張海燕,張 杰,尚富德

(河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南開封 475004)

玉米須中高含量植物甾醇的提純工藝

張海燕,張 杰,尚富德*

(河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南開封 475004)

以干玉米須為原料,研究其植物甾醇的提純結(jié)晶工藝。皂化處理后的玉米須的提取條件經(jīng)過優(yōu)化后,在超聲波功率220 W、液料比12∶1(mL/g)、35 ℃超聲處理55 min的條件下,玉米須總甾醇得率達(dá)到10.5886 mg/g。得到的粗品經(jīng)氯仿萃取后,以乙酸乙酯為提取溶劑得到結(jié)晶,再滴加甲醇抽濾后得到甾醇重結(jié)晶。其中,β-谷甾醇和豆甾醇的純度分別為47.5%±0.24%和36.7%±0.13%,植物甾醇純度為92.76%。

玉米須,植物甾醇,提取純化,結(jié)晶

我國玉米(ZeamaysL)產(chǎn)量居世界第二位,作為玉米副產(chǎn)物的玉米須(Stigma Maydis or Corn Silk)資源非常巨大,容易獲得,但對它的開發(fā)利用非常有限,除少量入藥外,大部分被白白丟棄。而事實上,玉米須中存在多種活性成分,可用于治療腎炎水腫,糖尿病,膽結(jié)石,肝炎黃疸,高血壓等多種疾病。玉米須既有明顯的藥理價值,又具有一定的食療特征,極具工業(yè)化開發(fā)利用前景[1]。

植物甾醇是一種存在于植物中的天然活性物質(zhì),主要是以游離形式和脂肪酸酯形式存在于動植物的組織中,具有十分重要的生理功能,在醫(yī)療、制藥、食品、保健品、化工、化妝品和飼料等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[3-4]。研究證明,植物甾醇具有降低人體對膽固醇的吸收、降血脂、消炎、抗腫瘤、防治前列腺肥大、抑制乳腺增生、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫和抗氧化等方面都有重要作用[5-7];同時還是C19類固醇甾體化合物-脫氫表雄酮重要的生產(chǎn)原料[8]。我國可供開發(fā)植物甾醇的資源很多,但開發(fā)利用的很少,本研究利用農(nóng)產(chǎn)品廢棄物-無毒無副作用的玉米須作為原材料,為探索玉米須的開發(fā)利用提供了實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米須 開封藥店,無水乙醇、正丁醇、濃硫酸、濃磷酸購自鄭州派尼化學(xué)試劑廠;石油醚,乙醚 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司;丙酮、三氯甲烷 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;正己烷 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;乙酸乙酯和氫氧化鉀 津市化學(xué)試劑三廠;氯化鐵(6H2O) 天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司;所有化學(xué)分析試劑均為分析純;豆甾醇(純度為98%),谷甾醇(純度為98%) SIGMA公司;所用蒸餾水和無離子水由實驗室制備。

電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;202-O-S型電熱恒溫干燥箱 上海博泰實驗設(shè)備有限公司;BDW1-FW-200A傾斜式萬能粉碎機(jī) 北京西化儀器科技有限公司;752N紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器和SB-3200DT超聲波清洗機(jī) 購自上海亞榮生化儀器廠;JYD-150智能型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 上海之信儀器有限公司;5810R離心機(jī) 德國Eppendorf公司;日本島津GC-14B氣相色譜儀,FID檢測器,C-R6A數(shù)據(jù)處理儀,CHROMPACK公司的7711型石英毛細(xì)管柱。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米須預(yù)處理 將玉米須除去雜質(zhì)后用粉碎機(jī)粉碎,80目篩子過目,將過篩部分放入電熱恒溫干燥箱中100 ℃過夜烘干后干燥保存。

1.2.2 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液 在10 mL無水乙醇中將25 mgβ-谷甾醇溶解,轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中定容。使用時稀釋10倍,分別取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL的0.1 mg/mLβ-谷甾醇溶液于試管中,用無水乙醇定容至4.0 mL,加入硫磷鐵顯色劑2.0 mL,振蕩搖勻;15 min后在波長530 nm處測定其吸光度值。以β-谷甾醇溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。

1.2.3 玉米須的皂化 稱取5.0 g玉米須于三角瓶中,加入20 mL皂化液(3 mol/L氫氧化鉀乙醇溶液),保鮮膜封口密閉,置于80 ℃水浴鍋中皂化2 h。

1.2.4 不同溶劑對玉米須中甾醇得率的影響 按照10∶1的液料比,向皂化后的三角瓶中分別加入石油醚、正己烷、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、無水乙醇、正丁醇、三氯甲烷各50 mL,每組三個重復(fù)。不加皂化液組作對照,皂化后離心,取上清進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),定容。樣品靜置15 min后測定其吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的甾醇溶液質(zhì)量濃度,計算樣品中甾醇得率,公式如下:

式中:m為玉米須質(zhì)量(g),y為玉米須甾醇得率(mg/g);c為提取液吸光度值對應(yīng)β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(mg/mL);v為乙醇定容液體積(mL);b為稀釋倍數(shù)。

1.2.5 超聲波輔助提取植物甾醇

1.2.5.1 單因素實驗 稱取玉米須1.0 g,以無水乙醇為提取溶劑,置于超聲波細(xì)胞破碎儀中。分別考察不同超聲波溫度(25、35、45、55、65 ℃)、提取時間(15、25、35、45、55 min)、超聲波功率(100、140、180、220、260 W)、液料比(8∶1、12∶1、16∶1、20∶1、25∶1)對甾醇得率的影響,重復(fù)三次。

1.2.5.2 正交實驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上進(jìn)行4因素(超聲波溫度、提取時間、超聲波功率、提取料液比)3水平的正交實驗,確定玉米須中植物甾醇的最佳提取工藝,因素與水平見表1。

表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.6 植物甾醇粗品的純化結(jié)晶 將無水乙醇提取液55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后,用熱的去離子水溶解干燥物,倒入萃取瓶中加200 mL氯仿萃取2～3次,55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到粗制品,粗制品加入適量乙酸乙酯,加熱(至微沸),降溫結(jié)晶;再滴加甲醇靜置結(jié)晶,甾醇析出,抽濾后得到白色甾醇結(jié)晶。

甾醇純度(%)=甾醇晶體質(zhì)量(g)/提取物質(zhì)量(g)

1.2.7 植物甾醇?xì)庀嗌V測定條件 色譜柱:DB-1(30 m×0.53 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱;進(jìn)樣口溫度280 ℃;載氣高純氮氣(純度≥99.999%);分流比:20∶1;流速1.0 mL/min;升溫程序:285 ℃保持30 min,10 ℃/min升至300 ℃,保持5 min;FID檢測器溫度310 ℃;進(jìn)樣量2 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-谷甾醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以β-谷甾醇溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程y=3.2622x+0.0074,式中y為吸光度值,x為β-谷甾醇溶液質(zhì)量濃度(mg/mL),該方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9988,可以用于定量分析(圖1)。

圖1 β-谷甾醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of β-sitosterol

2.2 皂化對玉米須中甾醇的提取效果

從圖2中可以看出:玉米須經(jīng)過皂化處理后甾醇得率為7.76 mg/g,而不經(jīng)過皂化處理的甾醇得率為5.66 mg/g,說明皂化處理有利于獲得更多的玉米須植物甾醇。

圖2 皂化對玉米須中植物甾醇提取的影響Fig.2 Effects of saponification on yield of phytosterol from corn silk

2.3 提取溶劑的選擇

分別用石油醚、正丁醇、無水乙醇、丙酮、正己烷、乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷對皂化后的玉米須進(jìn)行提取(圖3),從這八種有機(jī)溶劑提取甾醇的得率來看,無水乙醇的提取效果最好,其次為正丁醇,氯仿,在乙酸乙酯和丙酮中溶解度差。

圖3 不同溶劑對玉米須中植物甾醇的提取效果Fig.3 Effects of saponification on yield of phytosterol from corn silk

2.4 超聲波輔助提取單因素的影響

2.4.1 時間對植物甾醇提取的影響 玉米須植物甾醇得率隨超聲時間的延長而逐漸增大,超聲波時間超過55 min時,得率幾乎沒有變化(圖4)。

圖4 超聲處理時間對玉米須植物甾醇提取的影響Fig.4 Effects of ultrasonic time on yield of phytosterol from corn silk

2.4.2 溫度對植物甾醇提取的影響 由圖5可知,玉米須植物甾醇的得率隨超聲溫度升高而增加,到65 ℃達(dá)到最大,但當(dāng)溫度升高到70 ℃時,得率降低。

圖5 超聲波溫度對玉米須中植物甾醇提取的影響Fig.5 Effects of ultrasonic temperature on yield of phytosterol from corn silk

2.4.3 液料比對甾醇提取的影響 當(dāng)液料比為12∶1時,植物甾醇得率達(dá)到最大,液料比大于12∶1時得率下降。因為過多增加溶劑加大了其他物質(zhì)的溶出,反而影響了目標(biāo)提取物的溶出。當(dāng)液料比大于20∶1時,甾醇得率又增大,從節(jié)省溶劑等方面綜合考慮,選擇液料比為12∶1(圖6)。

圖6 料液比對玉米須中甾醇提取效果的影響Fig.6 Effects of ratio of material-liquid on yield of phytosterol from corn silk

2.4.4 超聲波功率對甾醇提取的影響 當(dāng)超聲波功率為220 W時,得率達(dá)到最大;功率大于220 W時,得率呈急劇下降趨勢(圖7)。

圖7 超聲功率對玉米須中甾醇提取效果的影響Fig.7 Effects of ultrasonic power on yield of phytosterol from corn silk

2.4.5 玉米須甾醇提取的正交實驗 在綜合考慮單因素實驗和產(chǎn)品工廠化生產(chǎn)成本的基礎(chǔ)上,利用正交實驗分析了超聲波4因素在3個水平上對玉米須中植物甾醇提取效果的影響,并對實驗結(jié)果進(jìn)行極差分析(表2)。

表2 正交實驗結(jié)果與極差分析Table 2 Results of orthogonal test and range analysis

由表3可以看出,實驗各因素對玉米須植物甾醇得率的影響主次順序為:超聲波溫度>料液比>提取時間>超聲波功率;通過極差分析,確定玉米須植物甾醇提取最優(yōu)組合,即超聲波輔助提取溫度為35 ℃,12∶1的液料比,提取時間為55 min,超聲波功率為220 W。以最優(yōu)工藝進(jìn)行驗證實驗,在此條件下玉米須植物甾醇得率為10.5886 mg/g。

2.5 植物甾醇制品初結(jié)晶

將無水乙醇提取液55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后,用去離子水溶解干燥物,倒入萃取瓶中加氯仿萃取2～3次,55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到粗制品,粗制品按照1∶2的料液比加入乙酸乙酯,加熱(至微沸),至溶液呈懸濁狀,降溫在10 ℃結(jié)晶12 h,得到甾醇的結(jié)晶制品。

2.6 甾醇制品的重結(jié)晶

初結(jié)晶晶體抽濾后,再滴加甲醇10 ℃靜置結(jié)晶,甾醇析出,抽濾后得到白色甾醇結(jié)晶。

2.7 氣相色譜檢測

植物甾醇的不同單體在結(jié)構(gòu)上比較相似,不易于分離檢測,為了準(zhǔn)確分析玉米須甾醇的主要成分,檢測玉米須中甾醇提取純度,本文借鑒盧定強(qiáng)的研究[10],以谷甾醇和豆甾醇純品為內(nèi)標(biāo),利用氣相色譜技術(shù)將玉米須甾醇進(jìn)行衍生化后進(jìn)氣相檢測,出峰順序為:內(nèi)標(biāo)物、豆甾醇、β-谷甾醇(圖8～圖10),甾醇制品經(jīng)過重結(jié)晶后,純度由88.23%提高到92.76%,其中,β-谷甾醇和豆甾醇的純度分別為47.5%± 0.24%和36.7%±0.13%。

圖8 甾醇制品的氣相色譜圖Fig.8 Gas chromatogram of phytosterol

圖9 β-谷甾醇標(biāo)樣的氣相色譜圖Fig.9 Gas chromatogram of β-sterol

圖10 豆甾醇標(biāo)樣的氣相色譜圖Fig.10 Gas chromatogram of sterol stigmasterol

3 結(jié)論與討論

植物甾醇具有重要生理功能,應(yīng)用廣泛,需求量大。目前為止,植物甾醇大多以植物油脫臭餾出物為原料提取甾醇,但脫臭餾出物存在原料有限,不易儲藏,易氧化等問題,并不適合大規(guī)模甾醇的生產(chǎn),食物中,植物油是PS含量最高的食物。一般情況下,大豆油PS含量約為300 mg/100 g,花生油中PS含量約為250 mg/100 g,菜籽油中PS的含量則會更高,可達(dá)到500 mg/100 g以上,但以植物油為原料提取甾醇,產(chǎn)品附加值太高[11]。王芳等嘗試采用超聲法提取龍眼核中總甾醇,其得率為4.662 mg/g,高于傳統(tǒng)回流提取法提取的總甾醇得率(4.383 mg/g)[12];王麗君以枇杷籽為原料,通過響應(yīng)面分析法確定枇杷籽甾醇提取最佳工藝條件為超聲波功率為311.3 W,提取時間為29.8 min,總甾醇得率為2.67 mg/g[13];林麗靜以毛竹筍筍頭為原料,通過響應(yīng)面分析法確定其甾醇提取最佳工藝條件為乙醇濃度95%,提取20 min,料液比15∶1(mL/g),β-谷甾醇提取含量為365.52 mg/100 g[14]。本文對玉米須甾醇的超聲波輔助提取工藝進(jìn)行了研究,通過正交實驗確定了最佳提取條件,在超聲波功率140 W、液料比12∶1(mL/g)、35 ℃超聲處理55 min的條件下,植物甾醇得率達(dá)到了10.5886 mg/g,其中,β-谷甾醇和豆甾醇的純度分別為47.5%±0.24%和36.7%±0.13%。比利用枇杷籽和龍眼核為原材料的得率高了2～3倍,說明玉米須是提取植物甾醇一個潛在的良好來源,具有很好的開發(fā)利用價值。而且玉米須容易獲得,是農(nóng)產(chǎn)品廢棄物,以它為生產(chǎn)原料,可顯著降低生產(chǎn)成本,促進(jìn)玉米副產(chǎn)物的綜合利用,實現(xiàn)資源的再加工和產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

在玉米須甾醇初步提取的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步進(jìn)行了純化結(jié)晶,與超臨界CO2流體萃取法相比,結(jié)晶法以其快速簡便,投入成本低,產(chǎn)品附加值低一直是甾醇提取純化的主要方法。很多學(xué)者對此進(jìn)行了研究,如趙一凡以甲酯化的大豆油脫臭餾出物為原料,使用正己烷和丙酮進(jìn)行甾醇的精制,得到的甾醇產(chǎn)品純度為94.87%[15];王麗君利用正己烷等溶劑把枇杷籽甾醇粗提物提取純化,枇杷籽甾醇的純度可達(dá)到89.7%[13]。本文采用甲醇和乙酸乙酯進(jìn)行玉米須甾醇的精制,得到純度為92.76%的制品。此方法工藝簡單,易于操作,產(chǎn)品工藝可控性好、成本低、易于產(chǎn)業(yè)化。

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Process of extraction and purification of high content phytosterol from corn silk

ZHANG Hai-yan,ZHANG Jie,SHANG Fu-de*

(College of Life Science,Henan University,Kaifeng 475004,China)

The extraction and purification process of phytosterol were studied from corn silk by saponification. The highest extraction yield of 10.5886 mg/g total phytosterol was acquired by the ultrasonic assisted method. The optimal extraction conditions were determined by single factor and orthogonal test as follows:220 W ultrasonic power,55 min extraction time,ultrasonic temperature 35 ℃,and 12∶1 ratio of liquld-material(mL/g). Phytosterol crystal was achieved with ethyl acetate as solvent after being extracted by chloroform. The purity of the crude phytosterols was 92.76% with 47.5%±0.24%β-sitosterol and 36.7%±0.13% campesterol,respectively after recrystallation by methanol.

corn silk;Phytostero(PS);extraction and purification;recrystallation

2016-06-20

張海燕(1977-)，女，博士，副教授，研究方向：生物工程，E-mail:zhanghy150@sina.com。

*通訊作者:尚福德(1963-)，男，博士研究生，教授，研究方向：植物形態(tài)解剖學(xué)、植物系統(tǒng)分類學(xué)，E-mail:fudeshang@henu.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金(31400108)；河南省科技廳攻關(guān)項目(142102210034)；河南大學(xué)科研項目(xxjc20140009)。

TS255.1

B

:1002-0306(2017)03-0192-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.028