，，，，，，，，，

（1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南 250100；2. 山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100；3. 濟(jì)南市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東濟(jì)南 250011）

鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備和鑒定

張玲玲1，2，戰(zhàn) 翔3，彭 喆1，2，時(shí)建立1，2，吳曉燕1，2，徐勝男1，2，鄭書軒1，2，徐紹建1，2，黃保華1，2，李 俊1，2

（1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東濟(jì)南 250100；2. 山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100；3. 濟(jì)南市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東濟(jì)南 250011）

為進(jìn)一步建立克倫特羅（CL）殘留檢測(cè)方法，給制備CL殘留檢測(cè)試劑盒打下基礎(chǔ)，進(jìn)行了CL單克隆抗體（McAb）的制備研究。以重氮反應(yīng)，將CL與牛血清白蛋白（BSA）、雞卵清白蛋白（OVA）偶聯(lián)，分別制備免疫原和檢測(cè)原，并通過雜交瘤技術(shù)，獲得了5株能穩(wěn)定分泌特異結(jié)合CL小分子的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株（1E9A9、2A9C1、3F2E9、6G2E9、6E10D9）。這5株細(xì)胞株經(jīng)過體外傳代培養(yǎng)和凍存復(fù)蘇后均能穩(wěn)定分泌抗體。用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定的這5株細(xì)胞上清液抗體效價(jià)分別為1:1.28×105、1:5.12×105、1:1.28×105、1:5.12×105、1:2.56×105；選用3F2E9、6E10D9細(xì)胞株，制備CL單克隆抗體腹水并純化，其純化后的腹水抗體效價(jià)分別為1:1.28×105、1:2.56×105，BCA（2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉）方法檢測(cè)的濃度分別為1.60 mg/mL、1.54 mg/mL；最終通過斑點(diǎn)ELISA（Dot-ELISA）方法測(cè)定CL抗原與這2株抗體有較強(qiáng)的結(jié)合力。在上述方法的制備及驗(yàn)證下，成功獲得了特異性較高的CL單克隆抗體，為進(jìn)一步研制CL殘留檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

鹽酸克倫特羅；單克隆抗體；殘留檢測(cè)

鹽酸克倫特羅（Clenbuterol Hydrochloride，CL）商品名稱鹽酸雙氯醇胺、克喘素、氨哮素、氨必妥、氨雙氯喘通、氨雙氯醇胺，俗稱“瘦肉精”，化學(xué)名稱為2-[（叔丁胺基）甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽[1，2]，分子式為C12H18Cl2N2O· HCl。CL是一種平喘藥，既不是飼料添加劑，也不是獸藥，而是一種β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，因具有營養(yǎng)再分配、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、增加動(dòng)物酮體瘦肉率、提高飼料轉(zhuǎn)化率的作用，在家畜和人體內(nèi)吸收好，而且與其它β-受體激動(dòng)劑相比，其生物利用度高，經(jīng)常被非法用作飼料添加劑，用于畜產(chǎn)品的生產(chǎn)，以至于人類食用了含有CL的畜產(chǎn)品后出現(xiàn)嚴(yán)重的中毒情況，對(duì)人類健康存在非常大的潛在危害。盡管我國要求自2002年9月10日起在動(dòng)物飼料和飲用水中禁止使用CL，但是近幾年CL在動(dòng)物飼料中的違禁添加現(xiàn)象依然存在，使得CL在畜禽肉制品及其尿液和毛發(fā)中的殘留檢測(cè)得到廣泛的關(guān)注和研究。

目前可以分析瘦肉精及β2-腎上腺素受體激動(dòng)劑殘留的主要方法包括高效液相色譜法（HPLC）[3-4]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC/MS）[5-6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC/MS）[7]、免疫分析法等。免疫分析法具有單次處理樣本數(shù)多、易于商品化供應(yīng)和檢測(cè)靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，目前得到廣泛使用。目前市場(chǎng)上已有許多以免疫分析法為基礎(chǔ)的商品化試劑盒，用于檢測(cè)飼料及動(dòng)物體內(nèi)的CL殘留，但檢測(cè)用到的抗體大多數(shù)為多克隆抗體，其特異性不高。因此，研制高特異性CL單克隆抗體，并以此為基礎(chǔ)研制快速檢測(cè)試劑盒，成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

為了建立一種快速、敏感、特異的CL化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法，采用重氮反應(yīng)，將CL與牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)，獲得免疫原，用其免疫BALB/c小鼠，應(yīng)用雜交瘤技術(shù)，制備高特異性單克隆抗體，為研制CL快速檢測(cè)試劑盒提供特異的材料，也為試劑盒的研發(fā)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株。雌性BALB/c小鼠，購自上海市第一人民醫(yī)院（松江）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；小鼠Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞，上海生工生物股份有限公司抗體部保存。

1.1.2主要試劑。RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS），購自GIBCO公司；鹽酸克倫特羅（CL）標(biāo)準(zhǔn)品、8-氮鳥嘌呤、HT、HAT、PEG、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，均購自Sigma公司；HRP標(biāo)記的驢抗鼠IgG，購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、卵清蛋白（Ovalbumin，OVA），購自上海生工公司。其它化學(xué)試劑均為分析純以上級(jí)別。

1.1.3主要設(shè)備。生物安全柜，購自蘇凈集團(tuán)安泰公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，購自美國Therom公司；酶標(biāo)儀，購自美國 BIO-RAD伯樂公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1抗原制備。綜合文獻(xiàn)[8-9]方法，進(jìn)行條件優(yōu)化，制備抗原：稱取3.295 mg 約（0.01 mmol）CL溶于400 μL 0.1 M預(yù)冷鹽酸中（0.04 mmol），邊震蕩邊向其中緩緩加入10 mg/mL 的NaNO2（約0.01 mmol），并不斷用微量移液器蘸取少許，用淀粉碘化鉀試紙檢測(cè)，直到試紙顏色剛好變?yōu)樗{(lán)紫色時(shí)，停止加入NaNO2。繼續(xù)震蕩，使反應(yīng)充分進(jìn)行，從而使CL偶氮化，然后將偶氮化的CL 分別加入到牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）溶液中，置4 ℃冰箱過夜，第二天取出后透析。上述操作均在4 ℃避光環(huán)境中進(jìn)行，透析完成后，于-20 ℃凍存?zhèn)溆?，其中CL-BSA 作為免疫原用，CL-OVA 為ELISA 包被抗原。期間會(huì)觀察到偶氮后的CL滴入到BSA和OVA時(shí)，顏色先變黃色，最后變成明亮的黃色，透析和冷凍過程中顏色均未褪去。這說明CL已結(jié)合了BSA和OVA，初步確定偶聯(lián)成功，省去了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳[10]和紫外掃描的鑒定步驟。

1.2.2小鼠免疫及效價(jià)測(cè)定。選用6周齡的BALB/c雌性小鼠，取偶聯(lián)成功的免疫原（CLBSA），用適量PBS稀釋后，與等量弗氏完全佐劑乳化（抗原乳化狀態(tài)判定：取1滴混合乳化液，滴入水平面，輕輕晃動(dòng)，長時(shí)間不擴(kuò)散），皮下分點(diǎn)注射。之后以相同方式，每隔兩周，以弗氏不完全佐劑乳化加強(qiáng)免疫，共免疫3次。在最后一次免疫7天后，尾靜脈采集血液樣本，分離血清，以CL-OVA包被酶標(biāo)板，用間接ELISA方法檢測(cè)分析血清抗體效價(jià)。選取免疫效價(jià)檢測(cè)值最高的小鼠，于細(xì)胞融合前3天進(jìn)行沖擊免疫1次，3天后取沖擊免疫過的小鼠脾臟細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.2.3雜交瘤細(xì)胞株的建立

1.2.3.1骨髓瘤細(xì)胞（Sp2/0）的準(zhǔn)備。細(xì)胞融合前兩周，對(duì)Sp2/0進(jìn)行復(fù)蘇，并于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中向培養(yǎng)液加入8-氮鳥嘌呤（8-Azaguanine）連續(xù)處理3次，使Sp2/0細(xì)胞對(duì)HAT培養(yǎng)液更加敏感。融合前一天進(jìn)行傳代，以便使融合當(dāng)天的骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期。

1.2.3.2飼養(yǎng)細(xì)胞的準(zhǔn)備。細(xì)胞融合前一天，取3～4周齡健康的BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至（l～5）×105個(gè)/mL，之后轉(zhuǎn)入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，18～24小時(shí)后觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、明亮、貼壁緊密時(shí)，可供細(xì)胞融合使用。

1.2.3.3脾細(xì)胞的準(zhǔn)備。取融合前加強(qiáng)免疫過的小鼠，摘除眼球，采集血液樣本并分離血清作為陽性對(duì)照。采血后斷頸處死小鼠，浸沒于75%乙醇中2～3 min，無菌摘取脾臟，制備并收集脾細(xì)胞懸液，用臺(tái)酚蘭染液做活細(xì)胞計(jì)數(shù)后備用。

相互間進(jìn)行數(shù)據(jù)交換時(shí)，Coreldraw可以打開版本CS5及其以下任何版本的文件，文字不會(huì)變成亂碼，圖層不保留，所有要素合并到一個(gè)圖層內(nèi)，可以另存為AI文件；Illustrator 能打開Coreldraw版本10及其以下的CDR文件，圖層完全保留，但文字極易出現(xiàn)亂碼，無法存儲(chǔ)為CDR文件。其他項(xiàng)對(duì)比見表4。

1.2.3.4細(xì)胞的融合。將Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞按1:5的比例加入到50 mL離心管中，充分混勻制成懸液，1 000 r/min，離心7 min，盡量棄去上清，輕彈離心管，使沉淀細(xì)胞呈分散狀。加入聚乙二醇（PEG）促進(jìn)細(xì)胞融合，之后加入不完全培養(yǎng)液，使PEG稀釋失去促融合作用。將終止反應(yīng)后的細(xì)胞懸液離心，棄上清液并加入適量的HAT培養(yǎng)液，輕輕吹吸沉淀的細(xì)胞，使其混勻懸浮，然后加至鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，5% CO237 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1周，期間定期觀察細(xì)胞生長情況。

1.2.3.5雜交瘤細(xì)胞的篩選及克隆化培養(yǎng)。融合后注意觀察雜交瘤細(xì)胞的生長狀況，視情況決定是否換液。一般只需更換1次液體或勿需換液。換液時(shí)，先吸去原有培養(yǎng)孔1/2的培養(yǎng)液，再加入等量新鮮培養(yǎng)液即可。本試驗(yàn)融合后1周內(nèi)未換液，融合后第8天開始換HT培養(yǎng)液，同時(shí)進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞株篩選。待細(xì)胞長到孔底的1/4～1/3時(shí)，吸出上清液100 μL進(jìn)行間接ELISA抗體檢測(cè)，以CL-OVA 為ELISA 包被抗原。以P/N≥2.5作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，用未免疫小鼠的血清作陰性對(duì)照，用抗體稀釋液做空白對(duì)照。對(duì)檢測(cè)為陽性的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行克隆化培養(yǎng)。

克隆化培養(yǎng)采用有限稀釋法，待細(xì)胞長到孔底的l/4～1/3時(shí)，對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。選擇克隆數(shù)少、OD450nm值高的陽性孔，將其再次克隆。3～4次克隆化后，當(dāng)所有克隆化細(xì)胞孔陽性率檢測(cè)值達(dá)100%時(shí)，確定并獲得5株分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株，及時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。

1.2.4雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)及凍存。單克隆細(xì)胞株經(jīng)過幾次克隆后，陽性率達(dá)到100%。這時(shí)將細(xì)胞從96孔培養(yǎng)板轉(zhuǎn)入24孔培養(yǎng)板中，再由24孔板轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，取部分細(xì)胞按照常規(guī)方法凍存。

1.2.5單克隆抗體的鑒定

1.2.5.1單克隆細(xì)胞上清效價(jià)測(cè)定。對(duì)已經(jīng)建株的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存保留部分細(xì)胞后，將剩余細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，1 000 r/min，離心5 min，收集培養(yǎng)細(xì)胞的上清液后進(jìn)行間接ELISA效價(jià)測(cè)定。將上清液進(jìn)行梯度稀釋，以陰性小鼠血清作為陰性對(duì)照，以融合小鼠血清作為陽性對(duì)照。

1.2.5.2單克隆抗體腹水的制備純化及效價(jià)測(cè)定。按照文獻(xiàn)[11]的方法，選取其中2株單克隆雜交瘤細(xì)胞（3F2E9、6E10D9），制備單克隆抗體腹水并進(jìn)行純化，對(duì)純化的抗體用BCA測(cè)定濃度，間接ELISA測(cè)定效價(jià)。梯度稀釋抗體，以陰性小鼠血清作為陰性對(duì)照，以融合小鼠血清作為陽性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1鹽酸克倫特羅免疫抗原和檢測(cè)抗原的合成

經(jīng)重氮反應(yīng)，分別制成了免疫原CL-BSA和檢測(cè)原CL-OVA。反應(yīng)過程中，偶氮后的CL滴入BSA和OVA時(shí)，顏色立即變黃色，最后變成明亮的黃色，透析和冷凍干燥過程中，均未見褪去，說明偶氮化克倫特羅與載體蛋白偶聯(lián)成功。

2.2小鼠免疫

小鼠第三次免疫后1周，采尾靜脈血，用間接ELISA方法檢測(cè)抗體效價(jià)。結(jié)果顯示1#、2#、3#小鼠的血清抗體效價(jià)較高，其中1#小鼠血清效價(jià)最高，大約為1:6.4×104（表1），滿足細(xì)胞融合的要求。因此細(xì)胞融合前，對(duì)1#小鼠進(jìn)行沖擊免疫，并于3天后取其脾細(xì)胞，與對(duì)數(shù)生長期的Sp2/0細(xì)胞融合。

2.3單克隆細(xì)胞株的篩選及雜交瘤細(xì)胞株的建立

將免疫的BALB/c小鼠脾細(xì)胞和Sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞經(jīng)PEG方法融合，1周后可見孔內(nèi)呈葡萄串狀分布的小型克隆集落生長，細(xì)胞渾圓透亮。采用間接ELISA方法，以未免疫的BALB/c小鼠血清作陰性對(duì)照，適當(dāng)倍數(shù)稀釋的小鼠血清為陽性對(duì)照測(cè)定OD450nm值，選擇其中陽性值最高的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)亞克隆篩選，最終獲得5株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1E2A9、2A9C1、3F2E9、6G2E9和6E10D9。

2.4單克隆雜交瘤細(xì)胞上清效價(jià)檢測(cè)

系列倍比稀釋雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，用間接ELISA法測(cè)定OD450nm值，同時(shí)設(shè)立陽性、陰性血清對(duì)照。以P/N比值≥2.5時(shí)單克隆抗體的最大稀釋度（即其抗體效價(jià)），測(cè)定5株陽性雜交瘤細(xì)胞上清效價(jià)（表2）。

2.5單克隆抗體腹水效價(jià)檢測(cè)和斑點(diǎn)免疫法（Dot-ELISA）檢測(cè)結(jié)果

利用間接ELISA法和BCA法，對(duì)純化后的抗體效價(jià)和濃度進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表3、表4。 斑點(diǎn)免疫法（Dot-ELISA）檢測(cè)結(jié)果見圖1。

表1 用于細(xì)胞融合的免疫BALB/c小鼠血清效價(jià)（OD450nm）

表2 單克隆雜交瘤細(xì)胞上清效價(jià)（OD450nm）

表3 單克隆抗體腹水效價(jià)（OD450nm）

表4 單克隆抗體腹水純化后的蛋白質(zhì)濃度

圖1 斑點(diǎn)免疫法（Dot-ELISA）檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

1997—2005年，我國相繼發(fā)布《關(guān)于嚴(yán)禁非法使用獸藥的通知》《關(guān)于查處非法生產(chǎn)、銷售和使用鹽酸克倫特羅等藥品的緊急通知》《飼料及畜產(chǎn)品中瘦肉精等違禁藥品專項(xiàng)整治計(jì)劃》《關(guān)于加強(qiáng)鹽酸克倫特羅管理的通知》等，農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部、國家藥監(jiān)局等部門多次單獨(dú)或共同發(fā)布公告，明確規(guī)定不允許在飼料和動(dòng)物飲用水中添加包括CL（Clenbuterol Hydrochloride，鹽酸克倫特羅）、RAC（Ractopamine，萊克多巴胺）、SAL（Salbutamol，沙丁胺醇）在內(nèi)的7種藥物。目前 CL 引起的中毒事件仍有發(fā)生[12]，相關(guān)部門對(duì)此也廣泛關(guān)注，從而出現(xiàn)了大量的關(guān)于抗鹽酸克倫特羅單抗或多抗制備的報(bào)道。國內(nèi)研究者陳繼明[13]、胥傳來[14]等建立了一種用兔多克隆抗體來檢測(cè)CL的方法，但相比單克隆抗體，多克隆抗體特異性及穩(wěn)定性效果明顯不如單克隆抗體，因此在CL抗體的制備上大多還是傾向于單克隆抗體。目前國內(nèi)市場(chǎng)上有很多種檢測(cè)CL的酶免疫試劑盒，其主要為進(jìn)口產(chǎn)品，檢測(cè)成本高，費(fèi)用昂貴。因此，特異性高、穩(wěn)定性好的抗鹽酸克倫特羅單克隆抗體的研制和發(fā)展顯得有尤為重要。

眾所周知，作為完全抗原，其結(jié)構(gòu)必須同時(shí)具備T 細(xì)胞和B 細(xì)胞表位。小分子物質(zhì)，如小肽、抗生素、激素等，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，不具備免疫原性，必須將其連接到一些大分子蛋白質(zhì)載體上，借助載體蛋白的T細(xì)胞表位，間接誘導(dǎo)B細(xì)胞激活，使其分化增殖，從而產(chǎn)生針對(duì)半抗原小分子的特異性抗體[15]。目前建立半抗原免疫檢測(cè)方法的主要局限性是能否獲得可靠的、特異性強(qiáng)的抗體。本試驗(yàn)利用重氮反應(yīng)將CL分子與載體蛋白BSA和OVA偶聯(lián)，成功制備了單克隆抗體的免疫原和檢測(cè)原，通過對(duì)后期細(xì)胞株的鑒定和篩選，最終獲得了5株與CL有特異性反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株。選3F2E9、6E10D9株細(xì)胞進(jìn)行抗體腹水制備和純化，并分別通過間接ELISA和BCA方法測(cè)定效價(jià)及蛋白濃度，最終通過Dot-ELISA方法確定了抗原與篩選出的單克隆抗體的結(jié)合能力。在使用ELISA檢測(cè)效價(jià)時(shí)，因?yàn)镋LISA 法的重復(fù)性不好，所以摸索適宜的反應(yīng)條件非常重要，還需考慮樣品中基質(zhì)對(duì)反應(yīng)的影響，因此本試驗(yàn)方法在實(shí)際應(yīng)用中還有待進(jìn)一步優(yōu)化。在以上所有的前期構(gòu)建及后期鑒定后，本試驗(yàn)成功研制出5株單克隆抗體（1E9A9、2A9C1、3F2E9、6G2E9、6E10D9），并選取了其中2株（3F2E9、6E10D9）投入使用，為建立CL殘留現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑盒打下了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Preparation and Identi fi cation of Monoclonal Antibodies against Clenbuterol

Zhang Lingling1，2，Zhan Xiang3，Peng Zhe1，2，Shi Jianli1，2，Wu Xiaoyan1，2，Xu Shengnan1，2，Zheng Shuxuan1，2，Xu Shaojian1，2，Huang Baohua1，2，Li Jun1，2
（1. Animal Husbandry and Veterinary Research Institute，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan，Shandong 250100；2. Shandong Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding，Jinan，Shandong 250100；3. Jinan Animal Health Supervision Institution，Jinan， Shandong 250011）

In order to further develop the method for detecting residual Clenbuterol（CL），so as to lay foundation for research and development of the detection kits，monoclonal antibodies（mAbs）against CL were prepared. Through diazo reaction，CL was coupled with Bovine serum albumin（BSA）and Ovalbumin（OVA），the coupling products were used as immunogen and detection antigen，respectively. Using hybridoma technique，5 monoclonal hybridoma cell strains（1E9A9、2A9C1、3F2E9、6G2E9、6E10D9）which could secret antibodies against small CL molecules were obtained. During serial subcultivation in vitro and cryopreservation and resuscitation，the antibodies could be secreted stably. ELISA detection showed the antibody titers of supernatant of the 5 strains were 1:128 000，1:512 000，1:128 000，1:512 000 and 1:256 000，respectively. Ascites containing mAbs were induced by hybridoma cell strain 3F2E9 and 6E10D9 and the antibody titers in puri fi ed ascites were 1:128 000 and 1:256 000. Measurement by BCA protein determination method showed their concentrations were 1.60 mg/mL and 1.54 mg/mL repectively. Through Dot-ELISA，good reactivity between the two mAbs and CL was veri fi ed. As a conclusion，speci fi c mAbs against CL were prepared successfully，which would lay foundation for further research of the kits for CL residue detection.

Clenbuterol；monoclonal antibody；residue detection

S851.34

：A

：1005-944X（2017）02-0091-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.02.027

“十三五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0500708）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疫病控制崗位（SDAIT-08-07）；山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題；山東省科技發(fā)展計(jì)劃（2014GNC111011）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才培養(yǎng)工程；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金項(xiàng)目（2016YQN53）

李 俊