黃海軍+高其雙+彭霞等

摘要：動(dòng)物生物制品生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)胞（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是個(gè)世界性問(wèn)題。細(xì)胞支原體污染可顯著影響生產(chǎn)用細(xì)胞的培養(yǎng)及生物功能的發(fā)揮，最終影響生物制品的生產(chǎn)，給生物制品企業(yè)造成巨大損失，建立高效、快速、敏感度高的檢測(cè)方法十分必要。建立了一種支原體巢式PCR檢測(cè)方法，該方法高效、快速、靈敏，可以最大限度降低假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。該方法的建立對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物疫苗等生物制品企業(yè)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化管理有一定的借鑒意義。

關(guān)鍵詞：支原體；細(xì)胞培養(yǎng)；巢式PCR；生物制品

中圖分類號(hào)：S858.28；Q95 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）03-0690-03

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中支原體污染主要來(lái)源于所使用的動(dòng)物源的一些培養(yǎng)材料，如血清、已被支原體污染的細(xì)胞株（系）或者是經(jīng)操作人員傳播。污染培養(yǎng)細(xì)胞的支原體一般有寄生于人、牛、豬或狗的少數(shù)幾種類型。細(xì)胞培養(yǎng)液中支原體的濃度可達(dá)1×107個(gè)/mL，而不管是肉眼觀察還是普通顯微鏡下觀察，受支原體污染的細(xì)胞狀態(tài)并無(wú)明顯變化[1]。但是，越來(lái)越多的研究表明，支原體感染發(fā)生后能改變細(xì)胞的DNA、RNA及蛋白表達(dá)，使研究結(jié)果的真實(shí)性和可靠性大大下降[2，3]。由于競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)及支原體有毒的代謝產(chǎn)物，支原體污染可顯著影響生產(chǎn)用細(xì)胞的培養(yǎng)及相應(yīng)生物學(xué)功能的發(fā)揮，影響生物制品的質(zhì)量。細(xì)胞被支原體污染長(zhǎng)期困擾著疫苗（特別是生產(chǎn)弱毒苗）的生產(chǎn)企業(yè)，增加了企業(yè)生產(chǎn)、投資的風(fēng)險(xiǎn)，特別是在競(jìng)爭(zhēng)日益激烈的當(dāng)代社會(huì)，這種風(fēng)險(xiǎn)對(duì)疫苗生產(chǎn)企業(yè)來(lái)說(shuō)通常是致命的。因此，建立一種高效、快速、敏感度高的檢測(cè)方法十分必要。

目前，普遍公認(rèn)的細(xì)胞支原體污染檢測(cè)方法為分離培養(yǎng)法，該方法耗時(shí)、敏感性低，甚至可能出現(xiàn)二次污染，影響結(jié)果的判斷。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR方法已經(jīng)成為一種常用的有效檢測(cè)培養(yǎng)困難和抗原性復(fù)雜的微生物的方法[4，5]。本研究建立了一種細(xì)胞支原體巢式PCR檢測(cè)方法，最大限度降低了假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，以期為完善細(xì)胞支原體的檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種：豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）濟(jì)南系強(qiáng)毒（菌號(hào)CVCC354）購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

供試試劑與儀器：Taq DNA polymerase（2.5 U/μL）、10×PCR Buffer、dNTP（2.5 mmol/L）、DNA凝膠回收與純化試劑盒購(gòu)自武漢天源生物技術(shù)公司，對(duì)比用支原體PCR檢測(cè)試劑盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）由以色列BI公司生產(chǎn)。9700型PCR 儀由美國(guó)ABI公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物 根據(jù)12種常見(jiàn)類型支原體（M. hyorhinis、M. orale、M. hyopneumoniae、M. arginini、

1.2.2 PCR檢測(cè)方法的建立

1）陽(yáng)性PCR模板的制備：將豬肺炎支原體培養(yǎng)液沸水水浴10 min，再3 000 r/min離心10 min，取上清液作為支原體陽(yáng)性PCR擴(kuò)增的陽(yáng)性模板。

2）陽(yáng)性支原體的檢測(cè)：第一輪PCR反應(yīng)體系25 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，陽(yáng)性引物Myc-F1和Myc-R1（10 μmol/L）各0.5 μL，陽(yáng)性模板1 μL，Taq DNA 酶（2.5 U/μL） 0.25 μL，加ddH2O至25 μL。同時(shí)以ddH2O為陰性對(duì)照。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。第一輪PCR反應(yīng)結(jié)束后，取1 μL PCR產(chǎn)物作為第二輪PCR反應(yīng)的模板，反應(yīng)體系其他成分及反應(yīng)條件同第一輪PCR。分別取第一輪和第二輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，然后對(duì)目的片段進(jìn)行純化，作為PCR陽(yáng)性模板備用。

3）陽(yáng)性Mhp模板稀釋倍數(shù)的確定：按1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6濃度梯度稀釋Mhp陽(yáng)性產(chǎn)物，固定體系其他成分不變進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，選擇最適濃度作為Mhp陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。

4）反應(yīng)條件的優(yōu)化：Taq DNA 酶最適使用量的確定，按最適引物濃度，優(yōu)化Taq DNA 酶 （2.5 U/μL）的使用量，分別為0.125、0.25、0.5 μL；dNTP最適使用量的確定，反應(yīng)體系中dNTP（2.5 mmol/L）的使用量分別為1、2、3 μL。反應(yīng)體系中其他成分和反應(yīng)條件均不改變。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，確定最適濃度配比。

1.2.3 應(yīng)用 從武漢某疫苗生產(chǎn)車間隨機(jī)選取3個(gè)批次共10個(gè)疑似支原體污染的樣本，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。3 000 r/min離心5 min，沉淀培養(yǎng)液中殘留的細(xì)胞，然后取上清液5 μL備用。按本研究建立的巢式PCR反應(yīng)體系及條件，對(duì)各樣本的兩種平行樣品進(jìn)行檢測(cè)。并將結(jié)果與EZ-PCR Mycoplasma 檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。將兩種方法檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品依次進(jìn)行10-1～10-4梯度稀釋，分別用本研究建立的方法和支原體PCR檢測(cè)試劑盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）進(jìn)行檢測(cè)，比較兩者的靈敏度。將本方法診斷陽(yáng)性的樣品進(jìn)行病原培養(yǎng)，驗(yàn)證其檢測(cè)準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的建立

經(jīng)PCR擴(kuò)增得到654 bp的Mhp基因片段，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1）。測(cè)定回收的Mhp陽(yáng)性模板濃度為13.6 μg/mL，結(jié)果表明， Mhp陽(yáng)性模板的稀釋倍數(shù)為1×10-5 時(shí)，條帶清晰（圖1），考慮到檢測(cè)條件及產(chǎn)物的穩(wěn)定性，將標(biāo)準(zhǔn)品濃度定為2×10-4 μg/mL，即0.2 ng/mL。

2.2 巢式PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

在反應(yīng)條件及體系其他成分不變的同時(shí)，分別對(duì)Taq DNA酶和dNTP使用量進(jìn)行優(yōu)化，并根據(jù)第一次和第二次PCR擴(kuò)增結(jié)果，確定反應(yīng)體系中Taq DNA酶和dNTP最佳使用量分別為0.25、2 μL。

2.3 巢式PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用

用所建立的巢式PCR檢測(cè)方法對(duì)收集的10個(gè)疑似支原體污染樣品進(jìn)行檢測(cè)，第一輪PCR擴(kuò)增結(jié)果和第二輪擴(kuò)增結(jié)果分別見(jiàn)圖2和圖3。

將PCR產(chǎn)物回收送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，并與Genbank中登錄的相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果分別為100%、99.26%、99.19%和99.19%。最終確定2號(hào)樣品為豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）陽(yáng)性，7號(hào)樣品為口腔支原體（Mycoplasma orale）陽(yáng)性，4號(hào)樣品和8號(hào)樣品均為豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis）陽(yáng)性。該結(jié)果與BI公司的EZ-PCR Mycoplasma 檢測(cè)結(jié)果完全一致。

將4個(gè)檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品依次進(jìn)行10-1～10-4倍梯度稀釋，再作為模板，分別用本研究建立的方法和EZ-PCR Mycoplasma Test Kit進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，2種方法均可檢測(cè)到稀釋10-3倍的模板，符合率達(dá)100%。

3 小結(jié)與討論

支原體是一種介于細(xì)菌和病毒之間的能獨(dú)立生存的最小微生物，直徑0.1～0.3 μm，因無(wú)細(xì)胞壁故具有可塑性，可通過(guò)濾菌器，對(duì)于一般抗生素的耐受更使其難以清除，是細(xì)胞培養(yǎng)污染的一個(gè)重要因素[6]。動(dòng)物疫苗生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)胞（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是個(gè)世界性問(wèn)題。已有許多調(diào)查及研究顯示，美國(guó)和歐洲正在使用的細(xì)胞系中的支原體污染率為10%～15%[7]，德國(guó)微生物和培養(yǎng)細(xì)胞保藏中心（DSMZ）的研究顯示，世界范圍內(nèi)細(xì)胞系的支原體污染率在15%～50%[8，9]，而國(guó)內(nèi)使用的細(xì)胞系中的支原體的污染更為嚴(yán)重，使得生物制品企業(yè)面臨的形勢(shì)極為嚴(yán)峻[1]。

支原體感染細(xì)胞后，并不引起細(xì)胞形態(tài)及功能的急性改變，不易被察覺(jué)，但是細(xì)胞支原體污染卻給疫苗生產(chǎn)帶來(lái)致命打擊。因此，在疫苗生產(chǎn)早期對(duì)細(xì)胞支原體污染進(jìn)行監(jiān)測(cè)具有重要意義。

Dussurget等[10]和Kong等[11]研究發(fā)現(xiàn)，PCR檢測(cè)支原體的引物選用16S rRNA序列保守區(qū)，難以在保證特異性強(qiáng)的情況下擴(kuò)增出所有常見(jiàn)支原體污染種別的DNA，導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。本研究根據(jù)常見(jiàn)支原體16S～23S間隔區(qū)種別特異性序列，設(shè)計(jì)2對(duì)用于巢式擴(kuò)增支原體的引物，可以準(zhǔn)確檢測(cè)12種常見(jiàn)支原體，這12種常見(jiàn)支原體代表了98%以上的細(xì)胞支原體污染源。本方法檢測(cè)整個(gè)過(guò)程耗時(shí)不超過(guò)6 h，且設(shè)置了陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，避免了假陰性和假陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果與以色列BI公司支原體PCR檢測(cè)試劑盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）和傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定結(jié)果相一致，也證實(shí)了其檢測(cè)的可靠性和靈敏性。因此，該方法有望在細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物疫苗等生物制品企業(yè)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化管理中得到廣泛應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉玉琴.體外培養(yǎng)細(xì)胞工作中支原體污染及對(duì)策[J].中華病理學(xué)雜志，2004，33（6）：571-572.

[2] FENG S H， TSAI S， RODRIGUEZ J， et al. Mycoplasmal infections prevent apoptosis and induce malignant transformation of interleukin-3-dependent 32D hematopoietic cells[J]. Mol Cell Biol，1999，19（12）：7995-8002.

[3] SCHMIDHAUSER C， DUDLER R， SCHMIDT T， et al. A mycoplasmal protein influence tumor cell invasiveness and contact inhibition in vitro[J]. J Cell Sci，1990，95：499-506.

[4] 戴 悅，呂允威，張春鳳，等.細(xì)胞系中支原體檢測(cè)及分型[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2005，37（2）：207-210.

[5] 甘一迪，王銀銀，任芳麗，等.培養(yǎng)細(xì)胞污染支原體的PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2011，6（4）：295-298.

[6] FLEEKENSTELN E， UPHOFFC C C， DREXLER H G. Effective treatment of mycoplasma contamination in cell lines with enrofloxacin （Baytril）[J]. Leukemia，1994，8（8）：1424-1434.

[7] TULLY J G. Diagnosis of Mycoplasma Infection of Cell Cultures[M]. TULLY J G， RAZIN S. Molecular and Diagnostic Procedures in Mycoplasmology. Vol Ⅱ， diagnostic procedures. San Diego： Academic Press，1996.405-410.

[8] UPHOFF C C， DREXLER H G. Comparative PCR analysis for detection of mycoplasma infections in continuous cell lines [J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim，2002，38（2）：79-85.

[9] WINNER F， ROSENGARTEN R， CITTI C. In vitro cell invasion of Mycoplasma galisepticum[J]. Infect Immun，2000，68（7）：4238-4244.

[10] DUSSURGET O，ROULLAND-DUSSOIX D. Rapid， sensitive PCR-based detection of mycoplasmas in simulated samples of animal sem[J].Appl Environ Microbio1，1994，60（3）：953-959.

[11] KONG F，JAMES G，GORDON S，et al. Species-specific PCR for identification of common contaminant mollicutes in cell culture[J].Appl Environ Microbiol，2001，67（7）：3195-3200.

2.2 巢式PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

在反應(yīng)條件及體系其他成分不變的同時(shí)，分別對(duì)Taq DNA酶和dNTP使用量進(jìn)行優(yōu)化，并根據(jù)第一次和第二次PCR擴(kuò)增結(jié)果，確定反應(yīng)體系中Taq DNA酶和dNTP最佳使用量分別為0.25、2 μL。

2.3 巢式PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用

用所建立的巢式PCR檢測(cè)方法對(duì)收集的10個(gè)疑似支原體污染樣品進(jìn)行檢測(cè)，第一輪PCR擴(kuò)增結(jié)果和第二輪擴(kuò)增結(jié)果分別見(jiàn)圖2和圖3。

將PCR產(chǎn)物回收送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，并與Genbank中登錄的相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果分別為100%、99.26%、99.19%和99.19%。最終確定2號(hào)樣品為豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）陽(yáng)性，7號(hào)樣品為口腔支原體（Mycoplasma orale）陽(yáng)性，4號(hào)樣品和8號(hào)樣品均為豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis）陽(yáng)性。該結(jié)果與BI公司的EZ-PCR Mycoplasma 檢測(cè)結(jié)果完全一致。

將4個(gè)檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品依次進(jìn)行10-1～10-4倍梯度稀釋，再作為模板，分別用本研究建立的方法和EZ-PCR Mycoplasma Test Kit進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，2種方法均可檢測(cè)到稀釋10-3倍的模板，符合率達(dá)100%。

3 小結(jié)與討論

支原體是一種介于細(xì)菌和病毒之間的能獨(dú)立生存的最小微生物，直徑0.1～0.3 μm，因無(wú)細(xì)胞壁故具有可塑性，可通過(guò)濾菌器，對(duì)于一般抗生素的耐受更使其難以清除，是細(xì)胞培養(yǎng)污染的一個(gè)重要因素[6]。動(dòng)物疫苗生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)胞（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是個(gè)世界性問(wèn)題。已有許多調(diào)查及研究顯示，美國(guó)和歐洲正在使用的細(xì)胞系中的支原體污染率為10%～15%[7]，德國(guó)微生物和培養(yǎng)細(xì)胞保藏中心（DSMZ）的研究顯示，世界范圍內(nèi)細(xì)胞系的支原體污染率在15%～50%[8，9]，而國(guó)內(nèi)使用的細(xì)胞系中的支原體的污染更為嚴(yán)重，使得生物制品企業(yè)面臨的形勢(shì)極為嚴(yán)峻[1]。

支原體感染細(xì)胞后，并不引起細(xì)胞形態(tài)及功能的急性改變，不易被察覺(jué)，但是細(xì)胞支原體污染卻給疫苗生產(chǎn)帶來(lái)致命打擊。因此，在疫苗生產(chǎn)早期對(duì)細(xì)胞支原體污染進(jìn)行監(jiān)測(cè)具有重要意義。

Dussurget等[10]和Kong等[11]研究發(fā)現(xiàn)，PCR檢測(cè)支原體的引物選用16S rRNA序列保守區(qū)，難以在保證特異性強(qiáng)的情況下擴(kuò)增出所有常見(jiàn)支原體污染種別的DNA，導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。本研究根據(jù)常見(jiàn)支原體16S～23S間隔區(qū)種別特異性序列，設(shè)計(jì)2對(duì)用于巢式擴(kuò)增支原體的引物，可以準(zhǔn)確檢測(cè)12種常見(jiàn)支原體，這12種常見(jiàn)支原體代表了98%以上的細(xì)胞支原體污染源。本方法檢測(cè)整個(gè)過(guò)程耗時(shí)不超過(guò)6 h，且設(shè)置了陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，避免了假陰性和假陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果與以色列BI公司支原體PCR檢測(cè)試劑盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）和傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定結(jié)果相一致，也證實(shí)了其檢測(cè)的可靠性和靈敏性。因此，該方法有望在細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物疫苗等生物制品企業(yè)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化管理中得到廣泛應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉玉琴.體外培養(yǎng)細(xì)胞工作中支原體污染及對(duì)策[J].中華病理學(xué)雜志，2004，33（6）：571-572.

[2] FENG S H， TSAI S， RODRIGUEZ J， et al. Mycoplasmal infections prevent apoptosis and induce malignant transformation of interleukin-3-dependent 32D hematopoietic cells[J]. Mol Cell Biol，1999，19（12）：7995-8002.

[3] SCHMIDHAUSER C， DUDLER R， SCHMIDT T， et al. A mycoplasmal protein influence tumor cell invasiveness and contact inhibition in vitro[J]. J Cell Sci，1990，95：499-506.

[4] 戴 悅，呂允威，張春鳳，等.細(xì)胞系中支原體檢測(cè)及分型[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2005，37（2）：207-210.

[5] 甘一迪，王銀銀，任芳麗，等.培養(yǎng)細(xì)胞污染支原體的PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2011，6（4）：295-298.

[6] FLEEKENSTELN E， UPHOFFC C C， DREXLER H G. Effective treatment of mycoplasma contamination in cell lines with enrofloxacin （Baytril）[J]. Leukemia，1994，8（8）：1424-1434.

[7] TULLY J G. Diagnosis of Mycoplasma Infection of Cell Cultures[M]. TULLY J G， RAZIN S. Molecular and Diagnostic Procedures in Mycoplasmology. Vol Ⅱ， diagnostic procedures. San Diego： Academic Press，1996.405-410.

[8] UPHOFF C C， DREXLER H G. Comparative PCR analysis for detection of mycoplasma infections in continuous cell lines [J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim，2002，38（2）：79-85.

[9] WINNER F， ROSENGARTEN R， CITTI C. In vitro cell invasion of Mycoplasma galisepticum[J]. Infect Immun，2000，68（7）：4238-4244.

[10] DUSSURGET O，ROULLAND-DUSSOIX D. Rapid， sensitive PCR-based detection of mycoplasmas in simulated samples of animal sem[J].Appl Environ Microbio1，1994，60（3）：953-959.

[11] KONG F，JAMES G，GORDON S，et al. Species-specific PCR for identification of common contaminant mollicutes in cell culture[J].Appl Environ Microbiol，2001，67（7）：3195-3200.

2.2 巢式PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

在反應(yīng)條件及體系其他成分不變的同時(shí)，分別對(duì)Taq DNA酶和dNTP使用量進(jìn)行優(yōu)化，并根據(jù)第一次和第二次PCR擴(kuò)增結(jié)果，確定反應(yīng)體系中Taq DNA酶和dNTP最佳使用量分別為0.25、2 μL。

2.3 巢式PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用

用所建立的巢式PCR檢測(cè)方法對(duì)收集的10個(gè)疑似支原體污染樣品進(jìn)行檢測(cè)，第一輪PCR擴(kuò)增結(jié)果和第二輪擴(kuò)增結(jié)果分別見(jiàn)圖2和圖3。

將PCR產(chǎn)物回收送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，并與Genbank中登錄的相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果分別為100%、99.26%、99.19%和99.19%。最終確定2號(hào)樣品為豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae）陽(yáng)性，7號(hào)樣品為口腔支原體（Mycoplasma orale）陽(yáng)性，4號(hào)樣品和8號(hào)樣品均為豬鼻支原體（Mycoplasma hyorhinis）陽(yáng)性。該結(jié)果與BI公司的EZ-PCR Mycoplasma 檢測(cè)結(jié)果完全一致。

將4個(gè)檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品依次進(jìn)行10-1～10-4倍梯度稀釋，再作為模板，分別用本研究建立的方法和EZ-PCR Mycoplasma Test Kit進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，2種方法均可檢測(cè)到稀釋10-3倍的模板，符合率達(dá)100%。

3 小結(jié)與討論

支原體是一種介于細(xì)菌和病毒之間的能獨(dú)立生存的最小微生物，直徑0.1～0.3 μm，因無(wú)細(xì)胞壁故具有可塑性，可通過(guò)濾菌器，對(duì)于一般抗生素的耐受更使其難以清除，是細(xì)胞培養(yǎng)污染的一個(gè)重要因素[6]。動(dòng)物疫苗生產(chǎn)過(guò)程中細(xì)胞（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是個(gè)世界性問(wèn)題。已有許多調(diào)查及研究顯示，美國(guó)和歐洲正在使用的細(xì)胞系中的支原體污染率為10%～15%[7]，德國(guó)微生物和培養(yǎng)細(xì)胞保藏中心（DSMZ）的研究顯示，世界范圍內(nèi)細(xì)胞系的支原體污染率在15%～50%[8，9]，而國(guó)內(nèi)使用的細(xì)胞系中的支原體的污染更為嚴(yán)重，使得生物制品企業(yè)面臨的形勢(shì)極為嚴(yán)峻[1]。

支原體感染細(xì)胞后，并不引起細(xì)胞形態(tài)及功能的急性改變，不易被察覺(jué)，但是細(xì)胞支原體污染卻給疫苗生產(chǎn)帶來(lái)致命打擊。因此，在疫苗生產(chǎn)早期對(duì)細(xì)胞支原體污染進(jìn)行監(jiān)測(cè)具有重要意義。

Dussurget等[10]和Kong等[11]研究發(fā)現(xiàn)，PCR檢測(cè)支原體的引物選用16S rRNA序列保守區(qū)，難以在保證特異性強(qiáng)的情況下擴(kuò)增出所有常見(jiàn)支原體污染種別的DNA，導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。本研究根據(jù)常見(jiàn)支原體16S～23S間隔區(qū)種別特異性序列，設(shè)計(jì)2對(duì)用于巢式擴(kuò)增支原體的引物，可以準(zhǔn)確檢測(cè)12種常見(jiàn)支原體，這12種常見(jiàn)支原體代表了98%以上的細(xì)胞支原體污染源。本方法檢測(cè)整個(gè)過(guò)程耗時(shí)不超過(guò)6 h，且設(shè)置了陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，避免了假陰性和假陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果與以色列BI公司支原體PCR檢測(cè)試劑盒（EZ-PCR Mycoplasma Test Kit）和傳統(tǒng)培養(yǎng)法鑒定結(jié)果相一致，也證實(shí)了其檢測(cè)的可靠性和靈敏性。因此，該方法有望在細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物疫苗等生物制品企業(yè)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化管理中得到廣泛應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉玉琴.體外培養(yǎng)細(xì)胞工作中支原體污染及對(duì)策[J].中華病理學(xué)雜志，2004，33（6）：571-572.

[2] FENG S H， TSAI S， RODRIGUEZ J， et al. Mycoplasmal infections prevent apoptosis and induce malignant transformation of interleukin-3-dependent 32D hematopoietic cells[J]. Mol Cell Biol，1999，19（12）：7995-8002.

[3] SCHMIDHAUSER C， DUDLER R， SCHMIDT T， et al. A mycoplasmal protein influence tumor cell invasiveness and contact inhibition in vitro[J]. J Cell Sci，1990，95：499-506.

[4] 戴 悅，呂允威，張春鳳，等.細(xì)胞系中支原體檢測(cè)及分型[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2005，37（2）：207-210.

[5] 甘一迪，王銀銀，任芳麗，等.培養(yǎng)細(xì)胞污染支原體的PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2011，6（4）：295-298.

[6] FLEEKENSTELN E， UPHOFFC C C， DREXLER H G. Effective treatment of mycoplasma contamination in cell lines with enrofloxacin （Baytril）[J]. Leukemia，1994，8（8）：1424-1434.

[7] TULLY J G. Diagnosis of Mycoplasma Infection of Cell Cultures[M]. TULLY J G， RAZIN S. Molecular and Diagnostic Procedures in Mycoplasmology. Vol Ⅱ， diagnostic procedures. San Diego： Academic Press，1996.405-410.

[8] UPHOFF C C， DREXLER H G. Comparative PCR analysis for detection of mycoplasma infections in continuous cell lines [J]. In Vitro Cell Dev Biol Anim，2002，38（2）：79-85.

[9] WINNER F， ROSENGARTEN R， CITTI C. In vitro cell invasion of Mycoplasma galisepticum[J]. Infect Immun，2000，68（7）：4238-4244.

[10] DUSSURGET O，ROULLAND-DUSSOIX D. Rapid， sensitive PCR-based detection of mycoplasmas in simulated samples of animal sem[J].Appl Environ Microbio1，1994，60（3）：953-959.

[11] KONG F，JAMES G，GORDON S，et al. Species-specific PCR for identification of common contaminant mollicutes in cell culture[J].Appl Environ Microbiol，2001，67（7）：3195-3200.