李子寧 梁 彪 劉茂軍 褚 春 曾 歐 李 琳 李 妍 楊 軍

(南華大學附屬第一醫(yī)院老年醫(yī)學科，湖南 衡陽 421001)

硫化氫通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β及基質(zhì)金屬蛋白酶-9/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1改善糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)纖維化

李子寧 梁 彪 劉茂軍 褚 春1曾 歐 李 琳 李 妍 楊 軍

(南華大學附屬第一醫(yī)院老年醫(yī)學科，湖南 衡陽 421001)

目的 探討硫化氫(H2S)氣體信號分子對糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)纖維化及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)-1表達的影響。方法 單次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型將成年雄性SD大鼠64只隨機分為正常對照組(Control組)、STZ組、STZ+H2S組、H2S組。造模72 h后采尾靜脈血檢測，若血糖>16.7 mmol/L表明造模成功。H2S組和STZ+H2S組大鼠腹腔注射NaHS溶液100 μmol·kg-1·d-1，Control組和STZ組腹腔注射同等量生理鹽水。8 w后取標本，Masson染色觀察大鼠腎臟組織病理形態(tài)學改變，Western印跡檢測大鼠腎臟TGF-β、MMP-9、TIMP-1、Ⅳ型膠原蛋白的表達水平。結(jié)果 與Control組相比，STZ組存在明顯腎小管間質(zhì)纖維化，同時腎臟組織中Ⅳ型膠原、TGF-β、TIMP-1蛋白的表達升高，MMP-9蛋白的表達水平下降(P<0.05)；與STZ組大鼠相比，STZ+H2S組腎小管間質(zhì)纖維化減輕，腎組織TGF-β、TIMP-1、Ⅳ型膠原蛋白的表達降低，MMP-9蛋白表達水平升高(P<0.05)。結(jié)論 H2S可改善糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)纖維化，其機制可能與調(diào)控MMP-9/TIMP-1失衡以及TGF-β蛋白的表達水平有關(guān)。

硫化氫；糖尿??；轉(zhuǎn)化生長因子-β ；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

糖尿病腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)病機制尚不完全清楚，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β可刺激間質(zhì)細胞增殖及產(chǎn)生細胞外基質(zhì)(ECM)，促進ECM沉積，誘導成纖維細胞合成ECM，是纖維化反應(yīng)的重要介質(zhì)〔1〕。腎小管間質(zhì)纖維化與基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)-1的比例失調(diào)有關(guān)。Ⅳ型膠原是ECM的主要組成部分,MMP-9能特異性降解Ⅳ型膠原,對腎小管間質(zhì)纖維化有重要影響〔2〕；TIMP-1通過拮抗MMP-9發(fā)揮作用。硫化氫(H2S)是具有傳遞細胞信號功能的內(nèi)源性氣體遞質(zhì)，在糖尿病進展過程中發(fā)揮較多生理效應(yīng)。本文采用單次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病動物模型，觀察H2S對糖尿病大鼠模型腎小管間質(zhì)纖維化的影響以及對Ⅳ型膠原、TGF-β、MMP-9和TIMP-1蛋白表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、試驗試劑、儀器 成年雄性SD大鼠64只，體重(300±25)g，購于南華大學動物試驗中心；STZ購自美國MP Biomedicals Company，硫氫化鈉購自美國Sigma公司；TGF-β、MMP-9、TIMP-1及Ⅳ型膠原一抗購自武漢博士德生物公司；鼠GAPDH單克隆抗體為廣州晶欣生物科技有限公司產(chǎn)品；HRP抗兔二抗為北京博奧森生物公司產(chǎn)品，細胞裂解液、BCA試劑盒來自中國碧云天生物技術(shù)公司。電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及方法 將成年雄性SD大鼠先飼養(yǎng)1 w，恒溫環(huán)境，白天黑夜各12 h，自由進食飲水，使其適應(yīng)環(huán)境。按體質(zhì)量隨機分為正常對照(Control)組、STZ組、STZ+H2S組及H2S組各16只；大鼠禁食12 h后，通過單次腹腔注射STZ(40 mg/kg)建造糖尿病動物模型。為避免低血糖，24 h內(nèi)予以大鼠5%葡糖糖代替飲水；非糖尿病大鼠注射等量檸檬酸鈉；72 h后尾靜脈取血，測血糖>16.7 mmol/L為糖尿病動物造模成功〔3〕。以硫氫化鈉作為外源性H2S供體予以STZ+H2S組和H2S組大鼠連續(xù)8 w每日腹腔注射100 μmol/kg，Control組和STZ組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。8 w后以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射進行麻醉，剖開腹腔取得腎臟標本后用冰生理鹽水清潔沖洗，吸干水分，去除腎臟周圍組織包膜、血管，取適量組織于100 g/L多聚甲醛中固定24 h，余腎臟標本保存待用。

1.2.2 Masson方法觀察大鼠腎臟組織膠原纖維染色 取以甲醛固定的4組大鼠腎臟組織；經(jīng)石蠟包埋,制成4～6 μm的切片；切片脫蠟后入5%鐵明礬水溶液固定24 h；先后用自來水和蒸餾水沖洗，用Regaud蘇木精染5～10 min；蒸餾水洗后入2.5%鐵明礬水溶液，待細胞核顯示清晰后流水洗10 min；入1%酸性復紅染10 min；蒸餾水沖洗后加入1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min；加入含2.5%冰醋酸苯胺藍飽和水溶液；蒸餾水洗；1%冰醋酸浸洗5 min；梯度酒精脫水后透明封固。陽性結(jié)果為膠原纖維呈藍色，細胞核藍褐色，胞質(zhì)、肌纖維呈紅色。

1.2.3 Western印跡檢測Ⅳ型膠原、MMP-9、TIMP-1及TGF-β表達水平 取4組大鼠新鮮腎臟標本，以GAPDH為內(nèi)參；裂解細胞后提取蛋白，進行BCA比色法蛋白定量；蛋白樣品100℃煮沸5 min促使變性；以5%濃縮膠、10%分離膠SDS-PAGE凝膠電泳。恒壓80 V電泳25 min，條帶電泳至分離膠上緣后調(diào)整為恒壓120 V、60 min；PVDF膜以甲醇浸泡5 min，置于轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡5 min，采用濕轉(zhuǎn)法恒流200 mA、90 min，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。室溫下以TBST配制的5%BSA搖床輕搖封閉1.5 h后，以Ⅳ型膠原、TGF-β、MMP-9、TIMP-1和GAPDH一抗(稀釋濃度均為1∶500，37℃脫色搖床輕搖孵育1 h后4℃冰箱過夜，然后室溫下以TBST(含20%Tween20)漂洗膜3次，10 min/次；用HRP標記的二抗(稀釋度1∶4 000)37℃搖床孵育1 h，之后用TBST液漂洗3次；使ECL與膜作用1 min，化學發(fā)光顯色，以Image J軟件進行圖像光密度分析，條帶灰度比值分別表示TGF-β、TIMP-1、MMP-9和Ⅳ型膠原蛋白含量表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

實驗過程中共死亡5只大鼠，其中STZ組2只，STZ+H2S組1只，H2S組2只，死亡原因推測為感染和糖尿病并發(fā)癥。

2.1 尿蛋白測定 實驗第8周Control組尿蛋白(11.8±3.3)mg，STZ為(44.5±6.4)mg，STZ+H2S組為(26.6±6.1)mg，H2S組為(12.6±4.0)mg。與Control組相比，STZ組顯著增加(P<0.05)；與STZ組相比，STZ+H2S組明顯出現(xiàn)尿蛋白定量下降(P<0.05)。

2.2 大鼠腎臟Masson染色 Control組腎小管間質(zhì)僅可見少量藍色膠原纖維沉積；STZ組大鼠腎臟組織染色結(jié)果表明較多藍染的膠原纖維沉積，說明存在明顯腎小管間質(zhì)纖維化；而STZ+H2S組腎小管間質(zhì)纖維化有所改善，大鼠腎臟組織藍染膠原纖維沉積程度減輕；H2S組大鼠腎臟藍染膠原纖維表達程度與Control組無明顯差異。見圖1。

圖1 各組腎組織Masson染色結(jié)果(×200)

2.3 Ⅳ型膠原表達水平 STZ組(1.19±0.016)大鼠腎臟組織Ⅳ型膠原蛋白表達水平與Control組(0.89±0.068)相比明顯上調(diào)(P<0.05)；與STZ組相比，H2S組(0.91±0.059)表達水平顯著下調(diào)(P<0.05)。而H2S組與Control組比較無統(tǒng)計學差異(P<0.05)。STZ+H2S組為(0.76±0.076)。見圖2。

2.4 TGF-β、TIMP-1和MMP-9蛋白在大鼠腎臟組織表達水平 STZ組與Control組相比，大鼠腎臟組織MMP-9蛋白表達水平顯著下調(diào)〔STZ組(0.68±0.019),Control組(0.88±0.032)〕，TIMP-1〔STZ組(1.04±0.020)，Control組(0.83±0.015)〕及TGF-β〔STZ組(1.17±0.018)，Control組(1.01±0.005)〕蛋白表達水平明顯上調(diào)(P<0.05)；STZ+H2S組TGF-β(0.85±0.015)和TIMP-1蛋白(0.84±0.053)表達水平較STZ組均有明顯下調(diào)(P<0.05)，而MMP-9蛋白表達水平則表現(xiàn)為明顯上調(diào)(0.94±0.059)。H2S組〔MMP-9(0.88±0.005),TGF-β：(0.99±0.036)，TIMP-1：(1.08±0.007)〕大鼠腎臟組織各蛋白表達水平與Control組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見圖2。

圖2 Ⅳ型膠原、TGF-β、TIMP-1和MMP-9蛋白表達水平

3 討 論

腎小管間質(zhì)纖維化與腎臟終末期疾病具有明確的相關(guān)性，是導致糖尿病腎衰竭的重要病理改變；成纖維細胞是主要的介導腎小管間質(zhì)纖維化的效應(yīng)細胞，細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導通路如何導致間質(zhì)纖維化很大程度上仍然未知。目前，TGF-β被認為是與組織纖維化關(guān)系密切的細胞因子，在組織纖維化的進展中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用，TGF-β可誘導刺激成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化、趨化炎性細胞浸潤、增加ECM合成，此外還可抑制降解ECM的蛋白酶活性，通過抑制MMPs的表達和誘導TIMPs的合成，抑制ECM降解〔4〕。TGF-β還能直接誘導TIMP-1基因表達，從而介導細胞因子的致纖維化作用〔5〕。Campistol等〔6〕表明，血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)正是通過減少TGF-β的合成和分泌途徑預防腎間質(zhì)纖維化。糖尿病患者ECM過多沉積和分解減少與腎小管間質(zhì)纖維化也有密切相關(guān)，MMP-9及TIMP-1是調(diào)節(jié)基質(zhì)降解的重要因子。腎小管間質(zhì)纖維化程度與萎縮的腎小管細胞核內(nèi)MMP-9的表達水平呈正相關(guān)，MMP-9可阻礙腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，調(diào)節(jié)腎小管間質(zhì)纖維化并保護腎小管基底膜和減少ECM的表達〔7〕。

本試驗結(jié)果提示腎小管間質(zhì)纖維化可能與TGF-β增多及其介導的MMP-9/TIMP-1失調(diào)有關(guān)；糖尿病時腎臟組織TGF-β表達水平上升和MMP-9/TIMP-1蛋白表達比例失調(diào)可能是導致腎小管ECM沉積乃至腎小管間質(zhì)纖維化的重要原因。TGF-β表達上調(diào)可能是糖尿病進展過程中影響MMP-9/TIMP-1失調(diào)和ECM降解異常的一個重要機制〔8〕。

H2S是新發(fā)現(xiàn)的第三類氣體信號分子〔9〕，研究表明H2S是高效的細胞色素C氧化酶抑制劑，其抑制作用具有可逆性；另有研究證實H2S對機體新陳代謝具有意義深遠的影響〔10〕，對腎臟具有保護作用。新型信號分子的發(fā)現(xiàn)最終可能形成新的治療策略，延緩腎臟疾病進展。有研究顯示,H2S能改善腎小管間質(zhì)纖維化，其機制與調(diào)節(jié)TGF-β蛋白的表達水平有關(guān)。本研究提示H2S具有減輕糖尿病大鼠腎小管間質(zhì)纖維化的治療作用。H2S可抑制TIMP-1表達、增加MMP-9表達，顯著改善兩者之間的比例失調(diào)，這種作用很可能是通過抑制TGF-β的表達來完成的。H2S能改善腎小管間質(zhì)纖維化，其作用可能與逆轉(zhuǎn)MMP-9/TIMP-1蛋白表達比例失調(diào)有關(guān)，而且H2S還具有直接抑制TGF-β蛋白表達、改善腎小管間質(zhì)纖維化的作用。這些結(jié)果表明，H2S可能是治療腎小管間質(zhì)纖維化的有前景的選擇性治療方法；而H2S逆轉(zhuǎn)TGF-β介導的MMP-9/TIMP-1失調(diào)、改善腎小管間質(zhì)纖維化的內(nèi)部信號調(diào)控機制，以及未來的臨床應(yīng)用前景仍有待進一步研究。

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9 肖 婷，羅 健，吳志雄，等.硫化氫對糖尿病大鼠心肌纖維化及CX40 和CX45 表達的影響〔J〕．中國老年學雜志，2015;35(11):6025-7.

10 Blackstone E,Roth MB.H2S induces a suspended animation-like state in mice〔J〕.Science,2005;308(5721):518.

〔2016-04-27修回〕

(編輯 滕欣航)

Hydrogen sulfide alleviates renal fibrosis in diabetic rats through TGF-β, MMP-9 and TIMP-1 signaling pathway

LI Zi-Ning, LIANG Biao, LIU Mao-Jun,etal.

Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of South China University，Hengyang 421001，Hunan，China

Objective To explore the effects of hydrogen sulfide on glomerular fibrosis in diabetic rats and the expressions of TGF-β, MMP-9 and TIMP-1.Methods 64 adult male SD rats were randomly divided into control, streptozotocin(STZ), diabetic rats with H2S treatment (STZ+H2S) and normal rats with H2S treatment (H2S) groups.Diabetes mellitus was induced by the intraperitoneal injection of STZ. After the model was established successfully,the rats in STZ+H2S and H2S groups were given daily intraperitoneal injections of NaSH(100 μmol/kg)，while the rats in control and STZ groups were given saline.After 8 weeks,the pathologies of renal interstitial fibrosis were examined by Massion staining, and the expressions of CollagenⅣ, TGF-β, MMP-9 and MMP-1 were analyzed by Western blot.Results Compared with those of control group,the rats in STZ group showed obvious glomerular fibrosis in the nephridial tissue with significantly increased expression levels of CollagenⅣ, TGF-β and TIMP1 and decreased expression level of MMP9(P<0.05), while changes in STZ+H2S group were significantly reversed(P<0.05).Conclusions Hydrogen sulfide could alleviate glomerular fibrosis in diabetic rats,and the mechanism might involve the regulation of MMP-9/TIMP-1 imbalance and the level of TGF-β protein expression.

Hydrogen sulfide; Diabetes；TGF-β ；TIMP-1；MMP-9

國家自然科學基金(No.81270181)

楊 軍(1972-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導師，教授，主要從事心血管疾病研究。

李子寧(1978-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事心肌重構(gòu)與冠心病研究。

R587.1

A

1005-9202(2017)03-0544-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.010

1 南華大學附屬第二醫(yī)院藥劑科