，，，，

（1. 山西省大同市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西大同 037004；2. 山西省靈丘縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西靈丘 034400）

布魯氏菌病疫苗S2株免疫成年綿羊的抗體消長(zhǎng)規(guī)律試驗(yàn)

樊生平1，齊守軍1，李連平1，韓小軍1，曹春紅2

（1. 山西省大同市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西大同 037004；2. 山西省靈丘縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山西靈丘 034400）

[目的]探索成年綿羊經(jīng)布魯氏菌病疫苗S2株免疫后血清抗體的消長(zhǎng)規(guī)律。[方法]采用“灌服100億菌”“灌服200億菌”和“肌注50億菌”三種不同免疫方法，對(duì)試驗(yàn)羊進(jìn)行布魯氏菌病S2株疫苗的免疫接種。在接種前和接種后不同時(shí)間點(diǎn)分別采集試驗(yàn)羊血清樣品，用虎紅凝集試驗(yàn)（RBT）和試管凝集試驗(yàn)（SAT）進(jìn)行血清抗體檢測(cè)。[結(jié)果]肌注組抗體上升較快，于免疫后10天達(dá)到峰值，然后快速下降，90天后下降速度減緩，但在180天時(shí)RBT和SAT陽(yáng)性率仍分別為63.2%和84.2%，SAT平均凝集效價(jià)為1:178.9。2個(gè)口服組均在免疫20天后抗體達(dá)到最高，以后下降，分別于90天和120天降到最低，然后有所回升并維持在低水平波動(dòng)；至180天時(shí)，口服組的RBT陽(yáng)性率均下降為0，SAT陽(yáng)性率分別下降為40.9%和23.1%，SAT平均凝集效價(jià)分別降至1:40.9和1:18.2。[結(jié)論]對(duì)采用布魯氏菌病S2株活疫苗口服免疫6個(gè)月以后的羊群，可用虎紅凝集試驗(yàn)進(jìn)行布魯氏菌病檢疫的初篩。

成年綿羊；布魯氏菌?。籗2株疫苗；免疫抗體；檢測(cè)；檢疫

布魯氏菌病（Brucellosis，以下簡(jiǎn)稱布病）是由布魯氏菌屬細(xì)菌引起的一種人獸共患傳染病。其中，羊種布魯氏菌侵入性最強(qiáng)[1]，主要侵害羊的生殖系統(tǒng)和關(guān)節(jié)等器官，使懷孕母羊流產(chǎn)，公羊發(fā)生睪丸炎等，是引起人感染的主要菌型，可使人發(fā)熱、出汗，且長(zhǎng)期不愈，給畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康帶來(lái)嚴(yán)重危害。我國(guó)已將布病列為二類動(dòng)物疫病，并且列入《國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃（2012-2020）》重點(diǎn)防控疫病名錄。

羊布病控制的要點(diǎn)雖然是執(zhí)行以檢疫凈化為主的綜合防控措施，但對(duì)污染區(qū)的易感羊群也需采取疫苗接種措施，主要接種豬種布魯氏菌S2株弱毒疫苗。該疫苗雖具有良好的免疫效果，但目前尚無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分疫苗接種抗體和自然感染抗體，主要以疫苗免疫抗體存續(xù)時(shí)間短，自然感染抗體存續(xù)時(shí)間長(zhǎng)來(lái)鑒別[2]。目前，有關(guān)S2株疫苗免疫綿羊的抗體存續(xù)時(shí)間的報(bào)道不盡相同。

本試驗(yàn)用S2株疫苗免疫成年健康母綿羊后，用虎紅凝集試驗(yàn)（RBT）和試管凝集試驗(yàn)（SAT）分別進(jìn)行血清抗體分時(shí)段檢測(cè)，探索S2株疫苗免疫成年母綿羊后的抗體消長(zhǎng)規(guī)律，為當(dāng)?shù)爻赡昴妇d羊的布病免疫和檢疫，尋找切實(shí)可行的方法和途徑，為基層獸醫(yī)工作者開(kāi)展布病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物。舍飼的本地二代寒羊母羊100只，均為2～3胎齡，無(wú)流產(chǎn)病史，且經(jīng)布病虎紅凝集試驗(yàn)（RBT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）檢測(cè)均為陰性；隨機(jī)分成4組，每組25只，分別為口服免疫1組（QF1組）、口服免疫2組（QF2組）、肌注免疫組（JZ組）、對(duì)照組（DZ組）。試驗(yàn)羊均進(jìn)行耳標(biāo)標(biāo)記，按正常生產(chǎn)進(jìn)行飼養(yǎng)管理。

1.1.2試驗(yàn)用疫苗。布病活疫苗（S2株），購(gòu)自金宇保靈生物藥品有限公司，批號(hào)5393001。

1.1.3檢測(cè)試劑：布病虎紅凝集抗原（批號(hào)201507）、布病虎紅凝集陰性血清（批號(hào)201505）、布病虎紅凝集陽(yáng)性血清（批號(hào)201502），均購(gòu)自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司；布病試管凝集試驗(yàn)抗原（批號(hào)20150702）、布病試管凝集試驗(yàn)陽(yáng)性血清（批號(hào)20140701）和陰性血清（批號(hào)20140801），購(gòu)于青島易邦生物工程有限公司。各種檢查試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1免疫方法。將布病活疫苗（S2株）按說(shuō)明書(shū)所標(biāo)注的含菌數(shù)量，用生理鹽水稀釋。對(duì)口服組羊只（QF1、QF2組），用改裝的連續(xù)注射器（初步霧化），按2 mL/只灌服；對(duì)注射組羊只（JZ組），用連續(xù)注射器按 1mL/只肌肉注射；對(duì)空白對(duì)照組羊只（DZ組），不免疫。

1.2.2血清學(xué)檢測(cè)。在免疫前，以及免疫后的10、20、30、60、90、120、150和180天，分別對(duì)試驗(yàn)羊進(jìn)行頸靜脈采血，離心分離血清，分裝后-20 ℃保存。在實(shí)驗(yàn)室，采用布病虎紅凝集試驗(yàn)（RBT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)羊的血清抗體水平，具體操作與判定按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18646—2002進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果

對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)的布病虎紅凝集試驗(yàn)結(jié)果和試管凝集試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，試管凝集試驗(yàn)的平均凝集效價(jià)低于1:25。

2.2試驗(yàn)組檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)試驗(yàn)對(duì)比，JZ組抗體比QF組升得快，且JZ組血清抗體均高于QF組；另外，QF2組的血清抗體均高于QF1組。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)羊血清抗體虎紅凝集陽(yáng)性率與試管凝集陽(yáng)性率的變化趨勢(shì)一致。

2.2.1試驗(yàn)組抗體陽(yáng)性率檢測(cè)結(jié)果。各試驗(yàn)組抗體陽(yáng)性率均在免疫后20天到達(dá)高峰，具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.2試驗(yàn)組試管凝集效價(jià)檢測(cè)結(jié)果。各試驗(yàn)組試管凝集平均凝集效價(jià)多數(shù)在免疫后20天到達(dá)高峰（JZ組除外），具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 各試驗(yàn)組抗體陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì) （單位：%）

表2 各試驗(yàn)組試管凝集試驗(yàn)平均凝集效價(jià)統(tǒng)計(jì)

3 討論

從表1、表2可以看出，JZ組抗體上升較快，于10天時(shí)效價(jià)達(dá)最高，為1:2 358；QF1組和QF2組的抗體效價(jià)在免疫后20天時(shí)升至最高，分別為1:150和1:170，之后各組抗體凝集效價(jià)呈下降趨勢(shì)，到90天后，JZ組下降緩慢，但QF2組和QF1組抗體略有回升，并維持在低位波動(dòng)；至180天時(shí)，各試驗(yàn)組羊血清仍有凝集效價(jià)存在。蔡一非等[3]的研究表明，采用皮下注射布病（S2株）活疫苗50億的綿羊，免疫7天后血清試管凝集試驗(yàn)的平均凝集效價(jià)達(dá)最高。高紅霞[4]的研究發(fā)現(xiàn)，綿羊經(jīng)布病S2株活疫苗免疫1個(gè)月后，其凝集抗體達(dá)到最高。田素梅等[5]的檢測(cè)結(jié)果顯示，綿羊免疫布病（S2株）活疫苗后15天，其平均凝集抗體效價(jià)達(dá)到峰值，到9個(gè)月時(shí)仍可測(cè)到凝集抗體。

QF1組試驗(yàn)羊布病虎紅凝集陽(yáng)性率最高，為26.1%，并于免疫后90天下降到5%以下，在150天以后轉(zhuǎn)為陰性。QF2組試驗(yàn)羊虎紅凝集陽(yáng)性率最高，為42.9%，于免疫后150天降到5%以下，免疫180天后的虎紅平板凝集轉(zhuǎn)為陰性。這進(jìn)一步驗(yàn)證了毛開(kāi)榮[6]的觀點(diǎn)：用布病S2株活疫苗口服免疫羊，6個(gè)月后，其抗體水平已降到診斷陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)以下。以上結(jié)果說(shuō)明對(duì)采用布病S2株活疫苗口服免疫6個(gè)月以后的羊群，可用布病虎紅凝集試驗(yàn)進(jìn)行布病檢疫的初篩。

JZ組試驗(yàn)羊血清抗體遠(yuǎn)高于QF1組和QF2組，其試管凝集試驗(yàn)最高血清凝集效價(jià)達(dá)1:3 200（本試驗(yàn)設(shè)置的最高值），到免疫180天后，其試管凝集平均凝集效價(jià)仍為1:178.9，虎紅平板凝集和試管凝集陽(yáng)性率仍分別達(dá)63.2%和84.2%。但在肌注免疫后，該試驗(yàn)組羊只有3只發(fā)生流產(chǎn)（該試驗(yàn)組共有多少只懷孕羊，未作統(tǒng)計(jì)），與疫苗說(shuō)明書(shū)相符，即注射免疫只能在非懷孕羊只上進(jìn)行。同時(shí)，為了布病檢疫、凈化的方便易行，對(duì)區(qū)域性的布病免疫，建議采用口服免疫。

從QF1組和QF2組血清抗體檢測(cè)結(jié)果看，在試驗(yàn)觀察期（180天）的大多數(shù)時(shí)點(diǎn)中，QF2組的血清抗體均高于QF1組。申捷等[2]研究表明，綿羊口服100億和200億兩種免疫劑量的抗體陽(yáng)性差異不大。本試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果與之稍有差異，但從近年來(lái)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)看，QF1組的免疫方法完全可以預(yù)防羊只布病的發(fā)生和流行，并從節(jié)約成本來(lái)說(shuō)，大規(guī)模的綿羊布病免疫采用口服100億菌/只的方法切實(shí)可行。

各試驗(yàn)組羊血清試管凝集抗體陽(yáng)性率均高于同時(shí)點(diǎn)的虎紅凝集陽(yáng)性率（表1），QF1組和QF2組試管凝集陽(yáng)性率高時(shí)分別可達(dá)60.9%和77.6%，即使到免疫后180天，還分別為23.1%和40.9%，而JZ組到免疫后180天時(shí)，其陽(yáng)性率仍高達(dá)84.2%。本研究的虎紅凝集和試管凝集陽(yáng)性率結(jié)果與陳嘉章等[7]的“對(duì)羊陽(yáng)性檢出率以平板法最高，試管凝集法次之，虎紅凝集法最低”和羅建軍等[8]的“試管凝集反應(yīng)陽(yáng)性率均高于虎紅平板試驗(yàn)”研究結(jié)果相一致，所以針對(duì)免疫羊群的布病檢疫，不建議采用試管凝集試驗(yàn)的方法。

從各試驗(yàn)組羊血清抗體陽(yáng)性率結(jié)果（表1）可以看出，試驗(yàn)羊血清抗體虎紅凝集陽(yáng)性率與試管凝集陽(yáng)性率的變化趨勢(shì)基本一致，說(shuō)明兩者皆以檢測(cè)大分子的IgM類抗體為主[3]。

據(jù)此，區(qū)域性的綿羊布病防控推薦：布疫病苗（S2株）100億菌/只灌服免疫；羊群布病檢疫于在免疫5～6個(gè)月后進(jìn)行，先用虎紅凝集試驗(yàn)初篩，再用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cELISA）復(fù)檢。

[1]克勞斯·尼爾森，于偉玲.布魯氏菌病診療過(guò)程中被忽視的要點(diǎn)[J]. 獸醫(yī)導(dǎo)刊，2011（11）：38-39.

[2]申捷，寶音達(dá)來(lái)，馬立峰，等. 布魯氏菌病疫苗（S2株）免疫羊抗體消長(zhǎng)規(guī)律的研究[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2015，32（1）：68-73.

[3]蔡一非，趙智香，鐘旗，等. 不同的血清學(xué)方法對(duì)布病疫苗免疫綿羊抗體檢測(cè)結(jié)果的比較研究[J]. 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2008，25（12）：31-33.

[4]高紅霞. 不同血清學(xué)方法檢測(cè)牛、羊布魯氏菌疫苗免疫綿羊抗體消長(zhǎng)規(guī)律的比較研究[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[5]田素梅，周紅菊，溫都蘇，等. 綿羊抗布魯氏菌特異性IgG、IgA和IgM抗體的觀察[J].中國(guó)人獸共患病雜志，1993，9（3）：53.

[6]毛開(kāi)榮. 動(dòng)物布氏菌病的診斷[J]. 獸醫(yī)導(dǎo)刊，2011（9）：50-52.

[7]陳嘉章，倪富美. 平板凝集反應(yīng)、試管凝集反應(yīng)活虎紅平板試驗(yàn)對(duì)牛羊布氏桿菌病陽(yáng)性檢出率的對(duì)比試驗(yàn)[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志，1981（10）：31.

[8]羅建軍，肖峰，蘇貴軍，等. 青海都蘭野生反芻獸和嚙齒動(dòng)物布魯菌病血清學(xué)檢查[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志，2016（3）：97-98.

（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Dynamical Changes of Antibodies after Immunization with Brucellosis Vaccine of S2 Strain in Adult Sheep

Fan Shengping1，Qi Shoujun1，Li Lianping1，Han Xiaojun1，Cao Chunhong2
（1. Datong Animal Disease Prevention and Control Center of Shanxi Province，Datong，Shanxi 037004；2. Lingqiu Animal Disease Prevention and Control Center of Shanxi Province，Lingqiu， Shanxi 034400）

[Objective]In order to explore the dynamical changes of antibodies after being immunized with brucellosis vaccine of S2 strain in adult sheep.[Methods]Vaccination experiments were conducted by three different methods：perfusion of 10 billion bacteria，perfusion of 20 billion bacteria，and intramuscular injection of 5 billion bacteria. Serum samples were collected in different time-points before and after vaccination，the antibodies were detected by Rose Bengal plate agglutination test（RBT）and tube agglutination test（SAT）. [Results]The antibody level after intramuscular injection rose faster than the rest，it rose up to the highest level on 10th day after immunization，then declined rapidly and descent speed became slow after 90 days. The positive rates of RBT and SAT were 63.2% and 84.2% on 180thday after immunization，and the average agglutination titer was 1:178.9. On the other side，the antibodies of oral groups reached peak on 20th day after immunization，then decreased，the minimum level appeared on the 90th and 180th day，respectively. Then they increased slightly and waved at the low level. On the 180th day，the positive rates of both two oral groups detected by RBT fell to 0%，while that by SAT dropped to 40.9% and 23.1%，respectively. [Conclusion]The 6 months after oral immunization with brucellosis live vaccine of S2 strain in sheep fl ock，RBT could be used in preliminary screening of brucellosis inspection and quarantine.

adult sheep；brucellosis；vaccine of S2 strain；immune antibodies；detection；inspection

S851.3

B

1005-944X（2017）02-0088-03

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.02.026