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（1. 深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045；2. 深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東深圳 518060）

鯉春病毒血癥病毒核酸適配體的篩選及分析

于 力1，王津津1，盧奕良2，鄭曉聰1，賈 鵬1，何俊強(qiáng)1，史秀杰1，劉 瑩1，劉 葒1

（1. 深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東深圳 518045；2. 深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東深圳 518060）

核酸適配體（Aptamer）是一類單鏈短DNA或RNA片段，具有一定的空間結(jié)構(gòu)，對特定靶分子具有親和力。本研究采用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX），首次篩選出針對鯉春病毒血癥病毒（SVCV）的核酸適配體A2和A15，經(jīng)過熒光PCR、凝膠阻滯和病毒中和實(shí)驗(yàn)，證明了其對SVCV具有結(jié)合力和抑制作用，在該病的檢測和防治方面具有良好的前景。

核酸適配體；指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)；鯉春病毒血癥病毒；病毒抑制

核酸適配體（Aptamer）又稱為核酸適配子，是一類單鏈短DNA或RNA片段，具有一定的空間結(jié)構(gòu)，對特定的靶分子具有親和力[1-4]。核酸適配體一般通過對核酸適配體庫進(jìn)行體外篩選獲得，這種技術(shù)名為指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Selective expansion of ligands by exponential enrichment，SELEX）[1-2]。適配體庫長度一般為50～100 nt，兩端為固定序列，能與特定引物結(jié)合，中間為20～50 nt的隨機(jī)序列，因此理論上存在420～450種序列，以及多種二級結(jié)構(gòu)。適配體庫通過與靶分子結(jié)合、洗脫、PCR富集等步驟的循環(huán)，可達(dá)到迅速富集具有親和力適配體的效果，目前主要運(yùn)用于醫(yī)學(xué)前沿領(lǐng)域，如抑制人獸共患病毒[5-6]，以及抗腫瘤藥物的研發(fā)[7]等。

鯉春病毒血癥（Spring viremia of carp）是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）須通報(bào)動物疫病，致死率高，宿主主要為鯉科魚類，對我國鯉科魚養(yǎng)殖業(yè)造成很大威脅。其病原為鯉春病毒血癥病毒（Spring Viremia of carp virus，SVCV），屬于彈狀病毒科。SVCV病毒粒子呈子彈狀，長90～180 nm，寬60～90 nm，基因組長度為11 019 nt[8-9]。

核酸適配體屬于比較前沿的技術(shù)，目前主要運(yùn)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，而運(yùn)用于水生動物病毒的研究較少，尚未有關(guān)于SVCV適配體的文章發(fā)表。

1 材料和方法

1.1毒株和細(xì)胞系

SVCV A-1株[10]由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心分離并保存；鯉魚上皮瘤細(xì)胞（EPC）由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心保存。

1.2核酸適配體的合成

核酸適配體序列為5'-GGACACTCAAGGTTCATCAG-40（N）-GAGTAGTTCAGGATAGGACG-3'。引物序列為：AF：5'-GGACACTCAAGGTTCATCAG-3'；AR：5'-CGTCCTATCCTGAACTACTC-3'；AR-P：5'P-CGTCCTATCCTGAACTACTC-3'（5'端磷酸化修飾）。均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3SVCV的純化

培養(yǎng)EPC于25 ℃，傳代24 h后接種SVCV。當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生90%病變后，凍融3次，12 000 g 4 ℃離心30 min，收集上清病毒懸液，140 000 g 4 ℃超速離心4 h，去上清，將沉淀用少量磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸。配制30%、45%、60%梯度蔗糖，將PBS病毒重懸液加于30%蔗糖界面上，100 000 g 4 ℃超速離心3 h，收集30%與45%濃度分界處的沉淀，用適量PBS溶解，140 000 g 4 ℃超速離心4 h，去上清，將沉淀用適量PBS重懸。

1.4純化SVCV量的測定

純化SVCV的蛋白質(zhì)含量測定使用改良型BCA蛋白濃度測定試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司），病毒滴度TCID50的測定使用Reed-Muench法[11]。

1.5核酸適配體的SELEX篩選

將500 ng純化的SVCV和EPC細(xì)胞碎片分別包被酶標(biāo)板（Corning），4 ℃過夜后，用PBS與PBST各洗2次。將5 OD（約5.5 nmole）核酸適配體庫溶于PBS，95 ℃加熱10 min，立即置于冰上10 min。將適配體庫加至EPC細(xì)胞碎片包被的孔，室溫結(jié)合1 h進(jìn)行負(fù)篩選，去除與EPC碎片結(jié)合的適配體。將上清加至SVCV包被的孔，室溫結(jié)合1 h。用PBS洗滌5次后，加入蛋白酶K消化，以釋放出結(jié)合的適配體。對消化液上清，使用核酸回收試劑盒QIAquick Nucleotide Removal Kit（QIAGEN）進(jìn)行適配體回收。使用AF/AR引物，進(jìn)行熒光PCR（SYBR Premix Ex TaqⅡ，Takara），同時設(shè)置篩選前適配體庫的濃度稀釋梯度（102～106倍），以測定結(jié)合回收率。

1.6核酸適配體的富集

對回收的核酸適配體，使用AF/AR-P引物，進(jìn)行普通PCR（Ex Taq，Takara），95 ℃ 2 min，15個循環(huán)（95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s），72 ℃ 3 min。使用Lambda核酸外切酶（New England Biolabs），37 ℃ 30 min，酶切去除磷酸化修飾的反向鏈，將單鏈化后的核酸適配體用于下一輪篩選。重復(fù)篩選數(shù)次，逐步增加洗滌次數(shù)，直至回收率不再提高。

1.7核酸適配體的單克隆與測序

對最后一輪結(jié)合后回收的核酸適配體，使用AF/AR引物進(jìn)行普通PCR。將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體（Takara）上，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α（Takara），涂布于氨芐青霉素抗性平板。挑取單克隆，按方法1.5進(jìn)行結(jié)合力確認(rèn)后，送華大基因進(jìn)行測序。

1.8二級結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)核酸適配體的測序結(jié)果，使用Mfold軟件[12]分析其二級結(jié)構(gòu)，選取自由能ΔG最低，即結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的構(gòu)象。

1.9結(jié)合力分析

根據(jù)測序結(jié)果，核酸適配體由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。為驗(yàn)證其結(jié)合力，使用10 ng合成的核酸適配體，按方法1.5進(jìn)行結(jié)合、洗滌、酶消化和回收，再進(jìn)行熒光PCR分析，測定回收率。同時設(shè)置EPC細(xì)胞碎片包被孔作為陰性對照和空白對照。

1.10凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)

將1 μg合成的核酸適配體95 ℃加熱10 min，立即置于冰上10 min。分別與12 μg、2.4 μg、0.48 μg質(zhì)量梯度的SVCV室溫結(jié)合1 h，同時設(shè)置陰性對照（12 μg、2.4 μg EPC細(xì)胞碎片）和空白對照（12 μg BSA）。2%瓊脂糖凝膠電泳，核酸染料（SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain，Life Technology）染色，凝膠成像儀拍照。

1.11病毒中和實(shí)驗(yàn)

將15 μg核酸適配體95 ℃加熱10 min，立即置于冰上10 min。與6.3×103TCID50/mL SVCV室溫結(jié)合1 h，接種到傳代24 h的EPC細(xì)胞。同時設(shè)置僅加核酸適配體的孔、陽性對照（僅SVCV）和陰性對照（僅PBS），20 ℃培養(yǎng)5天后觀察病變。

2 結(jié)果

2.1SVCV量的測定

對純化后的SVCV進(jìn)行測定。測得蛋白質(zhì)含量為1.28 mg/mL，滴度為6.3×109TCID50/mL。

2.2核酸適配體的富集

每輪篩選的回收率如圖1所示。前4輪回收率增加不明顯，從第5輪開始顯著增加，至第8輪趨于穩(wěn)定，因此選取第9輪的篩選產(chǎn)物進(jìn)行克隆分析。

圖1 核酸適配體SELEX篩選每輪的回收率

2.3測序與構(gòu)象分析

按方法1.7進(jìn)行結(jié)合力確認(rèn)后，選取結(jié)合力最佳的2個克隆進(jìn)行測序，編號分別為A2和A15，測序結(jié)果見表1，其中兩端下劃線部分為固定序列；二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見圖2，均具有多個莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

表1 核酸適配體的序列

圖2 核酸適配體二級結(jié)構(gòu)

2.4結(jié)合力驗(yàn)證

對合成的A2和A15適配體進(jìn)行結(jié)合力驗(yàn)證，結(jié)果見圖3。A2和A15具有相近的結(jié)合回收率，分別為1.43×10-3和1.11×10-3，而陰性對照的回收率分別為2.28×10-5和2.96×10-5。

圖3 核酸適配體結(jié)合力驗(yàn)證、熒光PCR測定結(jié)合回收率

2.5凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)

適配體A2和A15凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見圖4-A和圖4-B）。適配體與SVCV結(jié)合的凝膠孔內(nèi)（泳道1～2）可見亮帶，且隨著SVCV量的減少而減弱。而隨著SVCV的量繼續(xù)減少（泳道3），陰性對照（泳道4～5）和空白對照（泳道6）均未見發(fā)生阻滯，說明適配體A2和A15能與SVCV特異結(jié)合。

2.6病毒中和實(shí)驗(yàn)

僅接種SVCV的陽性對照孔（圖5E）出現(xiàn)明顯CPE。SVCV與適配體A2孵育后再接種，未出現(xiàn)明顯CPE（圖5A）；與A15孵育的孔出現(xiàn)微弱CPE（圖5C）。而僅加入適配體A2和A15的均未見對EPC細(xì)胞產(chǎn)生毒性（圖5B和5D），說明A2和A15對SVCV具有中和以及抑制作用，而該適配體對細(xì)胞均無毒性。

圖4 核酸適配體凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 核酸適配體病毒中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

核酸適配體由于具有一定的空間構(gòu)象，因此具有和靶物質(zhì)結(jié)合的能力。本文運(yùn)用了SELEX篩選方法，首次篩選出針對SVCV的核酸適配體，其具備理想的結(jié)合能力。

核酸適配體篩選的重要一步是靶物質(zhì)的固定化。目前許多文獻(xiàn)主要報(bào)道了采取標(biāo)簽化磁珠結(jié)合表達(dá)蛋白的方法[6，13-14]。本文采取了酶標(biāo)板包被的方法，靶物質(zhì)是純化后的全病毒。全病毒相比表達(dá)的蛋白，其抗原空間構(gòu)象更準(zhǔn)確，能提高篩選的成功率。而酶標(biāo)板具有對核酸吸附低、能吸附無標(biāo)簽蛋白，以及便于洗滌的優(yōu)點(diǎn)[15]。但這也可能導(dǎo)致雜蛋白的吸附，因此每一輪的篩選都會加入負(fù)篩選，以保證及時去除非特異性的適配體[16]。

本文采用三種不同原理的實(shí)驗(yàn)方法，對篩選出的核酸適配體進(jìn)行了驗(yàn)證。熒光PCR方法是通過測定回收率來驗(yàn)證其結(jié)合力，這與SELEX篩選過程和方法一致，而測定的回收率也與SELEX最后3輪相近，說明核酸適配體的結(jié)合能力與預(yù)期相符。凝膠阻滯是測試核酸蛋白質(zhì)相互作用的方法，也有文章報(bào)道用于驗(yàn)證適配體結(jié)合力[17]。本文的凝膠阻滯測試結(jié)果說明，兩種核酸適配體均能與SVCV相結(jié)合，引起一定量核酸在凝膠孔中阻滯，而且隨著SVCV量的梯度減少而減弱，存在一定比例關(guān)系。病毒中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，核酸適配體能對SVCV產(chǎn)生抑制，不對正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性，佐證了適配體能和SVCV相結(jié)合，這也與其他研究相符[18-19]。

從熒光PCR和病毒中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，2種適配體的效果相近，但A2比A15略好。兩者的二級結(jié)構(gòu)比較相似，說明兩者可能都是針對SVCV同一種蛋白位點(diǎn)。

綜上所述，本文采用了熒光定量、凝膠阻滯和病毒中和三種不同原理的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均證明了篩選出來的2種核酸適配體對SVCV具有結(jié)合能力。由于具備針對SVCV的結(jié)合和抑制能力，該適配體在該病的檢測和防治方面具有良好的前景。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Selection and Analysis on Aptamers against Spring Viremia of Carp Virus

Yu Li1，Wang Jinjin1，Lu Yiliang2，Zheng Xiaocong1，Jia Peng1，He Junqiang1，Shi Xiujie1，Liu Ying1，Liu Hong1
（1. Shenzhen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen，Guangdong 518045；2. College of Life Science and Oceanography，Shenzhen University，Shenzhen，Guangdong 518060）

Aptamer is a kind of single-stranded oligonucleotides（DNA or RNA）with affinity to specific target molecules due to its certain spatial structure. By adopting the technology of selective evolution of ligands by exponential enrichment（SELEX），aptamers（A2 and A15）against spring viremia of carp virus（SVCV）were screened out for the first time. Real-time PCR，electrophoretic mobility shift assay，and virus neutralization showed that the aptamers could bind to SVCV，showing inhibitory effects to the virus. Therefore these aptamers had broad prospects for detection，prevention and treatment of SVC.

aptamer；SELEX；SVCV；virus inhibition

S851.34

：A

：1005-944X（2017）02-0101-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.02.029

國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016IK238）；深圳檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（SZ2014202和SZ2015203）；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201210055）

劉 葒