黃團結宋及時馬珊珊程康邢衢李鵬劉騰飛楊波關方霞,

·論著·

重組人MG53蛋白對人臍帶間充質(zhì)干細胞氧化損傷的保護作用

黃團結1宋及時1馬珊珊1程康1邢衢1李鵬1劉騰飛1楊波2關方霞1,2

目的 建立人臍帶間充質(zhì)干細胞（hUC-MSCs）的H2O2氧化損傷模型，探討重組人MG53蛋白（rhMG53）對hUC-MSCs氧化損傷的保護作用。方法 使用組織塊培養(yǎng)法從健康人臍帶沃頓膠組織中分離培養(yǎng)hUC-MSCs，流式細胞儀檢測細胞表型；CCK-8法檢測hUC-MSCs的增殖和H2O2損傷程度。實驗分為正常對照組（NC組）、rhMG53組、H2O2組和H2O2+rhMG53組。分別采用CCK-8法、Transwell小室、流式細胞術和β-半乳糖苷酶染色檢測rhMG53蛋白對hUC-MSCs增殖、遷移、周期凋亡和衰老的影響。各組、各個時間點的吸光值采用析因設計的方差分析，組間比較采用單因素方差分析。結果 hUC-MSCs貼壁呈梭型生長，高表達間充質(zhì)干細胞標志CD44、CD133、HLA-ABC，低表達CD34、CD45；H2O2對hUC-MSCs具有濃度和時間依賴性的損傷作用，確定200 μmol/L的H2O2處理16 h為hUC-MSCs氧化損傷的最適條件。與NC組相比，H2O2組細胞增殖（0.994±0.011 vs 1.331±0.014）、遷移率（8.15﹪±2.47﹪ vs 33.34﹪±3.62﹪）和S期細胞比例（29.67﹪±3.69﹪ vs 34.33﹪±4.25﹪）顯著降低，細胞衰老（44.07﹪±5.26﹪ vs 5.7﹪±1.42﹪）和凋亡比例（52.63﹪±5.76﹪ vs 4.65﹪±1.23﹪）顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）；rhMG53組細胞增殖（1.509±0.086 vs 1.331±0.014）和遷移率（52.13﹪±5.46﹪ vs 33.34﹪±3.62﹪）顯著提高，S期比例（35.27﹪±4.79﹪ vs 34.33﹪±4.25﹪）變化差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），細胞衰老（3.92﹪±1.31﹪vs 5.7﹪±1.42﹪）和凋亡比例（3.96﹪±1.06﹪ vs 4.65﹪±1.23﹪）顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）。與H2O2組相比，H2O2+ rhMG53組細胞增殖（1.252±0.056 vs 0.994±0.011）、遷移率（18.93﹪±3.12﹪ vs 8.15﹪±2.47﹪）和S期比例（34.84﹪±3.45﹪ vs 29.67﹪±3.69﹪）顯著提高，細胞衰老（17.89﹪±2.64﹪ vs 44.07﹪±5.26﹪）和凋亡比例（4.65﹪±1.23﹪ vs 17.63﹪±2.56﹪）顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）。結論 rhMG53對H2O2造成的hUC-MSCs氧化損傷有保護作用。

磷蛋白類； 臍帶； 間質(zhì)干細胞； 創(chuàng)傷和損傷； 保護

干細胞具有自我更新和多向分化潛能，在多種疾病的治療中顯示了廣闊的應用前景，受到了廣泛的關注[1-3]。人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）具有來源豐富、取材方便、免疫原性低、無倫理爭議等優(yōu)點，是成體干細胞的理想來源，現(xiàn)已在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病和多種組織損傷的治療等方面進行了深入的研究[4-8]。

細胞代謝產(chǎn)生的氧自由基能夠誘導生物膜中的不飽和脂肪酸均裂，形成脂性氧自由基和脂質(zhì)過氧化物，導致生物膜結構破壞，最終誘導細胞凋亡[9-10]。過氧化氫（H2O2）是一種細胞毒性氧，性質(zhì)活潑，半衰期短，能奪取電子使其他分子氧化對細胞造成持續(xù)性的損害，誘導細胞的衰老和死亡，因此常用作生物氧化劑，研究其對細胞損傷、凋亡和衰老的作用[11-13]。組織損傷后，由于炎癥反應及大量氧自由基的產(chǎn)生，會造成移植治療的干細胞存活和遷移的數(shù)量降低，從而影響干細胞移植治療的效果[14-16]。因此，增強干細胞的抗損傷能力、提高其生存率對干細胞治療具有重要的意義。

MG53是有三重結構域TRIM家族肌特異性蛋白，最新的研究表明其在多種細胞的細胞膜修復中發(fā)揮重要作用，并且對多種組織損傷具有保護和修復作用[17-19]。但是重組人MG53蛋白（rhMG53）對hUC-MSCs的損傷修復作用未見報道。在本實驗中，建立了hUC-MSCs的H2O2氧化損傷模型，研究rhMG53對hUC-MSCs在體外培養(yǎng)條件下的保護作用，對加深MG53蛋白功能的認識和加強MG53蛋白應用的研究具有重要意義，為干細胞的生存促進作用提供了理論的依據(jù)。

材料與方法

一、實驗材料

臍帶組織來源于鄭州大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科健康足月剖腹產(chǎn)胎兒，家屬知情并同意捐贈；rhMG53蛋白由美國俄亥俄州立大學麻建杰教授贈送；CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；酶標儀（上海圣荷西公司）；倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基、胰酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青霉素鏈霉素混合液（美國Hyclone公司）；胎牛血清（FBS）（美國Gemini公司）；CCK-8細胞增殖-毒性檢測試劑盒（日本同仁化學研究所）；細胞周期檢測試劑盒、半乳糖苷酶細胞衰老檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所）；細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）。

二、實驗方法

1. hUC-MSCs的分 離 和傳 代 培養(yǎng)：hUC-MSCs的分離培養(yǎng)方法同參考文獻[20]。

2. hUC-MSCs的表面抗原鑒定：取培養(yǎng)瓶中3代hUC-MSCs加入無EDTA的胰酶進行消化，收集細胞，使用預冷的PBS沖洗細胞3次。加入PBS重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×106個/ml；每100 μl細胞懸液，分別加2 μlCD34-FITC、CD44-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC、CD133-FITC抗體及相應的同型對照抗體，充分混勻后，4 ℃孵育30 min；孵育完成后，補加400 μl的PBS，離心棄上清液，然后加入500 μl的PBS重懸細胞，使用流式細胞儀檢測的細胞表面抗原的表達。

3. hUC-MSCs氧化損傷模型的建立：設置H2O2的濃度梯度為0，50，100，200，300，400 μmol/L。取3代hUC-MSCs細胞接種于96孔板，每孔加入100 μl（密度為3×104個/ml）細胞懸液，待細胞融合度達到60﹪時，分別加入含不同濃度H2O2的培養(yǎng)基，每組設置3個重復，在37 ℃、5﹪ CO2濃度和飽和濕度條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)8、16、24、48、72 h后，每組各選取3個孔，去除舊培養(yǎng)基并加入100 μl新培養(yǎng)基和10 μlCCK-8，在細胞培養(yǎng)箱37 ℃條件下孵育2 h，使用酶標儀在450 nm波長檢測各組處理的（A）值。

4. CCK-8法檢測rhMG53對hUC-MSCs增殖的影響：實驗共分4組，分別為NC組：正常培養(yǎng)的hUC-MSCs；MG53組：添加30 μg/ml rhMG53培養(yǎng)的hUC-MSCs；H2O2組：添加200 μmol/L H2O2培養(yǎng)的hUC-MSCs；H2O2+ rhMG53組：添加30 μg/ml rhMG53和200 μmol/L H2O2培養(yǎng)hUC-MSCs。取3代hUC-MSCs細胞接種于96孔板中，每孔加入100 μl（密度為3×104個/ml）待細胞融合度達到50﹪時，加入含不同濃度rhMG53的培養(yǎng)基，每組設置3個重復，在37 ℃、5﹪ CO2濃度、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每8小時使用CCK-8法檢測細胞增殖情況，使用酶標儀在450 nm波長檢測各組處理的（A）值。

5. Transwell小室觀察rhMG53對hUC-MSCs遷移的影響：培養(yǎng)3代hUC-MSCs，待細胞融合度達60﹪時，分組處理細胞，16 h后，經(jīng)胰酶消化離心并收集細胞，使用PBS清洗細胞3次；然后，用無血清的DMEM/F12 細胞培養(yǎng)液重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×105個/ml，選取8.0 μm孔徑的Transwell小室，在上室接種300 μl（3×104個）重懸的細胞，下室使用含血清的正常細胞培養(yǎng)基；24 h后將去除培養(yǎng)液，加入1 ml 4﹪多聚甲醛固定10 min，然后去除甲醛，加入結晶紫染液染色30 min；擦除上層細胞，在倒置顯微鏡下觀察遷移的細胞，拍照、計數(shù)并分析細胞遷移率。

6. PI染色法檢測rhMG53對不同處理hUCMSCs周期的影響：在6孔板中培養(yǎng)3代細胞，待細胞融合度達到60﹪以上時，分組處理細胞，16 h后收集；PBS清洗細胞2次后加入1 ml預冷的70﹪乙醇，吹打混勻，在4 ℃條件下固定24 h；1 000×g離心3 min，吸除上清，PBS清洗后收集細胞。然后在每管細胞樣品中加入0.5 ml碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細胞沉淀，在37 ℃避光條件下30 min，隨后在4 ℃避光存放。用流式細胞儀在激發(fā)波長488 nm處檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。采用分析軟件進行細胞DNA含量分析。

7. β-半乳糖苷酶染色檢測rhMG53對hUCMSCs衰老的影響：在12孔板中接種細胞，每孔接種量為1×104個，待細胞融合度達到60﹪以上時，分組處理細胞，16 h后去除細胞培養(yǎng)液，加入1 ml β-半乳糖苷酶染色固定液10 min，隨后去除細胞固定液，PBS洗滌細胞3次；然后每孔加入1 ml染色工作液，37 ℃孵育過夜。在光學顯微鏡下觀察，被染藍色的細胞為衰老細胞，拍照、計數(shù)并計算陽性細胞率。

8. FITC-Annexin V/PI染色檢 測rhMG53對hUC-MSCs凋亡的影響：在6孔板中培養(yǎng)細胞，細胞融合度達到60﹪以上時，分組處理細胞，16 h后使用無EDTA的胰酶消化收集細胞，并使用預冷的PBS沖洗細胞，然后1000×g離心3 min，吸除上清液，加入500 μl的1×Binding Buffer懸浮細胞。隨后，加入5 μl的Annexin V-FITC混勻后，在避光條件下室溫孵育15 min。在流式細胞儀檢測前5 min，加入5 μl的PI進行染色，使用流式細胞儀分析細胞的凋亡情況。

三、統(tǒng)計學分析方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計處理，各組細胞在各個時間點的吸光值，各組細胞的遷移率、S期比例、衰老和凋亡率用±s描述，最適損傷條件的確立、不同處理組細胞的增殖采用析因設計的方差分析進行統(tǒng)計，不同組細胞的遷移、周期、凋亡、衰老等方面的比較采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、hUC-MSCs的培養(yǎng)特性

使用組織塊培養(yǎng)法分離hUC-MSCs，一周后可見組織塊間隙分散著排列緊密、輪廓清晰、旋渦狀生長且呈長梭形的細胞（圖1a）。傳代培養(yǎng)的hUCMSCs在第3代形態(tài)沒發(fā)生改變（圖1b）。

圖1 倒置光學顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的hUC-MSCs形態(tài)(×100)

二、hUC-MSCs免疫表型鑒定

流式細胞儀檢測結果（圖2）表明：3代的hUCMSCs不表達造血系細胞表面標志CD34、CD45，高表達間質(zhì)細胞標志CD44、干細胞標志CD133，同時表達人白細胞抗原HLA-ABC，具有間充質(zhì)干細胞的特性。

圖2 P3代hUC-MSCs免疫表型分析流式圖

三、H2O2氧化損傷hUC-MSCs模型的建立

使用不同濃度的H2O2處理hUC-MSCs，細胞表面泡狀物增加，隨著時間推移細胞逐漸死亡（圖3）。CCK-8檢測不同濃度H2O2處理的hUC-MSCs的結果顯示，H2O2對hUC-MSCs具有濃度和時間依賴性的損傷作用（表1），200 μmol/L濃度的H2O2處理16 h對hUC-MSCs增殖有抑制作用，對細胞造成了損傷，但并未完全破壞細胞的增殖能力。因此后續(xù)使用200 μmol/L濃度H2O2處理16 h構建hUCMSCs氧化損傷模型。

四、rhMG53對hUC-MSCs增殖的影響

與NC組相比，rhMG53能顯著提升hUCMSCs的增殖能力，H2O2組細胞的增殖能力減弱；與H2O2組相比，H2O2+ rhMG53組細胞增殖能力得到提升，差異具有統(tǒng)計學意義（P < 0.001，表2）。

表1 不同濃度H2O2處理對hUC-MSCs 增殖的影響（OD450± s）

表1 不同濃度H2O2處理對hUC-MSCs 增殖的影響（OD450± s）

注：F時間= 1352.522，F(xiàn)濃度= 915.584，F(xiàn)交互= 92.823，P均< 0.001

H2O2/（μmol/L）t（培養(yǎng)）/h 0 8 0.221±0.011 0.481±0.012 0.546±0.013 0.866±0.058 1.216±0.035 1.486±0.063 50 0.224±0.019 0.517±0.031 0.588±0.017 0.831±0.046 1.225±0.116 1.331±0.014 100 0.243±0.018 0.451±0.012 0.561±0.011 0.755±0.051 1.255±0.027 1.342±0.018 200 0.236±0.016 0.311±0.012 0.361±0.019 0.494±0.035 0.856±0.046 1.027±0.050 300 0.234±0.018 0.231±0.013 0.245±0.014 0.326±0.032 0.501±0.062 0.601±0.049 400 0.228±0.014 0.208±0.013 0.217±0.018 0.219±0.013 0.213±0.019 0.215±0.018 F 值 1.806 245.197 996.897 127.538 161.689 473.773 P 值 0.186 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 16 24 32 40 0

表2 CCK-8檢測不同處理組的hUC-MSCs A值的變化（OD450，± s）

表2 CCK-8檢測不同處理組的hUC-MSCs A值的變化（OD450，± s）

注：F時間= 1126.184，F(xiàn)= 189.911，F(xiàn)組間交互= 16.364，P均< 0.001

分組16 24 32 40 NC 0.224±0.019 0.369±0.031 0.568±0.036 0.871±0.078 1.259±0.067 1.331±0.014 rhMG53 0.231±0.014 0.415±0.028 0.722±0.022 1.032±0.075 1.476±0.054 1.509±0.086 H2O2 0.236±0.016 0.310±0.012 0.360±0.019 0.527±0.058 0.856±0.046 0.994±0.011 H2O2+ rhMG53 0.221±0.011 0.363±0.041 0.529±0.017 0.799±0.057 1.183±0.053 1.252±0.056 F 值 0.787 6.181 121.970 29.063 64.647 51.043 P 值 0.534 0.018 0.0000.0000.0000.000 t（培養(yǎng)）/h 0 8

圖3 倒置光學顯微鏡觀察H2O2處理的hUC-MSCs形態(tài)變化(×100)

圖4 不同處理組遷移細胞數(shù)量分析

五、rhMG53對hUC-MSCs遷移的影響

Transwell小室觀察不同處理組細胞遷移能力結果（圖4、5）。與NC組（33.34±3.62）﹪相比，rhMG53組細胞的遷移數(shù)目顯著增加（52.13± 5.46）﹪，H2O2組細胞遷移數(shù)目顯著減少（8.15± 2.47）﹪；與H2O2組相比，H2O2+ rhMG53組細胞的遷移數(shù)目顯著增加（18.93±3.12）﹪，具有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。

六、rhMG53對hUC-MSCs周期的影響

圖5 光學顯微鏡觀察Transwell小室下不同處理組hUC-MSCs的遷移（結晶紫染色，×200）

流式細胞儀檢測不同處理組細胞的周期變化結果見圖6、7。與NC組S期細胞所占百分比（34.33±4.25）﹪相比，rhMG53組S期細胞（35.27± 4.79）﹪有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義；H2O2組S期細胞（29.67±3.69）﹪減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。與H2O2組相比，H2O2+ rhMG53組在S期細胞（34.84±3.45）﹪增加明顯，具有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。

圖6 不同處理組細胞S期百分比分析

七、rhMG53對hUC-MSCs衰老的影響

相對于NC組（5.7±1.42）﹪，rhMG53組的衰老細胞藍染率（3.92±1.31）﹪顯著降低，H2O2組（44.07±5.26）﹪ 和H2O2+ rhMG53組（17.89± 2.64）﹪的hUC-MSCs衰老細胞的藍染率增加顯著；與H2O2組相比，H2O2+ rhMG53組細胞的藍染率顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05，圖8、9）。

八、rhMG53對hUC-MSCs凋亡的影響

流式細胞儀檢測不同處理組細胞的凋亡（圖10、11）。結果顯示，相比NC組（4.65±1.23）﹪，rhMG53組的細胞的凋亡率（3.96±1.06）﹪顯著降低，H2O2組（52.63±5.76）﹪和H2O2+ rhMG53組（17.63±2.56）﹪細胞的凋亡率增加顯著；相對于H2O2組，H2O2+ rhMG53組的細胞的凋亡率顯著減少（P < 0.05)。

討 論

一、干細胞治療的有效性及瓶頸問題

圖7 流式細胞儀檢測不同處理hUC-MSCs的細胞周期變化

圖8 不同處理組藍染細胞數(shù)量分析

圖10 不同處理組凋亡細胞數(shù)量分析

干細胞具有高度的自我更新及多向分化潛能，在治療脊髓損傷、中風及腦損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中取得了令人鼓舞的結果[21-22]。本研究的前期結果顯示hUC-MSCs能明顯改善腦損傷小鼠的行為及空間學習記憶功能，部分移植細胞能遷移至損傷部位并存活分化[8]。但是，進一步研究發(fā)現(xiàn)損傷組織局部存在嚴重的缺血缺氧、炎性反應、氧化應激反應和細胞毒性物質(zhì)積累，導致干細胞在損傷部位的存活數(shù)量很低，從而影響治療效果。因此，在體內(nèi)外氧化損傷微環(huán)境中，增強干細胞的抗氧化能力，提高干細胞在氧化條件的存活數(shù)量，對于增加干細胞的治療效果至關重要。

圖9 倒置顯微鏡觀察檢測不同處理對hUC-MSCs細胞衰老影響情況（β-半乳糖苷酶染色，×200）

圖11 流式細胞儀檢測不同處理hUC-MSCs的細胞凋亡變化

二、H2O2氧化損傷hUC-MSCs模型的建立

H2O2作為一種常用的氧化劑，常用于建立細胞過氧化損傷模型研究細胞衰老和凋亡作用，且不同的細胞對于抵抗外界應激源的反應敏感程度不同，構建氧化損傷模型使用的H2O2作用濃度與作用時間也不同[23-25]。在本實驗中，探討并確定使用較低濃度H2O2較長時間（200 μmol/L，16 h）建立細胞氧化損傷模型，該模型具有造模方法簡便，細胞凋亡和衰老比率適宜，易于處理的優(yōu)勢，為研究氧化損傷的細胞提供便利。

三、rhMG53對hUC-MSCs氧化損傷的保護及其機制的探討

MG53作為新發(fā)現(xiàn)的肌特異性蛋白，在細胞膜表面損傷修復中起關鍵性作用[26-27]?，F(xiàn)有的研究證實，其對多種不同細胞包括肌纖維細胞、上皮細胞、神經(jīng)細胞、間質(zhì)細胞以及骨髓間質(zhì)干細胞等細胞具有保護和損傷修復作用[28]。研究發(fā)現(xiàn)rhMG53能夠提高促生存通路蛋白pAKT、pGSK-3β、pERK的表達，而PI3K/AKT信號通路能夠介導多種生長因子，是促進細胞存活的重要通路。當PI3K蛋白受到外界信號刺激后，與AKT蛋白的N端保守的PH結構域結合并轉(zhuǎn)位到胞膜上，AKT蛋白被PDK1和PDK2磷酸化而激活，然后磷酸化多個蛋白GSK-3β、FKHR、CaMKⅡ等，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和存活[29-31]。

因此，進一步觀察rhMG53對hUC-MSCs氧化損傷的的保護作用。結果發(fā)現(xiàn)：rhMG53蛋白能促進氧化損傷的hUC-MSCs的增殖，提高hUCMSCs的遷移，抑制氧化損傷的hUC-MSCs的衰老和凋亡。認為其可能機制是rhMG53蛋白提高了細胞生存通路相關磷酸化蛋白的表達和SOD等抗氧化蛋白表達，提高了細胞對不良環(huán)境的耐受能力，并且能夠保護細胞膜對不良環(huán)境包括外界物理剪切作用和生化微環(huán)境的抗性，提高了細胞膜的損傷修復能力，從而提高了hUC-MSCs的存活率，減少了細胞凋亡和衰老。關于rhMG53是否通過促生存信號通路對hUC-MSCs氧化損傷發(fā)揮保護作用，還需進一步研究。

1 Negroni E, Gidaro T, Bigot A, et al. Invited review: Stem cells and muscle diseases: advances in cell therapy strategies[J]. Neuropathol Appl Neurobiol, 2015, 41(3):270-287.

2 Haarer J, Johnson CL, Soeder Y, et al. Caveats of mesenchymal stem cell therapy in solid organ transplantation[J]. TransplInt, 2015, 28(1):1-9.

3 Pastides P, Chimutengwende-Gordon M, Maffulli N, et al. Stem cell therapy for human cartilage defects: a systematic review[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2013, 21(5):646-654.

4 李俊霞, 周欣諭, 丘美蘭, 等. 臍帶間充質(zhì)干細胞對難治性腎病綜合征的療效觀察[J/CD]. 中華細胞與干細胞雜志（電子版）, 2016, 6(2): 92-96.

5 Shi W, Nie D, Jin G, et al. BDNF blended chitosan scaffolds for human umbilical cord MSC transplants in traumatic brain injury therapy[J]. Biomaterials, 2012, 33(11):3119-3126.

6 Zhou X, Gu J, Gu Y, et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells improve learning and memory function in hypoxic-ischemic brain-damaged rats via an IL-8-mediated secretion mechanism rather than differentiation pattern induction[J]. Cell rPhysiol Biochem, 2015, 35(6):2383-2401.

7 曾桂芳, 謝長峰, 徐紹坤, 等. 人臍帶間充質(zhì)干細胞對腫瘤細胞生長及軟瓊脂克隆形成的影響[J/CD]. 中華細胞與干細胞雜志（電子版）, 2016, 6(2):97-104.

8 宋及時, 馬珊珊, 孟楠, 等. rhMG53蛋白聯(lián)合hUC-MSCs移植對阿爾茨海默鼠的治療作用[J]. 鄭州大學學報:醫(yī)學版, 2016, 51(4):442-446.

9 Mc V, Jm F, Nu D, et al. Mitochondrial oxidative stress caused by Sod2 de fi ciency promotes cellular senescence and aging phenotypes in the skin[J]. Aging, 2012, 4(1):3-12.

10 Ray PD, Huang BW, Tsuji Y. Reactive oxygen species(ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling[J]. Cell Signal, 2012, 24(5):981-990.

11 Liu T, Zhao H. Setting up the oxidative cell mode with hippocampal cell of primary culture induced by H2O2[J]. Wei Sheng Yan Jiu, 2014, 43(5):719-723.

12 Xu D, Liu D, Wang B, et al. In situ OH Generation from O2- and H2O2plays a critical role in plasma-induced cell death[J]. PLoS One, 2015, 10(6):e0128205.

13 Wang SA, Meckling KA, Marcone MF, et al. In vitro antioxidant synergism and antagonism between food extracts can Lead to similar activities in H2O2-induced cell death, caspase-3 and MMP-2 activities in H9c2 cells[J]. J Sci Food Agric, 2012, 92(15):2983-2993.

14 Wei W, Ying X, Zhang W, et al. Effects of vitexin-2’’-O-rhamnoside and vitexin-4 ‘’-O-glucoside on growth and oxidative stress-induced cell apoptosis of human adipose-derived stem cells[J]. J Pharm Pharmacol, 2014, 66(7):988-997.

15 Wu Y, Zhang X, Kang X, et al. Oxidative stress inhibits adhesion and transendothelial migration, and induces apoptosis and senescence of induced pluripotent stem cells[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2013, 40(9):626-634.

16 Lu BY, Ye ZZ, Deng YB, et al. MEK/ERK pathway mediates cytoprotection of salvianolic acid B against oxidative stress-induced apoptosis in rat bone marrow stem cells[J]. Cell BiolInt, 2010, 34(11): 1063-1068.

17 Cai C, Masumiya H, Weisleder N, et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery[J]. Nat Cell Biol, 2009, 11(1):56-64.

18 Wang X, Xie W, Zhang Y, et al. Cardioprotection of ischemia/ reperfusion injury by cholesterol-dependent MG53-mediated membrane repair[J]. Circ Res, 2010, 107(1):76-83.

19 Yao YG, Zhang B, Zhu H, et al. MG53 permeates through blood-brain barrier to protect ischemic brain injury[J]. Oncotarget, 2016, 7(16):22474-22485.

20 馬珊珊, 渠瑞娜, 田毅, 等. 臍帶沃頓膠干細胞移植對脊髓損傷大鼠炎癥因子表達的影響[J]. 中國組織工程研究, 2015, 19(23):3729-3735.

21 Popa-Wagner A, Buga AM, Doeppner TR, et al. Stem cell therapies in preclinical models of stroke associated with aging[J]. Front Cell Neurosci, 2014, 8(347):1-10.

22 Tanna T, Sachan V. Mesenchymal stem cells: potential in treatment of neurodegenerative diseases[J]. Curr Stem Cell Res Ther, 2014, 9(6):513-521.

23 Minorsky PV. Peroxisomes: organelles of diverse function[J]. Plant Physiol, 2002, 130(2):517-518.

24 彭亮, 李知敏. 紫萍提取物對過氧化氫誘導內(nèi)皮細胞氧化損傷的保護作用研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2009, 20(4):996-998.

25 金鹿, 閆素梅, 史彬林, 等. 過氧化氫誘導的奶牛乳腺上皮細胞氧化損傷模型的建立[J]. 動物營養(yǎng)學報, 2014, 26(12):3651-3658.

26 Li HC, Duann P, Fan ZB, et al. The therapeutic role of recombinant human MG53 protein in wound healing[J]. Biophys J, 2014, 106 (2, suppl1):95a.

27 Levy JR, Campbell KP, Glass DJ. MG53's new identity[J]. Skelet Muscle, 2013, 3(1):25.

28 Weisleder N, Takizawa N, Lin P, et al. Recombinant MG53 protein modulates therapeutic cell membrane repair in treatment of muscular dystrophy[J]. SciTransl Med, 2012, 4(139):139ra85.

29 Lin X, Zhang X, Wang Q, et al. Perifosine downregulates MDR1 gene expression and reverses multidrug-resistant phenotype by inhibiting PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway in a human breast cancer cell line [J]. Neoplasma, 2012, 59(3):248-256.

30 Chen JZ, Crawford R, Chen C, et al. The key regulatory roles of the PI3K/Akt signaling pathway in the functionalities of mesenchymal stem cells and applications in tissue regeneration[J]. Tissue Eng Part B Rev, 2013, 19(6):516-528.

31 Ellert-Miklaszewska A, Kaminska B, KonarskaL. Cannabinoids down-regulate PI3K/Akt and erksignalling pathways and activate proapoptotic function of bad protein[J]. Cell Signal, 2005, 17(1):25-37.

MG53 protects umbilical cord mesenchymal stem cells from oxidative damage

Huang Tuanjie1, Song Jishi1, Ma Shanshan1, Cheng Kang1, Xing Qu1, Li Peng1, Liu Tengfei1, Yang Bo2, Guan Fangxia1,2.1Department of Stem Cell Resear ch, School of Life Science, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China;2Stem Cell Research Laboratory, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China

Ma Shanshan, Email: mashanshan84@163.com

ObjectiveTo establish a H2O2oxidative damage model of human umbilical cord mesenchymal stem cells（hUC-MSCs）, and to investigate the protective effects of recombinant human MG53 protein（rhMG53）on hUC-MSCs oxidative damage.MethodshUC-MSCs were isolated from human umbilical cord tissue collected from healthy donors, and the cell phenotype was determined by flow cytometry; the H2O2-treated P3 hUC-MSCs were evaluated by CCK-8 method. The cells were allocated into four groups: normal control group（NC group）, rhMG53 group, H2O2group and H2O2+ rhMG53 group. The effect of rhMG53 on hUC-MSC proliferation, migration, senescence, cell cycle and apoptosis was respectively detected by CCK-8 assay, Transwell assay, flow cytometry and β-galactosidase staining. Cell proliferation was analyzed by the variance analysis of factorial design, and the single factor variance analysis was used to compare the differences between groups.ResultsThe P3 hUC-MSCs were adherent and spindle shaped, and expressed mesenchymal stem cell markers CD44, CD133, HLA-ABC, with low expression of CD34 and CD45. H2O2inhibited hUC-MSC growth in a concentration and time-dependent manner.When hUC-MSCs were treated with 200 μmol/L H2O2for 16 h, the proliferation（0.994±0.011 vs 1.331±0.014), migration（8.15﹪±2.47﹪ vs 33.34﹪±3.62﹪）and percentage of cells in S phase（29.67﹪±3.69﹪vs 34.3﹪ 3±4.25﹪）decreased, while the proportion of senescent cells（44.07﹪ ±5.26﹪ vs 5.7﹪±1.42﹪）and apoptosis（52.63﹪±5.76﹪ vs 4.65﹪±1.23﹪）significantly increased in the H2O2group compared with the NC group. The proliferation（1.509±0.086 vs 1.331±0.014）and migration（52.13﹪±5.46﹪ vs 33.34﹪±3.62﹪）of cells in the rhMG53 group increased significantly. The proportion of cells in S phase（35.27﹪ ±4.79﹪ vs 34.33﹪ ±4.25﹪）was similar（P > 0.05）, and the proportion of senescent cells（3.92﹪±1.31﹪ vs 5.7﹪±1.42﹪）and apoptosis（3.96﹪±1.06﹪ vs 4.65±1.23﹪）was significantly decreased in the rhMG53 group（P < 0.05）. Compared with the H2O2group, the cell proliferation（1.252±0.056 vs 0.994±0.011）, migration ability（18.93﹪ ±3.12﹪ vs 8.15﹪ ±2.47﹪） and the proportion of cells in S phase（34.84﹪±3.45﹪ vs 29.67﹪±3.69﹪）of H2O2+ rhMG53 group was significantly increased, the proportion of senescent cells（17.89﹪ ±2.64﹪ vs 44.07﹪ ±5.26﹪）and apoptosis（4.65﹪±1.23﹪ vs 17.63﹪±2.56﹪）was significantly decreased（P < 0.05）.

Phosphoproteins; Umbilical cord; Mesenchymal stem cells; Wounds and injuries; Protection

2016-09-26）

（本文編輯：陳媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.01.007

國家自然科學基金（81601078，81471306）；河南省國際人才合作項目（2016GH03，2016GH15）

450001 鄭州大學生命科學學院1；450052 鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科2

馬珊珊，Email：mashanshan84@163.com

黃團結，宋及時，馬珊珊，等.重組人MG53蛋白對人臍帶間充質(zhì)干細胞氧化損傷的保護作用[J/CD].中華細胞與干細胞雜志（電子版）, 2017, 7(1):35-44.