曹國強張峰陳雷鳴陳海李彪馮曉文李紅春謝海洋周琳

·論著·

不同時間下超低溫保存肝癌組織細胞RNA完整性的差異分析

曹國強1張峰1陳雷鳴1陳海1李彪1馮曉文1李紅春2謝海洋1周琳1

目的 研究肝癌組織細胞樣本于-80℃超低溫保存條件下的質(zhì)量控制，探討肝癌組織細胞樣本在超低溫保存中的時效性。方法 隨機抽取超低溫新鮮凍存（24 h內(nèi)）、保存3個月、6個月和1年不同時長的肝癌和對應(yīng)的癌旁組織細胞各12對，HE染色評估標(biāo)本取材的準(zhǔn)確性，采用Promega自動提取核酸儀提取肝臟細胞RNA，利用Agilent 2100生物分析儀進行RIN值及28S/18S比值分析。對新鮮凍存、保存3個月、6個月以及1年的組織細胞樣本的RIN值和28S/18S比值進行組間非配對t檢驗。結(jié)果 HE染色鏡下觀察發(fā)現(xiàn)切片組織細胞中腫瘤細胞比例達到80﹪以上，為生物樣本庫的合格樣本。生物分析儀檢測結(jié)果顯示超低溫新鮮凍存、保存3個月、6個月和1年的癌和癌旁組織細胞的RIN均值均>7.0，平均28S/18S比值均>1.5，組間非配對t檢驗顯示，保存1年的肝癌組織細胞相比于新鮮凍存（7.442±0.674 vs 8.617±0.769，P = 0.001）、保存3個月（7.442±0.674 vs 8.275±0.617，P = 0.005）和6個月（7.442±0.674 vs 8.175±0.970，P = 0.043）的組織細胞RIN值顯著下降，提示存在一定程度的RNA降解，而其余各組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均> 0.05）。 結(jié)論 在超低溫條件下新鮮凍存、保存3個月、6個月的肝癌及癌旁組織細胞，其質(zhì)量均可以獲得有效保證，而保存1年的肝癌組織細胞的RNA雖然存在一定程度的降解，但能夠滿足后續(xù)臨床科研的要求。

肝腫瘤； 組織細胞； RNA； 低溫保存

生物樣本庫又稱生物銀行（Biobank），主要是指標(biāo)準(zhǔn)化收集、處理、儲存和應(yīng)用健康或疾病生物體的生物大分子、細胞、組織和器官等樣本，包括人體器官組織、全血、血漿、血清、生物體液或經(jīng)處理過的生物樣本（DNA、RNA和蛋白等）以及與這些生物樣本相關(guān)的知情同意、臨床、治療、隨訪和病理等資料及其質(zhì)量控制、信息管理與應(yīng)用系統(tǒng)。隨著功能基因組學(xué)和生物芯片技術(shù)研究的深入，眾多的腫瘤相關(guān)基因和蛋白被發(fā)現(xiàn)，其中一部分有望成為腫瘤預(yù)測、早期診斷個性化治療和預(yù)后評估等重要的分子靶標(biāo)或治療的藥物靶點。對新發(fā)現(xiàn)的基因或蛋白，需在人體腫瘤細胞中確認其表達水平和生物學(xué)功能及意義，因此生物樣本庫的建設(shè)成為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中非常重要的組成部分[1]。根據(jù)美國病理學(xué)家協(xié)會發(fā)布的《生物樣本庫認證項目檢視清單》和ISBER（國際生物和環(huán)境樣本庫協(xié)會）頒布的《2012生物樣本庫最佳實踐規(guī)范》，在樣本的采集、分裝、入庫、出庫及檢測過程中存在很多質(zhì)控點，并利用各種技術(shù)分析之后獲得的樣本數(shù)據(jù)對樣本的質(zhì)量進行評估。然而，這些實踐的方法學(xué)驗證工作仍然是一片空白[2]。原發(fā)性肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的惡性腫瘤。由于起病隱匿，早期沒有癥狀或癥狀不明顯且進展迅速，因此確診時大多數(shù)為中晚期，如果僅采取支持對癥治療，平均存活時間很短，嚴(yán)重地威脅人民群眾的身體健康和生命安全[3]。因此在我國HCC的治療和診斷研究具有重要的社會經(jīng)濟學(xué)意義，而建立HCC組織生物樣本庫，可以為研究HCC的科研人員節(jié)省大量的時間。樣本的質(zhì)控是保證樣本的質(zhì)量及后續(xù)科學(xué)研究順利進行的關(guān)鍵，近年來我國生物樣本庫的數(shù)量越來越多，生物樣本的質(zhì)量控制顯得尤為重要，包括樣本采集、分裝、入庫、出庫及檢測整個過程中對樣本的質(zhì)量進行監(jiān)控，避免樣本出現(xiàn)污、降解染等質(zhì)量問題。浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院自建立肝膽胰疾病生物樣本以來，收集了大量的臨床樣本，本文將重點探討本院在HCC組織細胞樣本質(zhì)量控制方面的經(jīng)驗和面臨的問題。

資料與方法

一、臨床樣本資料

采用簡單隨機抽樣法抽取本院HCC手術(shù)患者超低溫新鮮凍存（24 h內(nèi)）、保存3個月、6個月和1年不同時長的HCC和對應(yīng)癌旁組織各12對。用于超低溫保存的樣本應(yīng)在組織離體后30 min內(nèi)快速完成采集并立即放入液氮凍存，轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱存放。用于石蠟包埋的樣本應(yīng)立即用10﹪的福爾馬林固定后送檢。術(shù)后病理診斷均為HCC。

二、主要儀器及試劑

-80℃超低溫冰箱（德國艾本德NBS U570），自動核酸提取儀（美國普洛麥格公司Maxwell 16），生物分析儀（美國安捷倫公司Agilent 2100）和光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯BX41）。蘇木素染液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司ZLI-9610），水溶性伊紅（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司ZLI-9613），總RNA提取試劑盒（美國普洛麥格公司AS1050）和RNA分析試劑盒（美國安捷倫公司5067-1511）。

三、質(zhì)控方法

1.石蠟組織HE染色：隨機抽取超低溫冰箱新鮮凍存、保存3個月、6個月以及1年的HCC和癌旁組織及對應(yīng)的石蠟組織，石蠟組織經(jīng)3～5 μm厚度切片后，進行HE染色后鏡下觀察，如腫瘤細胞占總細胞的80﹪以上，則為生物樣本庫的合格樣本。

2. RNA質(zhì)量鑒定：隨機抽取超低溫冰箱新鮮凍存、保存3個月、6個月以及1年未經(jīng)反復(fù)凍融的HCC組織及對應(yīng)的癌旁組織各12對，通過總RNA提取試劑盒提取HCC組織細胞和相對應(yīng)癌旁組織細胞的RNA，用Nano2000超微量分光光度計檢測RNA濃度后，再用Agilent 2100 生物分析儀進行RNA 分子完整數(shù)值（RNA integrity number，RIN值）以及28S/18S比值的測定。結(jié)果判斷：RIN值（0 ~10）直接反應(yīng)了RNA質(zhì)量的好壞，此數(shù)值越大表明RNA質(zhì)量越好越完整，>7為高質(zhì)量[4]。28S/18S比值即為衡量提取的RNA完整性的指標(biāo)。28S條帶的光密度為18S光密度的1.5～2.0倍，說明RNA未明顯降解[5]。

四、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 21進行統(tǒng)計分析，對新鮮凍存、保存3個月、6個月以及1年的組織細胞樣本的RIN值和28S/18S值以±s表示，RIN值和28S/18S比值進行組間非配對t檢驗，多組間數(shù)據(jù)用單因素方差分析，以P < 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HE染色

隨機抽取超低溫冰箱新鮮凍存、保存3個月、6個月以及1年的HCC和癌旁組織及對應(yīng)的石蠟組織48對，經(jīng)切片后行HE染色。閱片結(jié)果顯示所有受檢組織細胞均細胞形態(tài)良好，染色清晰（圖1）。HCC組織細胞片中，腫瘤細胞比例均超過80﹪，壞死組織細胞比例均< 10﹪，達到ICGC標(biāo)準(zhǔn)（壞死組織細胞比例< 20﹪），均為合格樣本[5]。

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察肝癌組織及癌旁組織細胞形態(tài)（HE染色，×200）

表112 對不同保存時間點肝癌與癌旁組織細胞樣本的RIN值比較（± s）

表112 對不同保存時間點肝癌與癌旁組織細胞樣本的RIN值比較（± s）

注：與12個月的肝癌組織細胞比較，aP < 0.05

分組 0個月 3個月 6個月 12個月 F值 P值癌8.617±0.769a 8.275±0.617a 8.175±0.970a 7.442±0.674 4.964 0.005癌旁 7.742±0.464 7.825±0.956 7.533±0.768 7.550±0.815 0.416 0.742

表212 對不同保存時間點肝癌與癌旁組織細胞樣本的28S/18S比值比較（± s）

表212 對不同保存時間點肝癌與癌旁組織細胞樣本的28S/18S比值比較（± s）

分組 0個月 3個月 6個月 12個月 F值 P值癌1.625±0.398 1.558±0.219 1.608±0.309 1.508±0.223 0.379 0.769癌旁 1.525±0.314 1.517±0.335 1.575±0.540 1.542±0.312 0.053 0.984

二、RNA質(zhì)量鑒定

不同保存時間點，HCC與癌旁組織細胞樣本的RIN值及28S/18S比值見表1，2。新鮮凍存HCC組織細胞樣本及保存3個月、6個月、12個月的RIN均值均>7.0，說明樣本的RNA完整性較好。新鮮凍存的HCC組織細胞比癌旁組織細胞的RIN均值要高，但保存12個月的HCC組織細胞與癌旁組織細胞的RIN均值相近，在相同環(huán)境下HCC組織細胞要比癌旁組織細胞RNA的質(zhì)量下降得快。采用非配對t檢驗，保存12個月與0個月的HCC組織細胞的比較結(jié)果，P = 0.001；保存12個月與3個月的HCC組織細胞的比較結(jié)果，P = 0.005；保存12個月與6個月的肝癌組織細胞的比較結(jié)果，P = 0.043。HCC與癌旁組織細胞樣本新鮮凍存及保存3個月、6個月、12個月28S/18S比值結(jié)果顯示均差異無統(tǒng)計學(xué)意義。其中HCC組織細胞RIN值采用多組間單因素方差分析，P = 0.005。圖2所示樣本1-8的28S和18S條帶顯示完好。樣本3出現(xiàn)小片段的雜帶，說明有小片段的RNA降解。圖3a對應(yīng)圖2中樣本1的峰圖，其中28S峰值區(qū)域約為18S峰值區(qū)域的1.9倍，且雜帶較少，說明組織細胞RNA較完好。圖3b對應(yīng)圖2中樣本3的峰圖。其中28S峰值面積約為18S峰值面積的1.2倍，且18S和28S中間出現(xiàn)了一個峰值，說明組織細胞RNA有小片段降解。

圖2 Agilent 2100 生物分析儀模擬電泳圖

圖3 RNA分析

討 論

鑒于不同來源細胞中RNA酶含量差異較大，尤其是胰腺和小腸細胞中RNA酶含量豐富，極易造成RNA降解[6]。本研究對不同保存時長HCC及癌旁組織細胞的RNA降解情況進行了初步探索，發(fā)現(xiàn)新鮮HCC組織細胞比癌旁組織細胞的RIN均值要高，也就是說相同時間段內(nèi)，相比于癌組織細胞，癌旁組織細胞中的RNA更容易發(fā)生降解，其原因有：（1）HCC組織細胞中RNA酶表達量減少，這種表達量降低與HCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；（2）HCC組織細胞中存在RNA酶抑制劑高于相應(yīng)的癌旁組織；（3）取樣過程中冷缺血時間癌組織細胞中RNA酶的影響更大[7]。隨著時間的推移，在超低溫冰箱的保存下，保存1年的HCC組織細胞RIN均值明顯下降，其程度高于對應(yīng)癌旁組織。后續(xù)的工作中，筆者將加大樣本量的驗證，并對保存時間更久的HCC組織細胞樣本質(zhì)量進行測定。

國外的研究表明，在理想情況，樣本保存的時間或溫度不會顯著影響RNA的完整性，但在實際操作過程中，保存時間越長，機械設(shè)備故障所導(dǎo)致的樣本意外凍融概率也越高，并降低RNA的RIN值[8]。所以隨著保存時間的延長，HCC組織細胞的RNA質(zhì)量會有所降低。因此生物樣本庫要保持一定的“動態(tài)平衡”，也就是說在一定的時間內(nèi)保證樣本質(zhì)量的前提下要能夠及時地利用HCC樣本，盡最大的可能利用HCC樣本，促進生物樣本庫持續(xù)有效地科學(xué)發(fā)展。另外新鮮采集的HCC組織細胞樣本及時地保存到超低溫冰箱的同時也要淘汰一些保存時間較久質(zhì)控結(jié)果不合格的樣本。

由于組織細胞內(nèi)的RNA容易降解，因此組織細胞RNA的完整性和均一性是評價樣本質(zhì)量的重要指標(biāo)。迅速有效地采集、分裝HCC組織和保存入庫，以及后期冷鏈系統(tǒng)對超低溫冰箱24 h的溫度監(jiān)測是減少RNA降解的關(guān)鍵因素。樣本在出庫及檢測的過程中，應(yīng)盡量避免DNA、RNA和蛋白質(zhì)的降解，避免組織細胞的反復(fù)凍融，反復(fù)凍融可使細胞破碎，同時盡量保持在較低溫度條件下操作[9]。

通過多年的樣本庫建設(shè)和結(jié)合臨床的應(yīng)用，筆者總結(jié)了一些經(jīng)驗和做法：（1）標(biāo)本采集應(yīng)由專人負責(zé)，而非采用臨時人員輪流取樣的方式；（2）基于ISBER頒布的《2012生物樣本庫最佳實踐規(guī)范》，修改并完善了《樣本庫質(zhì)量管理體系文件》和《樣本庫作業(yè)指導(dǎo)書》；（3）與軟件公司合作，根據(jù)自身需求開發(fā)了一套生物樣本庫管理軟件，與醫(yī)院HIS系統(tǒng)實現(xiàn)對接，并結(jié)合了臨床病歷信息，更方便臨床科研服務(wù)；（4）在臨床樣本取材過程中，一定要避免出血和壞死，采集到保存的整個過程一定要在標(biāo)本離體30 min內(nèi)完成操作；（5）在組織細胞RNA提取過程中，充分利用液氮使組織細胞完全破碎，提高RNA得率；（6）采用冷鏈系統(tǒng)對所有超低溫冰箱進行24 h溫度監(jiān)測，如遇冰箱溫度異常立即發(fā)送報警短信提醒工作人員；（7）將以往所采集的組織樣本定期批量的進行RNA質(zhì)量控制，監(jiān)控樣本質(zhì)量。

本研究對HCC生物樣本庫質(zhì)量控制體系進行了初步探討，采用RIN值來評定RNA的質(zhì)量水平。該參數(shù)已經(jīng)成為RNA研究領(lǐng)域內(nèi)質(zhì)量評估的黃金標(biāo)準(zhǔn)。同時對28S/18S比值也進行了分析，證實在超低溫條件下保存3個月、6個月的HCC及癌旁組織細胞，其質(zhì)量均可以獲得有效保證，而保存1年的HCC組織細胞樣本RNA雖然存在一定程度的降解，但RIN均值> 7.0，依然能夠滿足后續(xù)臨床科研的要求。

1 郜恒駿, 朱明華. 重視腫瘤組織庫的標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)和應(yīng)用[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2008, 37(12):797-798.

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Analysis of RNA integrity of hepatocellular carcinoma cells with different cryopreservation times

Cao Guoqiang1, Zhang Feng1, Chen Leiming1, Chen Hai1, Li Biao1, Feng Xiaowen1, Li Hongchun2, Xie Haiyang1, Zhou Lin1.1First Affiliated Hospital, Key Laboratory of Combined Multiorgan Transplantation, Ministry of Public Health, Key Laboratory of Or gan Transplantation, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, China;2Shenzhen Third People’s Hospital, Division of Hepatobiliary Surgery, Shenzhen 518112, China

Zhou Lin, Email: linzhou19@163.com

ObjectiveTo evaluate the quality control system for cryopreservation of hepatocellular carcinoma cells under -80 ℃ as time relapses.MethodsHepatocellular carcinoma tissue was frozen within 24 hours after harvesting and stored for three months, six months and one year under ultra-low temperature respectively（n = 12 for each group）. Hepatocellular carcinoma and paracancerous tissue were identified by HE Staining. Promega automatic nucleic acid extraction instrument was used to extract RNA from HCC cells. RIN（RNA integrity number）value and 28S/18S ratio was evaluated by Agilent 2100 Bioanalyzer.ResultsThe percentage of tumor cells were found in more than 80﹪ of the samples by HE staining, and were considered as qualified samples. The average RIN values and 28S/18S ratios for HCC tissue stored for three months, six months and one year were > 7.0 and > 1.5 respectively. Unpaired t test showed that RIN value of cells stored for one year was decreased significantly compared with that freshly collected samples（7.442±0.674 vs 8.617±0.769, P = 0.001）or samples stored for three months（7.442±0.674 vs 8.275±0.617, P = 0.005）and six months（7.442±0.674 vs 8.175±0.970, P = 0.043）, suggesting the presence of RNA degradation. There was no significant difference between the other groups（P > 0.5）.ConclusionMorphology for tumor cells, RIN value and 28S/18S ratio can be used as indicators for monitoring the quality of liver cancer samples. Sample quality remained good when stored at ultra-low temperatures for three months or six months, although there was a certain degree of RNA degradation for samples that stored for one year.

Liver neoplasms； Histiocytes； RNA； Cryopreservation

2016-07-19）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.01.009

浙江省“十二”五基層衛(wèi)生適宜技術(shù)成果轉(zhuǎn)化工程重大項目（2013T301-15）；深圳市三名工程科技計劃項目（ZDSYS201504301534057）

310003 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院衛(wèi)生部多器官聯(lián)合移植研究重點實驗室 浙江省器官移植重點實驗室1；518112 深圳市第三人民醫(yī)院肝膽外科2

周琳，Email：linzhou19@163.com

曹國強，張峰，陳雷鳴，等. 不同時間下超低溫保存肝癌組織細胞RNA完整性的差異分析[J/CD].中華細胞與干細胞雜志（電子版）, 2017, 7(1):49-53.