展曉亮 劉 帥 祗明花 李 聰 梁紅玉 佟苗苗 趙麗麗 趙 丁

小檗堿對(duì)糖尿病大鼠腸系膜血管形態(tài)改變的作用*

展曉亮 劉 帥 祗明花 李 聰 梁紅玉 佟苗苗 趙麗麗 趙 丁#

目的：觀察小檗堿對(duì)糖尿病大鼠腸系膜血管病變的干預(yù)作用。方法：24只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和小檗堿組，每組8只。模型組和小檗堿組腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ,55mg/kg)制備糖尿病大鼠模型，對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水。大鼠成模兩周后，小檗堿組灌胃給予小檗堿(200mg/kg)，對(duì)照組和模型組灌胃等量雙蒸水，三組均每日一次，連續(xù)2周，比較各組體重及血糖變化。之后處死各組大鼠，取其腸系膜、各級(jí)血管及其周圍組織制備石蠟切片，HE染色，顯微鏡觀察各組大鼠腸系膜各級(jí)血管管徑及血管和周圍組織的病理學(xué)變化。結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組大鼠實(shí)驗(yàn)28天后體重減輕(P<0.01)，血糖升高(P<0.01)。二、三級(jí)動(dòng)靜脈管徑較對(duì)照組明顯增大(P<0.05或P<0.01)；血管彈性膜分層不清，內(nèi)膜白細(xì)胞黏附增多；血管周圍脂肪組織中脂肪細(xì)胞皺縮，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，神經(jīng)節(jié)腫脹。小檗堿組較模型組體重、血糖無(wú)明顯差異(P>0.05)，但三級(jí)動(dòng)脈管徑和二級(jí)靜脈管徑較模型組明顯收縮(P<0.05或P<0.01)；而且小檗堿組較模型組血管彈性膜分層清晰，內(nèi)膜白細(xì)胞黏附減少；脂肪細(xì)胞形態(tài)、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及神經(jīng)節(jié)形態(tài)均有一定程度的改善。結(jié)論：小檗堿對(duì)糖尿病大鼠腸系膜小血管和微血管及周圍組織的病理變化有一定改善作用。

小檗堿；糖尿?。荒c系膜血管；脂肪組織；大鼠

糖尿病血管病變是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，其機(jī)制可能與血管內(nèi)皮依賴性舒縮功能降低、大血管粥樣硬化、微循環(huán)障礙等有關(guān)[1]。高血糖及促炎因子引起的血管內(nèi)皮活性氧增加、細(xì)胞凋亡及炎癥，可造成血管損傷，尤其是血管內(nèi)皮細(xì)胞受損[2]，進(jìn)而誘發(fā)較多糖尿病性并發(fā)癥。因此糖尿病血管病變成為研究重點(diǎn)[3]。腸系膜具有各種管徑的大、小微血管，常作為臟器血管主要是微血管藥物研究的靶器官。

小檗堿是常用中藥黃連的主要有效成分，不僅能直接降低血糖、血脂和胰島素抵抗，而且對(duì)高血糖、高血脂、高胰島素引發(fā)氧化應(yīng)激增加、氧自由基產(chǎn)生增多引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷均具有很好的改善作用[4,5]。后者的作用機(jī)制是通過抑制炎性因子、促炎因子的表達(dá)而減少炎癥的發(fā)生，發(fā)揮血管保護(hù)作用[6,7]。截至目前，有關(guān)小檗堿對(duì)糖尿病大鼠腸系膜各級(jí)血管及其周圍組織病變的作用未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在前期研究[8]的基礎(chǔ)上觀測(cè)糖尿病大鼠腸系膜不同大小動(dòng)、靜脈血管管徑和血管組織以及周圍組織的病理學(xué)改變，探討小檗堿對(duì)糖尿病大鼠腸系膜血管及組織損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物和儀器

小檗堿粉劑(四川協(xié)力制藥有限公司，批號(hào)：061002)；鏈脲佐菌素注射液(STZ，美國(guó)A-LEXIS Biochemicals公司，批號(hào)：0460041-6)；血糖儀及血糖試紙(美國(guó)雅培制藥有限公司)；RM2135型石蠟切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)；CX31型光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；緩沖液、雙蒸水、生理鹽水自配，電子天平市購(gòu)。ISCapture(V3.5)成像分析軟件(上海深瞳光電科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組處理

健康清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體重200g±20g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號(hào)：SCXK(冀)2013-1-003)，適應(yīng)性飼養(yǎng)(環(huán)境符合GB14925-2010要求)5天后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組、模型組和小檗堿組，每組8只。模型組和小檗堿組大鼠復(fù)制糖尿病模型：用0.1mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 4.0-4.4)將STZ配成1%溶液，按55mg/kg體重單次腹腔注射(注射前禁食12h)，對(duì)照組注射等量生理鹽水。72h后尾靜脈采血，用常規(guī)方法測(cè)定空腹血糖(FBG)。FBG≥16.7mmol/L為制模成功，兩組各8只大鼠均成模，悉數(shù)納入實(shí)驗(yàn)。2周后，小檗堿組給予200mg/kg小檗堿溶液(取適量小檗堿粉末，以雙蒸水配制成50mg/ml溶液)，對(duì)照組和模型組灌胃等量雙蒸水，三組均每天一次，連續(xù)2周。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)和方法

1.3.1 體重和血糖(BG)：觀察和測(cè)定各組大鼠實(shí)驗(yàn)前及藥物干預(yù)兩周后的毛色變化、體重和BG水平(試紙法)。

1.3.2 腸系膜血管管徑測(cè)量：上述指標(biāo)觀測(cè)完畢，斷頭處死各組大鼠，立即剖腹分離腸系膜，包括從腹主動(dòng)脈分支的腸系膜上動(dòng)脈(A0)，動(dòng)脈分支后的一級(jí)血管(伴行動(dòng)、靜脈A1、V1)，一級(jí)血管分支后的二級(jí)血管(伴行動(dòng)、靜脈A2、V2)，二級(jí)血管分支后的三級(jí)血管(伴行動(dòng)、靜脈A3、V3)及其周圍組織，中性甲醛固定后常規(guī)脫水包埋、石蠟切片(5μm)、HE染色，透射光學(xué)顯微鏡觀察腸系膜血管及周圍組織的病理學(xué)變化。使用ISCapture成像軟件多邊形工具描畫擬合血管內(nèi)徑，測(cè)量出各級(jí)血管內(nèi)徑周長(zhǎng)(即周徑)，表征血管管徑大小。

1.3.3 腸系膜血管及其周圍組織的病理學(xué)觀察：在測(cè)量腸系膜管徑的同時(shí)，選擇三組變化較為明顯的動(dòng)、靜脈分級(jí)血管進(jìn)行組織學(xué)分析及對(duì)這些血管周圍組織進(jìn)行病理學(xué)觀察，記錄典型病變并攝取圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體重及BG水平比較

實(shí)驗(yàn)前，三組大鼠的體重及BG水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.698、2.676，P>0.05)。實(shí)驗(yàn)28天后，三組大鼠體重及BG水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=95.528、51.420，P<0.01)。與對(duì)照組比較，模型組大鼠體重顯著降低(t=11.625，P<0.01)，BG水平明顯升高(t= -9.448，P<0.01)，且毛色無(wú)光澤，尾部發(fā)黑；與模型組比較，小檗堿組體重有所增加，BG水平也有下降，毛色也略有改善，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.125、1.508，P>0.05)，即仍與對(duì)照組存在明顯差異(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠體重和BG水平比較均=8)

注：與對(duì)照組相同時(shí)間比較，1)P<0.01

2.2 各組大鼠腸系膜各級(jí)血管管徑變化

2.2.1 動(dòng)脈管徑：三組大鼠的A0、A1級(jí)動(dòng)脈管徑差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.291、0.806，P>0.05)。三組間A2級(jí)動(dòng)脈管徑差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.116，P<0.01)；模型組較對(duì)照組明顯擴(kuò)張(t=-3.728，P<0.01)，小檗堿組較模型組有所收縮，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.531，P>0.05)。三組間A3級(jí)動(dòng)脈管徑差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.202，P<0.01)，模型組較對(duì)照組明顯擴(kuò)張(t=-5.254，P<0.01)，小檗堿組較模型組管徑明顯收縮(t=3.717，P<0.01)，基本恢復(fù)至對(duì)照組水平(P>0.05)。見表2。

2.2.2 靜脈管徑：三組大鼠腸系膜V1級(jí)靜脈管徑差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.643，P>0.05)。三組間V2級(jí)靜脈管徑差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.628，P<0.01)，模型組較對(duì)照組顯著擴(kuò)張(t=-3.557，P<0.01)，小檗堿組較模型組明顯收縮(t=2.201，P<0.05)。三組大鼠間腸系膜V3級(jí)靜脈管徑差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.07，P<0.01)，模型組較對(duì)照組明顯擴(kuò)張(t=-8.02，P<0.01)，小檗堿組與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.291，P>0.05)。見表3。

2.3 各組大鼠腸系膜各級(jí)血管組織病理變化

對(duì)照組大鼠腸系膜動(dòng)脈的彈性膜清晰可見，內(nèi)膜白細(xì)胞黏附較少；與對(duì)照組比較，模型組大鼠腸系膜動(dòng)脈的彈性膜分層不清，內(nèi)膜白細(xì)胞黏附增多；小檗堿組彈性膜分層較模型組清晰，內(nèi)膜白細(xì)胞黏附較模型組減少。上述現(xiàn)象在腸系膜A3級(jí)動(dòng)脈中較明顯(圖1)。對(duì)照組腸系膜靜脈內(nèi)膜白細(xì)胞黏附較少，模型組較對(duì)照組黏附明顯增多，小檗堿組較模型組黏附減少。該現(xiàn)象在V2級(jí)靜脈中較為明顯(圖2)。

表2 各組大鼠腸系膜各級(jí)動(dòng)脈管徑比較

注：n為各組各級(jí)血管采集觀測(cè)支數(shù)。與對(duì)照組比較，1)P<0.01; 與模型組比較，2)P<0.01

表3 各組大鼠腸系膜各級(jí)靜脈管徑比較

注：n為各組各級(jí)血管采集觀測(cè)支數(shù)。與對(duì)照組比較，1)P<0.01; 與模型組比較，2)P<0.05

注：對(duì)照組彈性膜分層清晰可見，血管內(nèi)膜白細(xì)胞黏附較少；模型組彈性膜分層不清晰，血管內(nèi)膜白細(xì)胞黏附較對(duì)照組增 多，血管擴(kuò)張；小檗堿組較模型組分層清晰，血管內(nèi)膜白細(xì)胞黏附減少，血管收縮

圖1 各組大鼠腸系膜三級(jí)動(dòng)脈(A3)的組織學(xué)變化(HE，×400)

注：對(duì)照組血管內(nèi)膜白細(xì)胞黏附較少；模型組較對(duì)照組血管內(nèi)膜白細(xì)胞黏附明顯增多，血管擴(kuò)張；小檗堿組較模型組血管 內(nèi)膜白細(xì)胞黏附有所減少，血管收縮

圖2 各組大鼠腸系膜二級(jí)靜脈(V2)的組織學(xué)變化(HE，×400)

2.4 各組大鼠腸系膜血管周圍組織病理變化

對(duì)照組血管周圍脂肪組織中脂肪細(xì)胞飽滿，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，神經(jīng)節(jié)形態(tài)完整，微血管數(shù)量少。模型組脂肪細(xì)胞皺縮明顯，幾乎消失，炎性細(xì)胞大面積浸潤(rùn)且神經(jīng)節(jié)腫脹。小檗堿組較模型組脂肪細(xì)胞飽滿，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，神經(jīng)節(jié)腫脹有所改善。見圖3。

注：對(duì)照組脂肪細(xì)胞飽滿，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，神經(jīng)節(jié)形態(tài)完整；模型組脂肪細(xì)胞皺縮，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，神經(jīng)節(jié)腫脹； 小檗堿組較模型組的脂肪細(xì)胞形態(tài)、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及神經(jīng)節(jié)形態(tài)均有所改善

圖3 各組大鼠腸系膜血管及周圍組織的病理學(xué)變化(HE，×400)

3 討 論

糖尿病晚期的血管損傷不可逆，導(dǎo)致各種組織器官缺血缺氧性病變，造成無(wú)法挽回的后果[9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，小檗堿對(duì)2型糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮損傷有明顯的改善作用[10]。但對(duì)小血管，包括微血管的研究少見。

本實(shí)驗(yàn)中糖尿病大鼠腸系膜動(dòng)脈彈性膜分層不清，二級(jí)、三級(jí)動(dòng)、靜脈血管擴(kuò)張，血管壁腫脹變形，周圍脂肪組織皺縮嚴(yán)重，神經(jīng)節(jié)水腫，炎細(xì)胞浸潤(rùn)增多。小檗堿灌胃兩周后，腸系膜三級(jí)動(dòng)脈、二級(jí)靜脈的炎性損傷得到修復(fù)，血管舒縮功能加強(qiáng)，同時(shí)炎性細(xì)胞減少，炎癥改善，但一級(jí)及以上動(dòng)、靜脈血管舒縮能力未見增加，提示小檗堿對(duì)糖尿病小血管病變的作用明顯，這種作用可能主要與其抑制機(jī)體的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[7]。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)中腸系膜上動(dòng)脈及一級(jí)動(dòng)、靜脈血管管徑在三組間變化差異不明顯，認(rèn)為可能由于本文糖尿病模型尚處早期而未損傷到大血管。該現(xiàn)象表明糖尿病血管病變應(yīng)是從小血管開始發(fā)生，隨著病變進(jìn)展可能會(huì)累及大血管。

本實(shí)驗(yàn)采用測(cè)量血管內(nèi)徑周長(zhǎng)的方法來表征血管管徑的大小，與傳統(tǒng)的管徑測(cè)量方法有所不同，傳統(tǒng)方法針對(duì)規(guī)整圓形血管直接選取血管邊緣，測(cè)量線過血管中心到達(dá)對(duì)側(cè)邊緣即為所測(cè)管徑[11]，由于糖尿病模型大鼠血管變形嚴(yán)重，用這種方法測(cè)量會(huì)造成明顯的誤差，而用血管內(nèi)徑周長(zhǎng)來表征管徑大小則使這種誤差大大減少，結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確。

綜上，對(duì)于糖尿病大鼠腸系膜血管及周圍脂肪組織的損傷可以通過小檗堿灌胃干預(yù)，使之獲得不同程度的改善和保護(hù)。但本文所用動(dòng)物數(shù)和所選血管支數(shù)均較少，所得結(jié)果有待進(jìn)一步增加樣本量予以驗(yàn)證。

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本文第一作者簡(jiǎn)介：

展曉亮(1992—)，女，漢族，2012級(jí)藥學(xué)專業(yè)本科生

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Effects of Berberine on Morphological Changes of Mesenteric Vessels in Diabetic Rats

ZHAN Xiao-liang, LIU Shuai, ZHI Ming-hua, LI Cong, LIANG Hong-yu, TONG Miao-miao, ZHAO Li-li, ZHAO Ding#

School of Pharmacy, Institute of Integrated Traditional and Western Medicine, Hebei Medical University, Shijiazhuang, 050017, China；#

Objective: To observe the intervention effect of berberine (BBR) on diabetic rat mesenteric vascular lesion. Method: 24 SD rats were divided into normal group, diabetic model (DM) group and BBR group randomly (n=8). Rats in DM group and BBR group were injected streptozotocin (STZ) (55mg/kg) to induce diabetic rat model, the normal group rats were injected with the same amount of saline. After two weeks of STZ injection, BBR group rats were administrated BBR (200mg/kg) by gavage, normal and DM group rats were administrated equal amount of distilled water once a day for two weeks. Compared the changes of body weight and blood glucose, and then killed all of rats and took the vascular tissues for routine treatment. Paraffin sections of vascular tissues were made. After HE staining, the circumference of vessel and histopathological changes of the mesenteric vascular at all levels and peripheral tissues were observed by microscopy. Results: In DM group rats, body weight was reduced (P<0.01), level of blood glucose was increased significantly (P<0.01), compared with the normal group after 28 days. The circumferences of the secondary and tertiary arteries (veins) were significantly increased, compared with the normal group (P<0.05,P<0.01). In DM group, the elastic membrane layer was unclear, endometrial leukocyte adhesion was increased, fat cells in perivascular adipose tissue shrinked, a large number of inflammatory cells infiltrated, and ganglion swelling. The BBR group had no significant difference in body weight and blood glucose compared with the control group (P>0.05), but the circumferences of the tertiary artery and secondary vein were decreased compared with the DM group significantly (P<0.05orP<0.01). After BBR treated, the vascular elastic membrane layer was clear, endometrial leukocyte adhesion was decreased. Adipocytes morphology, inflammatory cell infiltration and ganglion morphology was improved to a certain extent. Conclusion: BBR improves the small vessels, microvascular and surrounding tissue in mesenteric of diabetic rats morphological changes to a certain extent.

Berberine; Diabetes; Mesenteric vessels; Adipose tissue; Rat

河北省科技廳科技支撐項(xiàng)目(142777114D)

河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，石家莊050017；#

，E-mail:zhaodingd@163.com

本文2016-11-01收到，2016-12-30修回

R587.1

A

1005-1740(2017)01-0006-05