焦揚趙洪波劉平付旭鋒陳國棟羅曉曦桑雄波鄭冰蓉

·論著·

人臍帶間充質(zhì)干細胞神經(jīng)向分化與去分化基因表達譜分析

焦揚1,2趙洪波2劉平1付旭鋒1陳國棟1羅曉曦1桑雄波1鄭冰蓉1

目的 用生物信息學方法從公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(GEO)中初步篩選出與人臍帶間充質(zhì)干細胞（hUC-MSCs）神經(jīng)向分化和去分化相關(guān)的生物學功能和對應(yīng)的信號通路，分析蛋白互作關(guān)系，為進一步開展hUC-MSCs神經(jīng)向分化和去分化的實驗研究提供指導信息。方法 在公共基因芯片數(shù)據(jù)庫GEO中搜尋hUC-MSCs神經(jīng)向分化與去分化的基因芯片數(shù)據(jù)，用R和Bioconductor軟件包進行統(tǒng)計學分析，篩選差異基因；用GeneAnalytics在線分析工具進行GO分析和通路分析；用STRING數(shù)據(jù)庫進行差異表達基因?qū)?yīng)的蛋白互作關(guān)系分析。結(jié)果 共篩選得到影響神經(jīng)向分化和去分化過程的670個上調(diào)基因和1 458個下調(diào)基因；進一步對這些差異基因進行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)過程的功能集中表現(xiàn)為促血管生成和細胞黏附，下調(diào)的生物學過程則主要和代謝相關(guān)；上調(diào)通路主要有與細胞增殖、分化、凋亡有關(guān)的ERK、血管生成和Akt等通路，下調(diào)通路主要有與細胞代謝和生物合成相關(guān)的萜類化合物骨架生物合成、Cholesterot Biosynthesis II和磷酸肌醇代謝等通路，其中特別的是，維持胚胎干細胞多能性的Nanog通路出現(xiàn)在下調(diào)通路中；蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，與血管生成、細胞黏附相關(guān)的蛋白VEGFA、IL-6、FGF2、MMP和IL-8有較高的degree值。結(jié)論 影響hUC-MSCs神經(jīng)向分化和去分化的因素很多，其中，促進血管生成、細胞黏附及細胞繁殖相關(guān)的基因、生物反應(yīng)過程、信號通路及相關(guān)蛋白起著重要作用。上述基于生物信息學的篩查分析結(jié)果為進一步開展hUC-MSCs神經(jīng)向分化與去分化實驗研究提供了一定的參考信息。

計算生物學； 臍帶； 間質(zhì)干細胞； 細胞分化； 細胞去分化； 基因表達譜

人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord mesenchymal stromal cells，hUC-MSCs）取材容易，增殖力強[1]，免疫原性低[2]，優(yōu)于其他來源的間充質(zhì)干細胞，且不涉及倫理問題，是干細胞臨床治療理想的種子細胞，特別對于神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在體外，hUC-MSCs已經(jīng)被成功地向神經(jīng)細胞誘導分化，并且發(fā)現(xiàn)，當hUC-MSCs向神經(jīng)樣細胞分化的同時，還會分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子[3-4]。現(xiàn)今，已有將hUCMSCs用于帕金森病[5-6]、缺血性腦損傷[7]、脊髓損傷[8]等神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的相關(guān)報道。但是，移植后的間充質(zhì)干細胞存活率較低，限制了其在臨床中的應(yīng)用。

去分化指分化細胞失去特有的結(jié)構(gòu)和功能，變?yōu)榫哂形捶只毎匦缘募毎倪^程。去分化的細胞具有原始干細胞特性，且再分化的速度和效率都有提高[9]。張慧等[10]在對間充質(zhì)干細胞的成骨分化研究中證實，去分化的間充質(zhì)干細胞具備間充質(zhì)干細胞的特征，并且體外再次生骨效率明顯提高。因此，如果直接用去分化的細胞做移植治療，很可能可以提高治療效果。

為了系統(tǒng)地了解hUC-MSCs向神經(jīng)樣細胞分化后去分化的分子機制，筆者希望從生物信息學角度，利用公共基因芯片數(shù)據(jù)庫（GEO）中的芯片數(shù)據(jù)，挖掘體外培養(yǎng)的hUC-MSCs向神經(jīng)細胞分化后去分化的基因表達數(shù)據(jù)，通過GO分析、KEGG信號通路分析和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，獲得影響hUC-MSCs神經(jīng)向去分化的相關(guān)基因、生物學過程、信號通路和重要蛋白等信息，為進一步實驗研究hUC-MSCs神經(jīng)向去分化的機制提供前期基礎(chǔ)和理論支持。

材料與方法

一、基因表達數(shù)據(jù)的獲得

本研究選用的是GSE65631芯片數(shù)據(jù)。GSE65631是由Zhou等[11]人提交的hUC-MSCs未分化及其向神經(jīng)樣細胞分化、去分化和再分化的數(shù)據(jù)集。GSE65631芯片數(shù)據(jù)獲得的過程如下：從重慶干細胞庫購買hUC-MSCs，用DMEM/F12完全培養(yǎng)基+10﹪胎牛血清（FBS）培養(yǎng)到第5代，用1 μm/L的全反式維甲酸（ATRA）預(yù)處理24 h，然后用改良神經(jīng)元誘導液（modi fi ed neuronal induction media，MNM）誘導分化成神經(jīng)樣細胞；將MNM換回DMEM/F12完全培養(yǎng)基+10﹪胎牛血清（FBS）培養(yǎng)24 h，使分化了的 hUC-MSCs去分化；最后，再用MNM誘導去分化的細胞再分化。抽取不同階段（未分化、分化、去分化、再分化）hUC-MSCs的總RNA，生物素標記之后用基因芯片檢測體外培養(yǎng)的hUC-MSCs未分化、神經(jīng)向分化-去分化-再分化過程的基因表達情況。采用的分析平臺是Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。

本研究從GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE65631芯片數(shù)據(jù)集[11]。因本研究主要是為了解 hUC-MSCs神經(jīng)向分化后細胞去分化的情況，因此僅選取了分化和去分化的數(shù)據(jù)進行分析。

二、數(shù)據(jù)預(yù)處理及差異表達基因篩選

用R軟件（3.2.3）和Bioconductor（3.2）項目對數(shù)據(jù)進行處理和分析：將所得數(shù)據(jù)先用RMA（Robust Multichip Averaging）計算，進而用affy軟件包背景校正、標準化、log2轉(zhuǎn)化，最后用limma包篩選差異表達基因[12]。設(shè)置FDR < 0.05，|log（FC）| > 1為標準。

三、功能注釋和通路分析

將得到的差異表達顯著的上調(diào)和下調(diào)基因，分別提交到GeneAnalytics在線分析工具進行GO分析和通路分析[13]。

四、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

使用STRING數(shù)據(jù)庫分析差異表達基因存在的蛋白互作關(guān)系[14]。STRING數(shù)據(jù)庫是一個通過收集蛋白質(zhì)互作關(guān)系、基因調(diào)控關(guān)系以及文獻挖掘分析和蛋白質(zhì)共表達分析等計算得到物理互作和預(yù)測互作關(guān)系的數(shù)據(jù)庫。且可通過計算給不同基因（蛋白質(zhì)）之間的互作關(guān)系打分，并建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，再根據(jù)每個節(jié)點degree的大小選擇關(guān)鍵蛋白。

結(jié) 果

一、差異表達基因分析

通過limma方法，將hUC-MSCs去分化和分化進行比較，篩選得到影響去分化過程的1 046個上調(diào)探針和2 385個下調(diào)探針，它們分別對應(yīng)670個上調(diào)基因（P < 0.05）和1 458個下調(diào)基因（P < 0.05）。

二、生物學過程分析

用GeneAnalytics分析與hUC-MSCs神經(jīng)向去分化過程相關(guān)的生物學過程。發(fā)現(xiàn)在上調(diào)過程中，血管生成、細胞黏附等起主要作用，下調(diào)的生物學過程主要是和代謝相關(guān)。前5個上調(diào)生物學過程和前5個下調(diào)生物學過程見表1。

三、通路分析

經(jīng)GeneAnalytics分析，與hUC-MSCs神經(jīng)向去分化過程相關(guān)的上調(diào)通路主要有細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、血管生成和Akt等信號通路；下調(diào)通路主要是與細胞代謝和生物合成相關(guān)的萜類化合物骨架生物合成、Cholesterot Biosynthesis Ⅱ和磷酸肌醇代謝等通路。維持胚胎干細胞多能性的Nanog基因出現(xiàn)在下調(diào)通路中。排名前五的上調(diào)通路和下調(diào)通路見表2。

表1 與hUC-MSCs去分化密切相關(guān)的生物過程

表2 與hUC-MSCs去分化密切相關(guān)的通路

表3 排名前10的與hUC-MSCs去分化相關(guān)的上調(diào)和下調(diào)蛋白

四、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

用STRING數(shù)據(jù)庫建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，上調(diào)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)見圖1，下調(diào)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)見圖2。根據(jù)degree進行排序，排名前10的蛋白見表3。其中，VEGFA，IL-6，F(xiàn)GF2，MMP和IL-8蛋白與血管生成和細胞黏附有關(guān)。STAT3與Nanog基因共同作用維持胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES）的自我更新能力。

圖1 上調(diào)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

討 論

細胞去分化過程是活體生物在發(fā)生炎性反應(yīng)、遭受創(chuàng)傷以后發(fā)生的一種自我更新、修復(fù)的過程。隨著細胞生物學技術(shù)的發(fā)展及干細胞臨床治療研究的深入，人們對干細胞去分化的關(guān)注日趨增多。去分化的間充質(zhì)干細胞保留了干細胞的特性，與原始干細胞相比，在體外存活時間更長，分化潛能更高[9]。hUC-MSCs由于具有取材容易、增殖力強、免疫原性低、不涉及倫理問題等特點，優(yōu)于其他來源的間充質(zhì)干細胞，成為臨床治療理想的種子細胞。而去分化的細胞除具有原始干細胞特性外，其再分化的速度和效率都較原始干細胞有提高。因此如果將去分化的hUC-MSCs用于臨床治療，則可望有更好的效果。但是hUC-MSCs去分化的機制目前還遠不清楚。因此，嘗試用生物信息學方法、從hUC-MSCs神經(jīng)向去分化切入，分析hUC-MSCs神經(jīng)向分化和去分化基因的表達差異及其相關(guān)的生物學功能、對應(yīng)的生物信號通路及蛋白互作關(guān)系，以初步探討hUC-MSCs神經(jīng)向去分化的機制。

圖2 下調(diào)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

本研究通過對用公共基因芯片數(shù)據(jù)庫GEO搜尋，并用R和Bioconductor軟件分析篩選出來的差異表達的上調(diào)基因P53、ITGA2、VEGFA等和下調(diào)基因ACACA、JUN和PTEN等進行功能富集分析發(fā)現(xiàn)：血管生成、細胞黏附在去分化過程中起重要作用。眾多的研究證實：血管生成是腫瘤在生長、遷移過程中的一種基本活動，能為腫瘤提供氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子等，并能控制止血因子，為腫瘤細胞的散布提供適合的微環(huán)境[15]。在hUC-MSCs的去分化過程中，也伴隨著與腫瘤細胞類似的細胞自我增殖能力、遷移力的恢復(fù)。因此，血管生成、細胞黏附等生物學過程也為hUC-MSCs的去分化提供了適合的促進性微環(huán)境。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析得到與血管生成、細胞黏附相關(guān)的蛋白VEGFA，IL-6，F(xiàn)GF2，MMP和IL-8均有較高的degree值。因此，這些蛋白可以作為研究血管生成、細胞黏附影響hUC-MSCs去分化過程的作用機制的重要蛋白。

ERK信號通路已被證實與細胞去分化密切相關(guān)。對神經(jīng)細胞的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在Schwann細胞去分化過程中ERK信號通路起著核心調(diào)控作用[16]。本研究的基因芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果同樣顯示，在去分化的hUC-MSCs中，ERK信號通路上調(diào)，并且在所有上調(diào)通路中Score值最高，進一步證實了ERK信號通路在細胞去分化過程中的重要性。P13K/AKT信號通路與細胞增殖和存活相關(guān)。此通路的活性被類脂磷酸酶PTEN負調(diào)控[17]。并且P13K能夠通過激活PAK進而激活ERK信號通路，促進細胞去分化。另外，Rac/PAK信號通路還能不依賴ERK和P13K/AKT信號通路，影響細胞黏附、細胞運動、細胞周期進程及細胞轉(zhuǎn)化[18-19]。本研究的基因芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果與之對應(yīng)良好：在去分化的hUCMSCs中，P13K/AKT和Rac/PAK信號通路均上調(diào)，而P13K/AKT信號通路的負調(diào)控蛋白PTEN表達量下調(diào)。說明P13K/AKT和Rac/PAK信號通路在hUC-MSCs去分化過程中同樣起著重要作用。

TP53、ACACA、JUN蛋白在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析中有較大的degree值（均大于100），說明它們在hUC-MSCs去分化過程中的作用比較大，事實上，這些蛋白是與細胞周期、血管生成密切相關(guān)的。因此，在今后的研究工作中這些蛋白可以重點關(guān)注。

本次研究一個值得特別注意的結(jié)果是：在hUC-MSCs去分化過程中，Nanog基因下調(diào)，同時，STAT3蛋白也下調(diào)。在關(guān)于胚胎干細胞的研究中發(fā)現(xiàn)：Nanog與LIF/STAT3共同作用可以維持胚胎干細胞的自我更新能力[20]；Nanog在具有高度增殖能力和多相分化潛能的組織和細胞中高表達[21]；在Nanog缺乏的細胞團中，細胞開始分化；在已分化的胚胎干細胞中Nanog消失[21]。去分化是已分化的細胞回到具有未分化細胞狀態(tài)的過程。而在hUCMSCs去分化過程中，Nanog基因的表達并未增加，STAT3蛋白量也在減少，說明去分化的過程并未使hUC-MSCs完全恢復(fù)到最初的具有干細胞完全干性的狀態(tài)，而保留了一些分化過的狀態(tài)。這可能是去分化細胞再分化的速度和效率都更高的原因。

通過對hUC-MSCs神經(jīng)向分化和去分化差異表達基因分析，本研究得到了與hUC-MSCs神經(jīng)向去分化相關(guān)的重要生物過程、信號通路和重要蛋白。其中，ERK信號通路、P13K/AKT和Rac/PAK信號通路已經(jīng)證實與細胞去分化相關(guān)，血管生成、細胞黏附在細胞去分化過程中的作用研究還較少，而TP53、ACACA、JUN蛋白在細胞去分化過程中的作用尚無報道。因此，關(guān)于hUC-MSCs神經(jīng)向去分化的機制還有很多未知的內(nèi)容值得關(guān)注。本研究為進一步探討hUC-MSCs去分化機制的實驗研究提供了一些可供參考的線索和信息。

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Gene expression profile analysis of neural differentiation and dedifferentiation process in human umbilical cord mesenchymal stem cells

iao Yang1,2, Zhao Hongbo2, Liu Ping1, Fu Xufeng1,Chen Guodong1, Luo Xiaoxi1, Sang Xiongbo1, Zheng Bingrong1.1the Medical School of Y unnan University, Kunming 650091,China;2Stem Cell and Regenrative Laboratory of Y unnan Province of the Kunming Medical University, Kunming 650500,China

Zheng Bingrong, Email: zhengbr@ynu.edu.cn

ObjectiveTo provide information for further experimental study, we analysed the biological function and signal pathways related to neural differentiation and dedifferentiation of human umbilical cord mesenchymal stromal cells（hUC-MSCs）and investigated the protein-protein interaction based on the chip data in public gene chip database GEO using bioinformatics methods.MethodsMicroarray data of neural differentiation and dedifferentiation in hUC-MSCs from public GEO gene chip databases were analyzed by R and Bioconductor package to screen out the differential expressed genes. Signal pathway was analyzed by online analysis tool GeneAnalytics and protein interactions of differential expressed gene were analyzed with STRING database.ResultsA total of 670 up-regulated and 1458 down-regulated genes in differentiation and dedifferentiation process were identified. Up-regulated genes are mainly involved in angiogenesis and cell adhesion, and down-regulated genes are mainly related to metabolism. Up-regulated pathways includes ERK pathway, angiogenesis pathway and Akt pathways, which are involved in cell proliferation, differentiation and apoptosis,while down-regulated pathways are related to metabolism and biosynthesis including terpenoids skeleton biosynthesis pathway, Cholesterot Biosynthesis II and Phosphoinositide metabolism pathway. It is noted that Nanog pathway which maintain the pluripotence of embryonic stem cells is also down regulated. Protein interaction network analysis found that VEGFA, IL-6, FGF2, MMP and IL-8, which are involved in angiogenesis and cell adhesion,have the higher degree value.ConclusionMany factors can influence neural differentiation and dedifferentiation in hUCMSCs, and proteins that can promote angiogenesis, cell adhesion and cell proliferation play more important role. In our future experiments, we will focus on the role of angiogenesis, cell adhesion and cell proliferation in the neural differentiation and dedifferentiation of human umbilical cord mesenchymal stromal cells.

Computational biology; Umbilical cord; Mesenchymal stem cells; Cell differentiation; Cell dedifferentiation; Gene expression profile

2016-08-02）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.01.006

國家自然科學基金（81560043）

650091 昆明，云南大學醫(yī)學院1；650500 昆明醫(yī)科大學 云南省干細胞與再生醫(yī)學重點實驗室2

鄭冰蓉，Email：zhengbr@ynu.edu.cn

焦揚，趙洪波，劉平，等. 人臍帶間充質(zhì)干細胞神經(jīng)向分化與去分化基因表達譜分析[J/CD].中華細胞與干細胞雜志（電子版）, 2017, 7(1):29-34.