少神經干細胞死亡，而神經干細胞又是目前來說研究的最成熟的可以用于細胞移植治療SCI的人體細胞，那么我們可以將間充質干細胞與神經干細胞結合，首先利用間充質干細胞移植到脊髓損傷局部，改善脊髓損傷部位的微環(huán)境，使之有利于神經細胞的生存，再移植神經干細胞來治療脊髓損傷，讓神經干細胞更好的發(fā)揮替代治療效應。序貫移植治療可以作為突破脊髓損傷難以治療這個難題的一個方向，在未來的研究中我們要做更深入的探索——間充質干細胞在體內分泌了什么物質影響微環(huán)境，這種物質可以被替代嗎？序貫移植的最佳時機？神經干細胞還可以與什么細胞聯(lián)合？等等以上問題都是我們未來需要探索的。endprint

本實驗由于技術和時間關系無法完成大體示蹤。有關研究可在今后進行。

4 結論

經本次完整實驗后可得出結論，骨髓間充質干細胞與神經干細胞序貫靜脈移植修復大鼠脊髓損傷時BMSCs可促進了NSCs的有效分化，減少膠質化傾向，同時 BMSCs減輕了局部炎性反應，減少脊髓空洞和疤痕形成，序貫移植治療有利于脊髓損傷的修復和功能改善。

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編輯/成森endprint