張勇張巍張劍平卓文利吳衛(wèi)真譚建明

·論著·

干細(xì)胞對環(huán)孢素腎病大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長因子β1的影響

張勇1張巍2張劍平2卓文利2吳衛(wèi)真2譚建明2

目的 觀察干細(xì)胞治療技術(shù)對環(huán)孢素腎病大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）的影響。方法 實(shí)驗大鼠分成3組，每組10只大鼠：C組：正常對照組；H組：模型組；B組：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療組。28 d處死大鼠切取腎臟，免疫組織化學(xué)染色、RT-PCR、Western blot測定腎組織TGF-β1、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達(dá)水平。采用單因素方差分析比較各組數(shù)據(jù)。結(jié)果 （1）免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：與C組比較，H組、B組TGF-β1（0.899±0.046 vs 9.524±1.232，6.437±0.728；P < 0.01）、α-SMA（2.427±0.188 vs 11.912±2.610，9.232±2.268；P < 0.01）表達(dá)水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與H組比較，B組大鼠的TGF-β1（9.524±1.232 vs 6.437±0.728；P < 0.01）、α-SMA（11.912±2.610 vs 9.232±2.268；P < 0.01）表達(dá)水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；（2）RT-PCR結(jié)果顯示：與C組比較，H組、B組TGF-β1（0.119±0.003 vs 0.826±0.004，0.651±0.004；P < 0.01）、α-SMA（0.370±0.006 vs 0.900±0.007，0.642±0.007；P < 0.01）mRNA水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與H組比較，B組大鼠的TGF-β1（0.826±0.004 vs 0.651±0.004；P < 0.01）、α-SMA（0.900±0.007 vs 0.642±0.007；P < 0.01）mRNA水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；（3）Western blot結(jié)果顯示：與C組比較，H組、B組TGF-β1（0.218±0.004 vs 0.825±0.003，0.650±0.006；P < 0.01）、α-SMA（0.263±0.003 vs 0.841±0.003，0.615±0.003；P < 0.01）蛋白水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與H組比較，B組大鼠的TGF-β1（0.825±0.003 vs 0.650±0.006；P < 0.01）、α-SMA（0.841±0.003 vs 0.615±0.003；P < 0.01）蛋白水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療可以下調(diào)環(huán)孢素腎病大鼠腎組織TGF-β1表達(dá)水平，減少α-SMA表達(dá)水平，從而改善大鼠腎間質(zhì)纖維化程度。

親環(huán)素類； 腎病； 骨髓； 間質(zhì)干細(xì)胞； 轉(zhuǎn)化生長因子β1

環(huán)孢素是臨床上常見的鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，常用于器官移植、難治性腎病和自身免疫系統(tǒng)疾病的治療，多年使用中人們發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素可以導(dǎo)致腎臟損害，其主要病理特征是缺血、間質(zhì)纖維化和炎性細(xì)胞浸潤，根據(jù)這一特點(diǎn)實(shí)驗研究中，人們通常認(rèn)為應(yīng)用大劑量環(huán)孢素來制造慢性腎衰模型。在筆者的既往研究中應(yīng)用干細(xì)胞治療技術(shù)干預(yù)環(huán)孢素腎病大鼠，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過干細(xì)胞干預(yù)的環(huán)孢素腎病大鼠，腎功能進(jìn)展情況明顯放緩，病理檢查也發(fā)現(xiàn)干預(yù)組大鼠的腎間質(zhì)纖維化程度也明顯減輕，治療觀察期內(nèi)也未發(fā)生大鼠死亡及其他臟器損傷[1]。干細(xì)胞對慢性腎病模型良好的治療效果。也使得筆者更加想了解干細(xì)胞治療慢性環(huán)孢素腎病大鼠的機(jī)制，根據(jù)既往文獻(xiàn)報道，以及腎間質(zhì)纖維化程度改善的作用特點(diǎn)，利用既往研究環(huán)孢素腎病模型的腎組織標(biāo)本，同時篩選出轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）和α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）兩個細(xì)胞因子作為檢測因子。其中TGF-β1是目前公認(rèn)的腎臟致纖維化因子，其高表達(dá)在慢性環(huán)孢素腎病的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用，是導(dǎo)致慢性環(huán)孢素腎病進(jìn)展的重要因素[2]；α-SMA也是間質(zhì)纖維化發(fā)生的重要細(xì)胞因子，其表達(dá)量可以一定量的反映纖維化程度。通過檢測環(huán)孢素腎病大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA表達(dá)水平，初步探索骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療環(huán)孢素腎病的可能機(jī)制。

材料與方法

一、主要試劑及儀器

兔抗鼠TGF-β1抗體（美國Abcam公司），兔抗鼠α-SMA抗體（美國Santa cruz公司），HRP標(biāo)記羊抗兔二抗試劑盒（中杉公司），RT-PCR試劑盒（Takara公司），LAS 4000凝膠成像儀（日本富士公司）。

二、方法

（一）大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備和鑒定

4周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量60～80 g，采用卓文利等[3]報道的方法分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，同時完成成骨、成脂誘導(dǎo)鑒定，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原CD34-CD45的表達(dá)吸收峰0.9﹪，而CD90表達(dá)吸收峰分別為94.5﹪，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞要求[1]。

（二）實(shí)驗動物分組和干預(yù)方法

SPF級健康雄性SD大鼠30只（150～180 g），購自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心。置于福州總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)中心飼養(yǎng)，給予低鹽飼料[4]（SPF級，購自廣東省實(shí)驗動物中心，鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.042﹪），隨機(jī)分3組：正常對照組（n = 10，C組）、環(huán)孢素組（n = 10，H組）、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組（n = 10，B組）。

模型制備：使用橄欖油溶解環(huán)孢素（諾華制藥提供），大鼠按25 mg/kg·d-1灌胃法給模型組及干細(xì)胞組注入環(huán)孢素，對照組灌入等量橄欖油；干細(xì)胞治療組分別于第7、21天通過尾靜脈注入1 ml干細(xì)胞懸液，濃度1.0×106個/ml，其余各組注入等量生理鹽水，所有大鼠均于第28天頸椎脫臼法處死切取腎臟分別做免疫組化、RT-PCR及Western blot 檢測。

（三）實(shí)驗大鼠相關(guān)指標(biāo)測定

1.免疫組織化學(xué)染色觀察TGF-β1、α-SMA表達(dá)：腎組織經(jīng)石蠟包埋切片、烤片后，常規(guī)二甲苯、梯度酒精脫蠟至水。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法（streptavidin-perosidase，SP）進(jìn)行?？贵w孵育前切片經(jīng)微波修復(fù)，操作按說明書進(jìn)行；最后用3，3'-二氨基聯(lián)苯二胺鹽酸鹽顯色。采用AMS病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)計算。

2. RT-PCR觀察腎臟TGF-β1、α-SMA的mRNA表達(dá)：取100 mg凍存腎臟組織加液氮研磨均勻后，加入TRIzol RNA提取液，按說明書步驟提取，測定RNA濃度，按RT-PCR試劑盒操作順序進(jìn)行RT及PCR反應(yīng)，選取β-actin做內(nèi)參，反應(yīng)結(jié)束取PCR產(chǎn)物各8 μl，加入上樣緩沖液2 μl混勻，1.0﹪的瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

3.Western blot觀察腎臟TGF-β1、α-SMA的蛋白表達(dá)：取適量新鮮冰凍組織塊放置于勻漿器中，用眼科剪將組織塊剪成小塊狀。加入300 μl含PMSF RIPA裂解液裂解后置于勻漿器中進(jìn)行勻漿，以上步驟反復(fù)數(shù)次直至組織完全裂解；Bradford法測定蛋白含量。通過計算各樣本取總量50 μg總蛋白，加入適量上樣緩沖液，變性、電泳、轉(zhuǎn)膜，免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光顯影，凝膠圖象處理系統(tǒng)調(diào)整自動曝光直接讀取圖片并分析目標(biāo)帶凈光密度值。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SAS8.1進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，TGF-β1、α-SMA的免疫組織化學(xué)半定量數(shù)據(jù)、mRNA水平、蛋白表達(dá)水平均采用± s表示。組間差異采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、腎組織病變情況

光鏡下，正常組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)正常，模型組及干細(xì)胞治療組大鼠均可見到不同程度小管萎縮空泡變性、間質(zhì)纖維化增生、炎性細(xì)胞浸潤、腎內(nèi)小動脈壁增厚及動脈透明樣變性，腎小球局灶性硬化等典型的環(huán)孢素腎病特點(diǎn)，但是干預(yù)組病變程度較模型組病變程度輕（圖1）。

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠腎組織（HE染色，×400）

圖2 光學(xué)顯微鏡下觀察TGF-β1免疫組織化學(xué)染色（DAB染色，×400）

二、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

與C組比較，H組、B組TGF-β1（0.899±0.046 vs 9.524±1.232，6.437±0.728；P < 0.01）、α-SMA（2.427±0.188 vs 11.912±2.610，9.232±2.268；P < 0.01）表達(dá)水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與H組比較，B組大鼠的TGF-β1（9.524±1.232vs 6.437±0.728；P < 0.01）、α-SMA（11.912±2.610 vs 9.232±2.268；P < 0.01）表達(dá)水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2，3）。

圖3 光學(xué)顯微鏡下觀察α-SMA免疫組織化學(xué)染色（DAB染色，×400）

三、RT-PCR檢測結(jié)果

與C組比較，H組、B組TGF-β1（0.119±0.003 vs 0.826±0.004，0.651±0.004；P < 0.01）、α-SMA（0.370±0.006 vs 0.900±0.007，0.642±0.007；P < 0.01）mRNA水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與H組比較，B組大鼠的TGF-β1（0.826±0.004 vs 0.651±0.004；P < 0.01）、α-SMA（0.900±0.007 vs 0.642±0.007；P < 0.01）mRNA水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4）。

圖4 RT-PCR結(jié)果

四、Western blot檢測結(jié)果

與C組比較，H組、B組TGF-β1（0.218±0.004 vs 0.825±0.003，0.650±0.006；P < 0.01）、α-SMA（0.263±0.003 vs 0.841±0.003，0.615±0.003；P < 0.01）蛋白水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。與H組比較，B組大鼠的TGF-β1（0.825±0.003 vs 0.650±0.006；P < 0.01）、α-SMA（0.841±0.003 vs 0.615±0.003；P < 0.01）蛋白水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖5）。

圖5 Western blot 結(jié)果

討 論

慢性腎臟疾病是影響人類健康的重要疾病，根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會腎臟病學(xué)分會的統(tǒng)計[5]，我國約有1.2億腎臟患者，每年都有大量的腎病患者進(jìn)展到終末期腎?。‥SRD），雖然腎臟替代治療可以有效延長生命改善生活質(zhì)量，但是昂貴的醫(yī)療支出也成為各國政府和患者家庭沉重的負(fù)擔(dān)[6]。干細(xì)胞技術(shù)是近年來研究的熱點(diǎn)之一，其潛在的細(xì)胞分化和組織修復(fù)能力、免疫調(diào)節(jié)能力都使得人們對其充滿期待[7]。慢性環(huán)孢素腎病模型是良好的腎間質(zhì)纖維化和慢性腎衰模型之一。

在筆者的既往研究中，發(fā)現(xiàn)使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以有效延緩環(huán)孢素腎病的進(jìn)展，大鼠腎功能進(jìn)展速度放緩[1]，病理腎組織切片上也發(fā)現(xiàn)腎組織的間質(zhì)纖維化程度是明顯減輕的。這說明干細(xì)胞治療對于慢性環(huán)孢素腎病的進(jìn)展是有作用的。

關(guān)于干細(xì)胞是如何改善腎功能、減輕環(huán)孢素腎病疾病進(jìn)展的可能機(jī)制，筆者刪選并檢測了部分細(xì)胞因子的表達(dá)水平。其中TGF-β1是目前公認(rèn)的最重要的致肝纖維化因子之一，其高表達(dá)已被證實(shí)在慢性環(huán)孢素腎病的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用，是導(dǎo)致慢性環(huán)孢素腎病進(jìn)展的重要因素；在本研究中發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的腎組織TGF-β1的表達(dá)水平較正常對照組是明顯升高的，這與Dell等[2]的研究報道是一致的。同時，在給予干細(xì)胞治療后，發(fā)現(xiàn)無論是在免疫組織化學(xué)染色、RNA轉(zhuǎn)錄水平 、蛋白表達(dá)水平上TGF-β1表達(dá)量都是顯著下降的，說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以通過下調(diào)TGF-β1表達(dá)從而延緩環(huán)孢素腎病進(jìn)展。

與此同時，筆者也注意到α-SMA的表達(dá)與TGF-β1表達(dá)改變是一致的，α-SMA是成纖維細(xì)胞重要的細(xì)胞表面因子之一，其高表達(dá)是小管間質(zhì)纖維化的重要特征之一[8]，其表達(dá)水平可以反映腎間質(zhì)纖維化程度。既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素腎病大鼠的α-SMA表達(dá)水平是明顯升高的[4,9]，這一點(diǎn)在本研究中也得到了證實(shí)，同時發(fā)現(xiàn)使用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療之后α-SMA表達(dá)水平是明顯下降的，這與筆者前一階段研究中發(fā)現(xiàn)的腎間質(zhì)纖維化評分改善是一致的[1]，也說明在TGF-β1表達(dá)下調(diào)后環(huán)孢素腎病大鼠的腎間質(zhì)纖維化程度也是好轉(zhuǎn)的。

通過本研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞治療可以影響TGF-β1、α-SMA的表達(dá)，同時改善腎組織病變情況，完善了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療環(huán)孢素腎病的機(jī)制研究，但是干細(xì)胞是如何影響這些細(xì)胞因子的表達(dá)水平，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具體如何目前尚未清楚，還需要進(jìn)一步的研究去證實(shí)。

1 張勇, 張巍, 張劍平, 等. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對慢性環(huán)孢素腎病大鼠的治療作用[J/CD]. 中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版）, 2016, 6(3):135-140.

2 Dell K, B?hler T, Gaedeke J, et al. Impact of PGE1 on cyclosporine A induced up-regulation of TGF-betal,its receptors,and related matrix production in cultured mesangial cells[J]. Cytokine, 2003, 22(6):189-193.

3 卓文利, 付云烽, 徐廷昭, 等. 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)純化及生物學(xué)特性的鑒定[J]. 醫(yī)學(xué)臨床研究, 2009, 26(3):386-389.

4 Naesens M, Kuypers DR, Sarwal M. Calcineurin inhibitor nephrotoxicity[J]. Clin J Am Soc Nephrol, 2009, 4(2):481-508.

5 Liu, ZH. Nephrology in China[J]. Nat Rev Nephrol, 2013, 9(9):523-528.

6 United States Renal Data System. Annual data report[Z] , 2015 .

7 Castiglione RC, Maron-Gutierrez T, Barbosa CM, et al. Bone marrowderived mononuclear cells promote improvement in glomerular function in rats with early diabetic nephropathy[J]. Cell Physiol Biochem, 2013, 32(3):699-718.

8 Li C, Lim SW, Sun BK, et al. Expression of apoptosis-related factors in chronic cyclosporine nephrotoxicity after cyclosporine withdrawal[J]. Acta Pharmacol Sin, 2004, 25(4):401-411.

9 Issa N, Kukla A, Ibrahim HN. Calcineurin inhibitor nephrotoxicity: a review and perspective of the evidence[J]. Am J Nephrol, 2013,

張勇,張巍,張劍平,等. 干細(xì)胞對環(huán)孢素腎病大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長因子β1的影響[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版）, 2017, 7(1):18-22.

Effect of mesenchymal stem cells on transforming growth factor-β1 in renal tissue of chronic cyclosporine nephropathy in rats

Zhang Yong, Zhang Wei, Zhang Jianping, Zhuo W enli, Wu Weizhen, Tan Jianming.1the Second Military Medical University, Shanghai 200433, China;2Department of Urology, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command, Fuzhou 350025, China

Tan Jianming, Email:tanjim156@xmu.Edu.cn

ObjectivesTo investigate the effect of mesenchymal stem cells on transforming growth factor-β1 in the renal tissue of rats with chronic cyclosporine nephropathy.MethodsThe experimental animals were divided into 3 groups: Group C: normal group（control）; Group H: chronic cyclosporine nephropathy group; Group B: mesenchymal stem cells therapy group. On day 28 kidney tissue was evaluated for the expression levels of TGF-β1 and α-SMA by immunohistochemistry, RT-PCR, and Western blot.Results（1）Immunohistochemistry results: Compared with group C, TGF-β1（0.899±0.046 vs 9.524±1.232, 6.437±0.728; P < 0.01）, α-SMA（0.370±0.006 vs 0.900±0.007, 0.642±0.007; P < 0.01）in model group and group Bare significantly increased. Compared with group H, expression levels of the above proteins in the groups B decreased（TGF-β1: 9.524±1.232 vs 6.437±0.728; P < 0.01; α-SMA:11.912±2.610 vs 9.232±2.268, P < 0.01）.（2）RT-PCR results: Compared with group C, TGF-β1（0.119±0.003 vs 0.826±0.004, 0.651±0.004; P < 0.01）, α-SMA（0.370±0.006 vs 0.900±0.007, 0.642±0.007; P < 0.01）in group H and group B are significantly increased. Compared with group H, expression levels of the above proteins in groups B decreased（TGF-β1: 0.826±0.004 vs 0.651±0.004; P < 0.01; α-SMA: 0.900±0.007 vs 0.642±0.007; P < 0.01）;（3）Western blot results: Compared with group C, TGF-β1（0.218±0.004 vs 0.825±0.003, 0.650±0.006; P < 0.01）, α-SMA（0.370±0.006 vs 0.900±0.007, 0.642±0.007; P < 0.01）in model group and group B significantly increased. Compared with group H, expression levels of the above proteins decreased in group B（TGF-β1: 0.825±0.003 vs 0.650±0.006; P < 0.01; 0.841±0.003 vs 0.615±0.003; P < 0.01）.ConclusionBone mesenchymal stem cells can mitigate renal interstitial fibrosis by decreasing the expression of TGF-β1 and α-SMA.

Cyclophilins; Kidney diseases; Bone marrow; Mesenchymal stem cells; Chronic cyclosporine nephropathy; Transforming growth factor β1

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.01.004

福建省重大專項課題（2012YZ0001）

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)1；350025 福州，南京軍區(qū)福州總醫(yī)院泌尿外科2

譚建明，Email：tanjim156@xmu.Edu.cn