高山+宋高臣+許曉義

【摘要】 目的：研究半枝蓮多糖（scutellaria barbata polysaccharides，SBP）對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞活性的影響。方法：利用不同質(zhì)量濃度半枝蓮多糖處理SGC-7901胃癌細(xì)胞，對(duì)SBP處理后的SGC-7901進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，利用MTT法檢測(cè)半枝蓮多糖對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的細(xì)胞活性的影響；采用熒光定量RT-PCR對(duì)SGC-7901細(xì)胞中的野生型P53基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：經(jīng)SBP處理后胃癌細(xì)胞SGC-7901的細(xì)胞數(shù)明顯減少，SBP對(duì)SGC-7901的細(xì)胞活性的抑制呈劑量依賴性，其中20 μg/ml SBP組的活性抑制率最高，野生型P53基因表達(dá)量隨SBP質(zhì)量濃度升高而增加，10、20 μg/ml SBP組P53基因的表達(dá)量高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論：半枝蓮多糖通過上調(diào)抑癌基因P53以抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長(zhǎng)活性。

【關(guān)鍵詞】 半枝蓮多糖； 胃癌； 增殖抑制； 基因表達(dá)調(diào)控； 細(xì)胞培養(yǎng)

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.15.001 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1674-6805（2017）15-0001-02

Influence of Scutellaria Barbata Polysaccharide on the Cell Activity of Gastric Carcinoma Cell SGC-7901/GAO Shan，SONG Gao-chen，XU Xiao-yi.//Chinese and Foreign Medical Research，2017，15（15）：1-2

【Abstract】 Obejective：To study the effect of SBP（scutellaria barbata polysaccharides） on SGC-7901 gastric cancer cellular activity.Method：SGC-7901 gastric carcinoma cell was handled with SBP in different mass concentration，the cellular activity that SGC-7901 under the treatment of SBP was observed by MTT，the expression of wt-P53 gene was detected in SGC-7901 including which cultured by SBP.Result：The count of SGC-7901 which had been handled by SBP reduced significantly， the depression of cellular activity had dose-dependent，the most obvious depressive activity was in the 20 μg/ml SBP group，the level of wt-P53 expression in SBP cultured SGC-7901 cell group elevated with the increase of mass concentration of SBP.The level of P53 expression in the 10 and 20 μg/ml

SBP group were higher than the negative control，the differences were statistically significant（P<0.01）.Conclusion：SBP depresses the growth of SGC-7901 gastric tumor cell by upregulating P53 gene.

【Key words】 Scutellaria barbata polysaccharides； Gastric cancer； Depression of proliferation； Regulation of genome expression； Cell culture

First-authors address：Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China

半枝蓮（Scutellaria barbata），作為一種民間常用中草藥，其性寒，味辛、苦，具有清熱解毒、散癖止血、利尿消腫等功效，常用于治療咽喉腫痛、跌打傷痛、療瘡腫毒、水腫、黃疽、蛇蟲咬傷等[1]?，F(xiàn)代研究及臨床數(shù)據(jù)證明，半枝蓮具有良好的抗腫瘤活性，療效確切，主治原發(fā)性肝癌等消化道腫瘤、肺癌及宮頸癌等婦科腫瘤[2]。半枝蓮多糖（Scutellaria barbata polysaccharides，SBP）是半枝蓮中的重要多糖成分，前期研究發(fā)現(xiàn)其具有對(duì)化療藥物環(huán)磷酰胺的增效減毒作用以及對(duì)肝癌SMMC-7721明顯的生長(zhǎng)抑制作用。本研究通過對(duì)半枝蓮多糖對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)活性及其對(duì)野生型P53抑癌基因影響的研究，以探索半枝蓮多糖對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SGC-7901胃癌細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)），RPMI 1640培養(yǎng)基（Hyclone）；FBS胎牛血清（solar bio）；胰酶（solar bio）；噻唑藍(lán)（MTT，Sigma）；DMSO（Sigma）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；半枝蓮粗多糖（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生化教研室制備）；總RNA提取試劑盒（ThermoFisher）；Taq DNA Polymerase（合生基因）；SYBR ExScriptYMRT-PCR Kit（中國(guó)Gene Pharma 公司）；引物（上海生工生物工程有限公司合成）。

1.2 方法

1.2.1 半枝蓮多糖的制備 取半枝蓮粗多糖干燥粉末按照1∶4的比例在45 ℃溫水中浸提2 h。加入4倍體積95%乙醇攪拌，室溫靜置6 h，離心（12000 rpm，15 min）收集沉淀；沉淀經(jīng)乙醚去脂、氨水脫色、三氯乙酸法脫蛋白，重復(fù)實(shí)驗(yàn)并以硫酸-苯酚法跟蹤檢測(cè)，保證多糖含量在90%以上。將沉淀用蒸餾水溶解，在液氮中冷凍8 h后取出，用凍干機(jī)冷凍48 h，取出凍干粉，將凍干粉溶于適量蒸餾水中，用無菌濾膜過濾器過濾除菌兩次，收集濾液并計(jì)算濃度，過濾過程采用無菌操作。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)SGC-7901胃癌細(xì)胞株，在37 ℃、5%CO2環(huán)境下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代。取呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 半枝蓮多糖對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SGC-7901胃癌細(xì)胞用胰酶（EDTA）消化后制備細(xì)胞懸液，并將其以每孔細(xì)胞濃度為5×103個(gè)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h使細(xì)胞充分貼壁。種板后在已接種的孔內(nèi)加入不同濃度的半枝蓮多糖（SBP）溶液，并使孔中藥物質(zhì)量濃度分別達(dá)到20、10、5、2.5 μg/ml，RPMI-1640培養(yǎng)基為陰性對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。經(jīng)MTT法處理后[3]，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算不同質(zhì)量濃度的半枝蓮多糖對(duì)SGC-7901的生長(zhǎng)抑制率：p抑制（%）=（1-D藥物組/D對(duì)照組）×100%。式中：D為樣品在490 nm波長(zhǎng)下的吸光度。

1.2.4 胃癌細(xì)胞中P53基因的表達(dá) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SGC-7901細(xì)胞懸液以細(xì)胞濃度5×106個(gè)/ml分別加入5個(gè)培養(yǎng)瓶中，以藥物質(zhì)量濃度為0、2.5、5、10、20 μg/ml分別加入各個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。用總RNA提取試劑盒提取RNA。取1 μg總RNA進(jìn)行熒光定量RT-PCR擴(kuò)增P53基因。P53上游引物：TGTGGAGTATTTGGATGACA，下游引物：GAACATGAGTTTTTTATGGC；內(nèi)參基因β-actin上游引物：GAGACCTTCAACACCCAGCC，下游引物：GCGGGGCATCGGAACCGCTCA。反應(yīng)體系為25 μl，反應(yīng)條件：42 ℃反轉(zhuǎn)錄1 h，94.0 ℃預(yù)變性5 min，94.0 ℃變性45 s，55.0 ℃退火1 min，72.0 ℃延伸2 min，80.0 ℃收集熒光30 s，共35個(gè)循環(huán)。根據(jù)CT值分析P53基因的表達(dá)[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

選用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較用單因素方差分析，P<0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組藥物質(zhì)量濃度對(duì)SGC-7901生長(zhǎng)的影響

細(xì)胞個(gè)數(shù)隨藥物質(zhì)量濃度升高而遞減，見圖1。各SBP組細(xì)胞在490 nm波長(zhǎng)的吸光度均明顯低于陰性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），質(zhì)量濃度20 μg/ml的半枝蓮多糖對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901抑制作用最強(qiáng)，見表1。

2.2 半枝蓮多糖干預(yù)后的SGC-7901胃癌細(xì)胞P53基因的表達(dá)

熒光定量RT-PCR結(jié)果表明，半枝蓮多糖對(duì)抑癌基因P53的表達(dá)具有明顯的上調(diào)作用，其表達(dá)量隨藥物質(zhì)量濃度升高而增加，與陰性對(duì)照組相比，各劑量組的上調(diào)倍數(shù)分別為1.06、1.31、1.08、2.06倍，其中，在20 μg/ml SBP組中P53上調(diào)結(jié)果最為明顯，10、20 μg/ml SBP組P53基因的表達(dá)量高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表2、圖2。

3 討論

胃癌是威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病因素廣泛且機(jī)制復(fù)雜，臨床上多采用外科手術(shù)與放化療聯(lián)合的方法進(jìn)行治療，但是創(chuàng)傷大、復(fù)發(fā)率高等諸多不足仍然是困擾醫(yī)學(xué)工作者的難題[5]。中藥多糖作為中草藥的有效成分之一在近年來也是國(guó)內(nèi)的研究熱點(diǎn)，眾多研究表明中藥多糖對(duì)胃癌細(xì)胞的生成、轉(zhuǎn)移、凋亡等諸多階段有不同的作用，韓澄等[6]發(fā)現(xiàn)青錢柳多糖能抑制胃癌MGC803細(xì)胞生長(zhǎng)，并促使其凋亡；吉愛軍等發(fā)現(xiàn)樹舌多糖通過抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901中的Cyclin D1、P16的表達(dá)來發(fā)揮其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用[7]。

P53基因是一種重要的抑癌基因，分為野生型和突變型，野生型即正常的P53基因（wt-P53），主要通過產(chǎn)生P53蛋白來調(diào)控細(xì)胞的增值過程以防止細(xì)胞發(fā)生癌變[8]。P53與多數(shù)靶基因的表達(dá)有關(guān)，并影響腫瘤細(xì)胞周期、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡、DNA損傷等諸多作用[9]。

本研究結(jié)果表明：胃癌細(xì)胞SGC-7901在半枝蓮多糖的作用下細(xì)胞數(shù)目減少，在細(xì)胞活性方面，不同質(zhì)量濃度的半枝蓮多糖均可抑制SGC-7901的細(xì)胞活性，并隨計(jì)量增大而活性降低。在基因水平的研究中，不同質(zhì)量濃度的半枝蓮多糖干預(yù)后的SGC-7901細(xì)胞，其野生型P53基因的表達(dá)量隨藥物質(zhì)量濃度的升高而增加，其中，在20 μg/ml半枝蓮多糖干預(yù)下的SCG-7901細(xì)胞P53基因表達(dá)量是無藥物干預(yù)時(shí)的2.06倍，10、20 μg/ml SBP組P53基因的表達(dá)量高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。綜上所述，半枝蓮多糖能抑制胃癌細(xì)胞SCG-7901的增殖，其機(jī)制可能與上調(diào)P53基因表達(dá)有關(guān)。

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