胡玉英，黃 河，宋正良，劉 輝，司冰潔，莫海珍

補(bǔ)腎止顫方聯(lián)合埋針對帕金森病大鼠TH、GFAP表達(dá)的影響

胡玉英1，黃 河1，宋正良2，劉 輝3，司冰潔3，莫海珍3

目的 觀察補(bǔ)腎止顫方聯(lián)合埋針對帕金森病(PD)大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶(TH)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的影響，探討補(bǔ)腎止顫方聯(lián)合埋針對PD大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用。方法 采用蛋白酶抑制因子(PSI)皮下注射法制作慢性PD大鼠模型，免疫組織化學(xué)方法及蛋白印跡法檢測各組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH、GFAP表達(dá)的變化。結(jié)果 經(jīng)補(bǔ)腎止顫方聯(lián)合埋針治療后的PD大鼠TH蛋白表達(dá)明顯增加，TH陽性細(xì)胞明顯增多，GFAP表達(dá)明顯降低，GFAP陽性細(xì)胞明顯減少，與模型組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而針?biāo)幗Y(jié)合組與多巴絲肼組相比較，亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 補(bǔ)腎止顫方聯(lián)合埋針可顯著增加PD大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞表達(dá)，并有效減少GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)，保護(hù)大鼠神經(jīng)元細(xì)胞，增加腦內(nèi)多巴胺(DA)含量，促進(jìn)PD大鼠運(yùn)動功能的恢復(fù)。

帕金森??；補(bǔ)腎止顫方；埋針；酪氨酸羥化酶；膠質(zhì)纖維酸性蛋白

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是全球第二大神經(jīng)退行性疾病，同時(shí)也是最常見的運(yùn)動障礙性疾病。研究顯示，我國PD發(fā)病率2/10萬人～797/10萬人年，隨著年齡增高，PD的發(fā)病率呈上升趨勢，在80歲及以上人群中患病率可達(dá)到1 663/10萬人[1]。給家庭和病人造成了沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。而本病至今尚局限于癥狀性的治療，以左旋多巴替代性治療為主，仍無特效的根治藥物和方法，因此研究和開發(fā)安全有效的從根本上阻斷多巴胺(DA)神經(jīng)元變性，阻斷PD病理進(jìn)程的治療措施尤為重要。本課題組前期研究顯示：補(bǔ)腎止顫方聯(lián)合埋針具有滋養(yǎng)肝腎、益精填髓、熄風(fēng)止顫之功，能明顯提高PD病人的運(yùn)動功能和生活質(zhì)量，顯著改善病人的身心健康，通過不同靶點(diǎn)、不同途徑、多環(huán)節(jié)起到抑制DA神經(jīng)元細(xì)胞凋亡作用，治療PD[2]，且能明顯提高PD模型大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)Bcl-2蛋白的表達(dá)及抑制Bax蛋白激活，抑制黑質(zhì)細(xì)胞凋亡以發(fā)揮腦保護(hù)作用[3]。本研究探討補(bǔ)腎止顫方聯(lián)合埋針對PD大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶(TH)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 動物 成年雄性SPF級SD大白鼠32只，體重250 g±20 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 藥物及針具 ①補(bǔ)腎止顫方，組方：鹿角膠10 g，阿膠10 g，生龜板20 g，黨參15 g，枸杞子30 g，白芍30 g，生地25 g，火麻仁15 g，麥冬15 g，炙甘草6 g，生鱉甲15 g，肉蓯蓉30 g，天麻15 g，黃精10 g，山萸肉10 g，鉤藤30 g。為單味免煎顆粒，由江蘇省江陰市江陰天江藥業(yè)有限公司制備，生產(chǎn)批號：1206003；參照《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)》計(jì)算給藥量，藥物配制成含生藥2.574 g/mL，灌胃液體量為每次1 mL/100 g大鼠，其濃度及等效劑量按體表面積折算。②多巴絲肼片由上海羅氏制藥公司提供(批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字 SH10930198，批號：SH2099)，每片250 mg；③埋針針具：選取圖釘型無菌撳針針具(蘇州市華倫醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn)的順和牌無菌撳針，批號：11101)。

1.1.3 主要試劑 PSI購自Calbiochem公司；TH和GFAP免疫組化抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司； TH多克隆抗體(美國Chemicon公司)，GFAP多克隆抗體(anit-GFAP，美國BioVision)，β-actin(美國Sigma公司)；其他試劑均為市售、分析純化。

1.1.4 主要設(shè)備 組織包埋機(jī)和自動組織脫水機(jī)(廣州市華俊醫(yī)療器械有限公司)，組織切片機(jī)(LEICA RM2235)，生物組織烤片機(jī)(湖北省孝感市亞光醫(yī)學(xué)電子技術(shù)有限公司)，三用電熱恒溫水溫箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BX60)。

1.2 方法

1.2.1 動物篩選 大鼠購進(jìn)后飼以標(biāo)準(zhǔn)的大鼠合成飼料常規(guī)飼養(yǎng)，觀察1周無異常后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中動物自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)期間每日觀察并記錄各組大鼠的體毛、梳理動作、站立次數(shù)、肢體震顫、僵直等行為。造模結(jié)束后的4周內(nèi)未出現(xiàn)行為學(xué)改變的模型為制作失敗，不納入本實(shí)驗(yàn)，同時(shí)術(shù)中死亡大鼠及時(shí)補(bǔ)充，用同一批次的大鼠制成成功模型后，保證實(shí)驗(yàn)動物每組數(shù)量不變。

1.2.2 埋針處方 百會、肝俞、腎俞、舞蹈震顫區(qū)(取穴參照華興邦的《大鼠穴位圖譜》)。

1.2.3 模型制備、分組及干預(yù) 參照劉雨清等[4]PSI皮下注射法(PSI溶液配制方法：將室溫放置的100%無水乙醇直接倒入PSI小瓶中，迅速旋轉(zhuǎn)溶解，觀察確定其完全溶解無顆粒殘存)。制作慢性PD大鼠模型，隔日(每周一、三、五)給予24只大鼠背部皮下注射PSI溶液，75 μL/100 g，連續(xù)2周。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為3組，即模型組、多巴絲肼組、針?biāo)幗Y(jié)合組；另設(shè)8只大鼠為假手術(shù)組，予同等量的70%乙醇溶液背部皮下注射。各組大鼠在造模結(jié)束4周后進(jìn)行行為學(xué)觀察，根據(jù)造模成功標(biāo)準(zhǔn)[3]，篩選合格的PD大鼠(活動減少，運(yùn)動遲緩，重心降低，肢體僵硬)。各組在造模4周后連續(xù)給藥3周，假手術(shù)組、模型組均予1 mL/100(g·d)生理鹽水灌胃；多巴絲肼組予多巴絲肼200 mg/(kg·d)灌胃；針?biāo)幗Y(jié)合組予補(bǔ)腎止顫方溶液1 mL/100(g·d)灌胃，同時(shí)予埋針療法，隔天(每周一、三、五)治療，連續(xù)3周，最后每組8只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。各組大鼠灌胃給藥3周后，予10%水合氯醛(0.35 mL/100 g體重)經(jīng)腹腔注射深度麻醉大鼠后仰臥固定于手術(shù)臺上，暴露心臟，止血鉗夾住腹主動脈及下腔靜脈，用磨頓的10號針頭刺入左心室，先快速滴入生理鹽水約100 mL，見到大鼠兩前肢及兩肺變白改灌注4%多聚甲醛(0.1 mol/L，pH7.4)100 mL，灌洗后快速斷頭取大腦，置于4%的多聚甲醛中固定、脫水、透明并石蠟包埋備用。

1.3 觀察方法

1.3.1 動物行為學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)期間每日觀察并記錄各組大鼠的采食量、體毛、梳理動作、站立次數(shù)、肢體震顫、僵直等行為。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色法 采用免疫組織化學(xué)染色法SABC法[5]檢測各組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH蛋白、GFAP表達(dá)的變化，在光學(xué)顯微鏡高倍鏡下隨機(jī)取2 mm×2 mm視野，計(jì)算中腦黑質(zhì)區(qū)的TH、GFAP的陽性細(xì)胞數(shù)，并采用HMIAS-2000高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)對免疫組化切片進(jìn)行圖像分析，測定TH、GFAP免疫組化染色的陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3.3 蛋白印跡法(western blot) 取中腦黑質(zhì)區(qū)組織標(biāo)本加入蛋白裂解液后，用玻璃勻漿器充分勻漿至完全裂解，勻漿離心后取上清，定量，8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂牛奶封閉后，分別用TH多克隆抗體(按1∶2 000稀釋)；GFAP多克隆抗體(1∶1 000稀釋)，充分洗滌后用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG作為二抗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色(promega公司)，曝光，顯影，定影，結(jié)果采用ImageJ軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1 動物行為學(xué)觀察 造模大鼠注射PSI結(jié)束后，逐漸出現(xiàn)不自主咀嚼，站立次數(shù)、梳理動作增多；PSI注射結(jié)束后第4周癥狀較明顯，大鼠主要表現(xiàn)為采食量減少，毛發(fā)粗糙無光澤、污穢，不自主咀嚼、站立次數(shù)、梳理動作增多，前爪出現(xiàn)顫抖，行走時(shí)重心明顯降低，伸展姿態(tài)時(shí)腹部接觸地面，運(yùn)動遲緩，肢體和軀體的伸展緩慢。

2.2 TH免疫組化檢測結(jié)果 光鏡下觀察可見假手術(shù)組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞在細(xì)胞漿內(nèi)呈棕褐色染色，細(xì)胞排列整齊密集，形態(tài)正常，邊緣清晰，核仁較小且居中，細(xì)胞體呈梭形或錐形，突起多且明顯，長而連續(xù)，稍有分支，細(xì)胞纖維細(xì)長、集中、交織呈網(wǎng)狀(見圖1)；而模型組TH陽性細(xì)胞數(shù)目顯著減少，細(xì)胞的突起和神經(jīng)纖維均減少，細(xì)胞膜出現(xiàn)明顯皺縮，細(xì)胞體積明顯縮小(見圖2)；而多巴絲肼組和針?biāo)幗Y(jié)合組則均有不同程度的改善，尤以針?biāo)幗Y(jié)合組改善明顯(見圖3～圖4)。

圖1 假手術(shù)組TH免疫組化檢測結(jié)果(×400)

圖2 模型組TH免疫組化檢測結(jié)果(×400)

圖3 針?biāo)幗Y(jié)合組TH免疫組化檢測結(jié)果(×400)

圖4 多巴絲肼組TH免疫組化檢測結(jié)果(×400)

2.3 GFAP免疫組化檢測結(jié)果 光鏡下觀察可見假手術(shù)組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)GFAP陽性細(xì)胞染色較淡，呈棕褐色或棕黃色染色，細(xì)胞排列整齊密集，形態(tài)正常，邊界清晰，細(xì)胞分布比較分散，數(shù)目較少，且胞體較小，呈不規(guī)則的多角形形狀，突起呈星形且較少(見圖5)；而模型組大鼠黑質(zhì)GFAP陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，胞體增大，突起增長呈蜘蛛樣，且染色加深呈深棕黃色(見圖6)；而多巴絲肼組及針?biāo)幗Y(jié)合組皆有不同程度改善，尤以針?biāo)幗Y(jié)合組改善明顯(見圖7～圖8)。

圖5 假手術(shù)組FAP免疫組化檢測結(jié)果(×400)

圖6 模型組FAP免疫組化檢測結(jié)果(×400)

圖7 針?biāo)幗Y(jié)合組FAP免疫組化檢測結(jié)果(×400)

圖8 多巴絲肼組FAP免疫組化檢測結(jié)果(×400)

2.4 TH及GFAP陽性細(xì)胞數(shù) TH及GFAP表達(dá)部位在黑質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)。與假手術(shù)組比較，模型組、多巴絲肼組及針?biāo)幗Y(jié)合組TH陽性細(xì)胞數(shù)均明顯減少，GFAP陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增多，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，針?biāo)幗M及多巴絲肼組TH陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增多，GFAP陽性細(xì)胞數(shù)均明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與多巴絲肼組比較，則針?biāo)幗Y(jié)合組TH陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，GFAP陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1、圖9。

圖9 TH及GFAP蛋白Western blot檢測結(jié)果

2.5 TH及GFAP的Western blot檢測結(jié)果(蛋白表達(dá)的灰度值/β-actin灰度值的相對值) 與假手術(shù)組比較，模型組、多巴絲肼組及針?biāo)幗Y(jié)合組TH蛋白表達(dá)均明顯降低，GFAP表達(dá)均明顯增加，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，針?biāo)幗Y(jié)合組及多巴絲肼組TH蛋白表達(dá)顯著增加，GFAP表達(dá)顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而與多巴絲肼組比較，則針?biāo)幗Y(jié)合組TH蛋白表達(dá)明顯增加，GFAP表達(dá)明顯降低，亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組TH的GFAP Western blot檢測結(jié)果

3 討 論

PD早期主要病理改變是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性、缺失。而TH為DA合成的限速酶，同時(shí)還是腦內(nèi)DA能神經(jīng)元的蛋白標(biāo)志，是PD的直接指示劑，PD發(fā)病時(shí)TH含量下降且隨著病情進(jìn)展而顯著下降，它的增加和減少直接影響DA的數(shù)量，故其含量與功能不足是導(dǎo)致PD一系列臨床癥狀的重要環(huán)節(jié)。大量研究證明，PD動物模型中腦黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元表達(dá)數(shù)量顯著減少[6-8]。本研究顯示PD大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞明顯減少，TH蛋白表達(dá)水平降低，與上述相同，說明PSI有導(dǎo)致黑質(zhì)細(xì)胞凋亡的作用，從而使DA神經(jīng)元減少，最終導(dǎo)致PD的發(fā)生，出現(xiàn)明顯的PD大鼠

行為學(xué)特征，進(jìn)一步提示TH表達(dá)的降低與PD發(fā)病密切相關(guān)。而PD的發(fā)生尚與多種因素有關(guān)，如免疫炎癥反應(yīng)、一氧化氮(NO)、興奮性氨基酸毒性、氧化應(yīng)激、線粒體功能衰竭等。GFAP是構(gòu)成星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體膠原蛋白的重要成分，且其僅存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)原纖維中間絲中，是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的特征性標(biāo)記物[9-10]，對神經(jīng)元具有炎性損壞作用，并在神經(jīng)元突觸發(fā)生、界定神經(jīng)核團(tuán)形成以及PD的發(fā)生發(fā)展方面都具有明顯作用；GFAP陽性反應(yīng)的細(xì)胞又稱為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，它可以分泌致炎因子TNF-α、IL-6、ICAM-1、巨噬細(xì)胞炎性蛋白等，它的異?；罨把仔砸蜃拥尼尫潘鶚?gòu)成的神經(jīng)炎癥反應(yīng)對大腦健康不利，使神經(jīng)元變性[11]；反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞還可大量釋放NO，并與陰離子結(jié)合形成氧自由基，破壞線粒體膜功能，造成線粒體功能衰竭，導(dǎo)致黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞損傷；另一方面，它還能合成谷氨酸，對神經(jīng)元膜上受體具有激活作用，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，導(dǎo)致神經(jīng)元廣泛損傷和死亡，從而誘導(dǎo)PD的發(fā)生。本研究顯示PD大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)GFAP陽性細(xì)胞顯著增多，GFAP表達(dá)水平增高，出現(xiàn)明顯的PD大鼠行為學(xué)特征，表明星形膠質(zhì)細(xì)胞通過免疫炎癥因素、破壞線粒體功能及興奮性氨基酸細(xì)胞毒性作用參與DA神經(jīng)元的凋亡，導(dǎo)致PD的發(fā)生。

TH陽性細(xì)胞表達(dá)的多少不僅體現(xiàn)DA能神經(jīng)元被破壞的程度，同時(shí)可用來判定PD治療效果[12]，因此設(shè)法提高TH蛋白含量及酶活性已成為PD治療研究的重要領(lǐng)域[13]。近年來各項(xiàng)研究不斷揭示中藥、針灸治療PD療效確切。已有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究支持中藥單體、有效成分及組方可提高動物腦內(nèi)DA含量[14]。文曉東等[15]對于中醫(yī)藥治療PD療效進(jìn)行了系統(tǒng)評價(jià)，認(rèn)為中醫(yī)藥治療PD安全、有效，中藥聯(lián)合PD基礎(chǔ)西藥可能優(yōu)于單用西藥，對于早期PD病人，采用單純中藥治療與西藥(多巴絲肼)療效相當(dāng)。陳伶利等[16]研究表明針刺陽陵泉能顯著增加PD模型小鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞數(shù)，并減少GFAP陽性細(xì)胞數(shù)，保護(hù)DA能神經(jīng)元，改善PD癥狀，從而治療PD。

本研究結(jié)果顯示，針?biāo)幗Y(jié)合組中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞、TH蛋白表達(dá)水平顯著增加，GFAP陽性細(xì)胞、GFAP表達(dá)水平顯著減少，提示補(bǔ)腎止顫方聯(lián)合埋針能明顯促進(jìn)TH蛋白表達(dá)并有效抑制GFAP表達(dá)，考慮針?biāo)幗Y(jié)合可能通過顯著抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化及致炎因子TNF-α、IL-6、ICAM-1、巨噬細(xì)胞炎性蛋白的分泌及NO的釋放，從而抑制GFAP參與炎癥反應(yīng)，并減少NO所致的脂質(zhì)過氧化和對線粒體功能的破壞以及興奮性氨基酸的細(xì)胞毒性作用，減少DA神經(jīng)元損傷、變性及死亡，保護(hù)DA神經(jīng)元；DA能神經(jīng)元自血流攝入左旋酪氨酸，在TH作用下形成左旋多巴(L-dopa)，再經(jīng)多巴胺脫羧酶(DDC)作用生成DA，使DA神經(jīng)元明顯增加，對黑質(zhì)細(xì)胞具有明顯保護(hù)作用，從而治療PD。

補(bǔ)腎止顫方聯(lián)合埋針能明顯促進(jìn)PD大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH蛋白表達(dá)及有效抑制GFAP表達(dá)，使DA神經(jīng)元凋亡明顯減少，對黑質(zhì)細(xì)胞具有明顯保護(hù)作用，改善PD臨床癥狀、延緩PD進(jìn)展。其機(jī)制可能與補(bǔ)腎止顫方聯(lián)合埋針能減少免疫炎癥反應(yīng)、興奮性氨基酸的細(xì)胞毒性作用及對線粒體功能的破壞有關(guān)。

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(本文編輯王雅潔)

Effects of Bushen Zhichan Formula and Needle-embedding Therapy on TH and GFAP in Rats with Parkinson’s Disease

Hu Yuying，Huang He，Song Zhengliang，Liu Hui，Si Bingjie，Mo Haizhen

First Affiliated Hospital，Guangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530023，Guangxi，China

Hu Yuying

Objective To observe the effects of Bushen Zhichan formula (BZF) and needle-embedding therapy on tyrosine hydroxylase (TH)and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in midbrain nigra area of rat model of Parkinson's disease (PD)，and analyze its protective effect on neuron of PD rats. Methods After treatments for three weeks，TH and GFAP changes in midbrain nigra area of each group of PD rats which were modeled by injecting proteasome inhibitors I (PSI)，were tested by immunohistochemistry and western blot. Results The expression of TH in BZF and needle-embedding therapy group was significantly increased，and so did the TH positive cells，with the expression of GFAP having a dramatic decline and so did its positive cells. Compared with the model group，there was significant differences in all the figures (P<0.01). There was significant differences between BZF and needle-embedding group and levodopa and benserazide group (P<0.05). Conclusion BZF and needle-embedding therapy can up-regulate the expression of TH positive cells while reduce the expression of GFAP positive cells in the midbrain nigra area of PD rats. It can also protect the neuron of PD rats，increase the volume of dopamine (DA) in their brain and promote the recovery of motor function for them.

Bushen Zhichan formula；Parkinson’s disease； needle-embedding therapy； tyrosine hydroxylase；glial fibrillary acidic protein

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(南寧 530023)；2.廣西壯族自治區(qū)柳州鹿寨縣中醫(yī)院； 3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)

胡玉英，E-mail：13878847908@163.com

R742.5 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.03.013

1672-1349(2017)03-0305-05

2016-04-19)

引用信息：胡玉英，黃河，宋正良，等.補(bǔ)腎止顫方聯(lián)合埋針對帕金森病大鼠TH、GFAP表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(3)：305-309.