向敏綜述張泓，陳玲審校

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸二科，貴州遵義563003）

結(jié)核分枝桿菌耐利福平機(jī)制及其研究進(jìn)展

向敏綜述張泓，陳玲審校

（遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸二科，貴州遵義563003）

結(jié)核病是嚴(yán)重危害公眾健康的全球性公共衛(wèi)生問題，耐藥結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核病的傳播使結(jié)核病疫情更加嚴(yán)峻。利福平是重要的一線抗結(jié)核藥之一，并且作為耐多藥結(jié)核病的替代標(biāo)志物。因此了解結(jié)核分枝桿菌耐利福平機(jī)制對(duì)預(yù)防及控制耐藥結(jié)核病有著重要意義。本文就結(jié)核分枝桿菌耐利福平機(jī)制及其研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

結(jié)核分枝桿菌；利福平；耐藥；機(jī)制

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的慢性傳染病，已成為嚴(yán)重危害公眾健康的全球性公共衛(wèi)生問題。近年來，由于化療方案不合理應(yīng)用、患者醫(yī)從性差等原因，耐藥結(jié)核病逐漸增多。耐藥結(jié)核病，尤其是耐多藥結(jié)核病(multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB)的傳播使結(jié)核病疫情更加嚴(yán)峻，全球結(jié)核病防治工作也面臨更大挑戰(zhàn)。WHO 2016年結(jié)核病報(bào)告[1]顯示，2015年全球結(jié)核病、耐利福平結(jié)核病、耐多藥結(jié)核病發(fā)患者數(shù)分別為1 040萬、10萬及48萬，結(jié)核病死亡人數(shù)為140萬，提示全球耐藥結(jié)核病疫情嚴(yán)重。利福平(Rifampin，RIF)是重要的一線抗結(jié)核藥之一，并且作為耐多藥結(jié)核病的替代標(biāo)志物[2]。結(jié)核分枝桿菌耐利福平預(yù)示著患者化療療程延長，預(yù)后差。因此了解結(jié)核分枝桿菌耐利福平機(jī)制對(duì)預(yù)防及控制耐藥結(jié)核病有著重要意義。結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制主要包括靶基因構(gòu)改變、外排泵機(jī)制、細(xì)胞壁通透性變化、產(chǎn)生藥物降解、失活酶及代謝途徑改變等。本文就結(jié)核分枝桿菌耐利福平機(jī)制及其研究進(jìn)展綜述如下：

1 藥物作用靶基因變異機(jī)制

細(xì)菌內(nèi)藥物作用靶基因突變是結(jié)核分枝桿菌耐利福平的主要機(jī)制[3]。結(jié)核分枝桿菌RNA聚合酶參與細(xì)菌轉(zhuǎn)錄及RNA延伸，是生存所必需的酶。利福平通過非共價(jià)鍵與結(jié)核分枝桿菌DNA依賴的RNA聚合酶亞基特異性結(jié)合，抑制RNA聚合酶活性，干擾細(xì)菌轉(zhuǎn)錄起始和RNA延伸，阻礙蛋白質(zhì)合成從而發(fā)揮殺菌作用。RNA聚合酶由α2ββ'ω 5個(gè)亞單位組成，各亞基分別由rpoA、rpoB、rpoC和rpoZ基因編碼[4-5]，基因突變將導(dǎo)致相應(yīng)RNA聚合酶亞基結(jié)構(gòu)改變，影響利福平與之結(jié)合從而產(chǎn)生耐藥。

1.1 rpoB基因ropB基因全長3 519 bp(Gene ID：888164)，編碼RNA聚合酶β亞基[4]，rpoB基因突變是結(jié)核分枝桿菌耐利福平的主要機(jī)制[3]。近95%～97%的耐利福平菌株突變發(fā)生在rpoB基因507～533位密碼子共81個(gè)堿基組成的區(qū)域，也被稱為利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)[6]。突變主要以堿基置換為主，插入及缺失較少見。國外多年來報(bào)道顯示，531、526以及516為最常見的突變位點(diǎn)，其中S531L是最常見的突變形式，突變率約為63%[7-12]。在耐利福平菌株(包括單耐利福平、耐多藥及廣泛耐藥菌株)中突變率在8.3%～97%均有報(bào)道[7-12]，其差異受菌株耐藥譜、研究數(shù)量及地域[13]等影響。各國rpoB最常見突變位點(diǎn)也有差異，如南非東開普省、科特迪瓦以D516V為主[11，14]，伊朗西部以L511P為主[15]，非洲東南部斯威士蘭以I572F(30%)為主，且突變率僅次于S531L(46%)[16]。我國研究RRDR區(qū)域內(nèi)基因突變[17-21]發(fā)現(xiàn)，在4 895株耐利福平菌株中有4 571株(93.4%)檢測(cè)到RRDR區(qū)發(fā)生基因錯(cuò)義突變，197種不同突變類型，突變率略低于國外報(bào)道。其中發(fā)生單一位點(diǎn)突變4 275株(87.3%)、61種不同突變類型；雙位點(diǎn)聯(lián)合突變菌株251株(5.1%)、115種組合類型；多位點(diǎn)聯(lián)合突變菌株12株(0.3%)、9種組合類型；堿基插入突變菌株9株(0.18%)、2種組合類型；堿基缺失突變菌株12株(0.3%)、9種組合類型。在所有單位點(diǎn)錯(cuò)義突變中，531、526、516位點(diǎn)突變率居前三位，與國外報(bào)道一致[22]。531位點(diǎn)突變率為52.8%，共12種氨基酸突變類型：其中Ser→Leu突變率最高為50.2%，與國外報(bào)道大抵一致。其次為Ser→Trp 1.7%和Ser→Tyr 0.5%。526位點(diǎn)突變率為21.8%，共13種氨基酸突變類型，頻率最高的是His→Asp 9.1%，其次是His→Tyr 6.7%、His→Leu 1.94%、His→Arg 1.6%和His→Asn 1.2%。516位點(diǎn)突變率為6.0%，共11種氨基酸突變類型，頻率最高的前幾位分別為Asp→Val 2.6%、Asp→Gly 1.6%和Asp→Tyr 1.1%。聯(lián)合突變中516、511、526位點(diǎn)出現(xiàn)頻率最高，分別為120、109和87次。聯(lián)合突變中Thr508Pro、Ser509Gly、Ser512Gly、Met515Trp等突變形式在單位點(diǎn)突變中未見報(bào)道。插入突變發(fā)生在514和515位點(diǎn)，插入密碼子為TTC (Phe)。堿基缺失突變發(fā)生在509～526位點(diǎn)，其中有1株在526位點(diǎn)發(fā)生1堿基(bp)缺失，5株在512、516、517及518區(qū)域發(fā)生3堿基(bp)缺失，1株在514～515區(qū)域發(fā)生6堿基(bp)缺失，2株在509～511、513～515位點(diǎn)發(fā)生9堿基(bp)缺失，1株在516～520區(qū)域發(fā)生15堿基(bp)缺失。結(jié)核分枝桿菌耐藥水平與耐藥基因不同的突變位點(diǎn)有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)513位點(diǎn)、G523A、H526D, H526R,H526Y,H526F、H526Q、S531L、S531F及單個(gè)密碼子內(nèi)雙堿基突變與利福平高水平耐藥有關(guān)，而在511、514、516、518、521、522和533等位點(diǎn)突變與低水平耐藥有關(guān)[4，22-24]。研究發(fā)現(xiàn)約6.6%耐利福平菌株未發(fā)生RRDR區(qū)域內(nèi)基因突變[17-21]，而少數(shù)敏感菌株(1.7%)出現(xiàn)RRDR內(nèi)突變[25]，提示并非所有RRDR內(nèi)突變均與耐藥有關(guān)，已發(fā)現(xiàn)508、509位點(diǎn)突變與結(jié)核分枝桿菌耐利福平無關(guān)[24]。RRDR序列外基因突變統(tǒng)計(jì)[21，26]發(fā)現(xiàn)，在1 041株利福平耐藥菌株中，有124株(11.9%)菌株在RRDR外發(fā)生錯(cuò)義基因突變，共94種突變類型；有25株獨(dú)立發(fā)生RRDR外位點(diǎn)突變，共19種突變類型，總突變率為2.4%，占RRDR外突變的15.3%。這些RRDR外突變包括單位點(diǎn)突變Val146Phe、Val176Phe、Pro206Arg、Glu247Gln、Val251Ala、Val251Phe、Val251Leu、Gln253Leu、Tyr314Cys、His323Tyr、IIe572Phe、IIe572Thr、Asp626Glu、Asp657His和Lys891Thr；雙位點(diǎn)突變Val146Phe/ Pro402Ser、Ser311Leu/Leu60Arg、Ser311Leu/Val112Ala及三位點(diǎn)突變Gln139Lys/Gly201Cys/Lys167Arg。有99株發(fā)生與RRDR內(nèi)共同突變，總突變率為9.5%，占RRDR外突變的80.0%，主要以雙位點(diǎn)突變(89株)為主。在所有結(jié)核分枝桿菌耐利福平菌株中約2.4%菌株獨(dú)立發(fā)生RRDR外序列基因突變，提示RRDR區(qū)外突變雖以其極低的突變率存在但仍有不可小覷的作用。研究發(fā)現(xiàn)146、572和626位點(diǎn)突變與利福平耐藥有關(guān)，且146位點(diǎn)發(fā)生的突變可能與利福平低水平耐藥有關(guān)[27-29]。RRDR外基因突變也可能為利福平耐藥補(bǔ)償基因[29]。在泰國曼谷的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，155株MDR菌株全部發(fā)生常見耐藥突變S531L及RRDR區(qū)外不常見突變L812P[30]，提示L812P可能作為S531L的補(bǔ)償基因是大型社區(qū)爆發(fā)菌株傳播的補(bǔ)充效應(yīng)，同時(shí)S531L及L812P聯(lián)合突變可能與社區(qū)內(nèi)MDR菌株持續(xù)性傳播有關(guān)。

1.2 rpoC基因rpoC全長3 951 bp(Gene ID：888177)，編碼RNA聚合酶β'亞基[4]。β及β'亞基在α亞基處結(jié)合并形成形似蟹的兩個(gè)鉗子，鉗子間形成包含有催化活性并容納核酸轉(zhuǎn)錄的間隙(稱為主通道活性區(qū)域)，β'亞基使核酸在活性中心內(nèi)更加牢固并穩(wěn)定延長復(fù)合物[31]。研究發(fā)現(xiàn)rpoA或rpoC基因突變?cè)趤碜园戏俏鏖_普省、非洲西部加納、非洲東部烏干達(dá)、葡萄牙里斯本、瑞典烏普薩拉、俄羅斯等國家的耐利福平菌株十分常見，并且約90%的突變位于rpoC基因[2，32-37]。據(jù)統(tǒng)計(jì)目前已發(fā)現(xiàn)的rpoC基因突變位點(diǎn)超過63個(gè)，突變形式超過85個(gè)，包括G332R、V483G、V483A、N698S、K1152Q等[2，32-38]，暫未發(fā)現(xiàn)堿基缺失及插入突變。在中國北方耐利福平菌株中最常見的突變位點(diǎn)是483 (33.7%)和491(14.4%)[2]。但并非所有的rpoA或rpoC基因突變均代表補(bǔ)償基因，一些rpoC基因的突變是系譜特異性標(biāo)志，如A542A和G594E分別是拉丁美洲地中海譜系和哈勒姆(Haarlem)譜系的標(biāo)志[2]。在利福平敏感菌株中發(fā)現(xiàn)T721C突變，提示此突變不是利福平耐藥性標(biāo)志[2]。多項(xiàng)研究表明rpoC作為rpoB中耐藥基因突變(主要是rpoB S531 L)的補(bǔ)償突變，能促進(jìn)一些臨床耐藥菌株恢復(fù)適應(yīng)性，使耐藥菌株存活更久并增強(qiáng)菌株傳播能力[33，35，37]。

1.3 rpoA基因rpoA全長1 044 bp(Gene ID:887 629)，編碼RNA聚合酶α亞基[4]。α亞基(分為αI和αII亞基)位于ββ'亞基結(jié)合處，α亞基N-端負(fù)責(zé)裝配ββ'亞基，C-端與各種轉(zhuǎn)錄激活因子以及DNA序列啟動(dòng)子相互作用[31]。目前已發(fā)現(xiàn)的rpoA基因突變形式有：G31S、G31A、D57N、V59A、T63T、S165I、K177M、T181A、V183G、E184D、T187A、T187P、A189E、D190G、R191L、V192A、V192G、T196P、T196A、T196S、D199G、L304R、S307L和E319K[2，34-37]。rpoA同為rpoB補(bǔ)償基因，在耐藥結(jié)核分枝桿菌中作用與rpoC類似[33，35]。

1.4 rpoZ基因rpoZ全長333 bp(Gene ID: 886754)，編碼RNA聚合酶中最小的ω亞基[5]。ω亞基是RNA聚合酶活性和細(xì)胞生存中非必需的，但其在結(jié)構(gòu)上包繞β'亞基C-端尾部有保護(hù)及幫助β'亞基折疊的作用，協(xié)助RNA聚合酶組裝并增加RNA聚合酶穩(wěn)定性的作用[5，31，39]。研究表明rpoZ基因突變對(duì)分枝桿菌生物膜造成損害[5]，但其在結(jié)核分枝桿菌耐利福平機(jī)制中的作用尚不明確。目前暫未見rpoZ基因突變報(bào)道。雖然結(jié)核分枝桿菌耐利福平主要與rpoB基因突變有關(guān)，但到目前為止約3.8%的耐利福平菌株沒有檢測(cè)到rpoB基因突變[29]，提示結(jié)核分枝桿菌耐利福平尚存在其他機(jī)制。

2 藥物外排泵機(jī)制

越來越多的研究證明結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞對(duì)藥物的主動(dòng)排出是耐藥的關(guān)鍵因素，在沒有rpoB基因突變情況下，結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平耐藥可能由外排泵導(dǎo)致[40-41]。外排泵為胞膜蛋白，當(dāng)其過度表達(dá)時(shí)會(huì)將結(jié)核分枝桿菌內(nèi)藥物過多泵出菌體外，使菌體內(nèi)抗結(jié)核藥物濃度降低導(dǎo)致殺菌作用減弱從而產(chǎn)生耐藥[41-42]。五個(gè)家族的外排泵與藥物耐藥有關(guān)：ATP結(jié)合盒(ABC)超家族，主要異化子超家族(MFS)，耐藥結(jié)節(jié)分化(RND)超家族，多藥和毒性化合物外排(MATE)家族及小多重藥耐藥(SMR)家族[42]。目前發(fā)現(xiàn)與利福平可能相關(guān)的外排泵有Rv1410c、Rv1258c、Rv1819c、Rv2333、Rv2846c、Rv2936、Rv2937、Rv2938、Rv3239c、Rv3728、Rv0783、Rv0842、Rv0933，其中屬于ABC家族的特異性利福平外排泵Rv2936以及屬于MFS家族的Rv1258c、Rv1410c和Rv0783被認(rèn)為與利福平低濃度耐藥有關(guān)[40，43-44]。

3 細(xì)胞通透性改變

細(xì)胞壁通透性變化是除靶基因突變外結(jié)核分枝桿菌株利福平耐藥的另一主要原因。結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁外膜滲透性極低，這一生理特性保護(hù)其免受有毒化合物影響，對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的毒性和致病性以及其在體內(nèi)嚴(yán)峻環(huán)境下生存是必需的。細(xì)胞壁通透性降低將減少菌體內(nèi)抗結(jié)核藥物的濃度導(dǎo)致耐藥。近年來有研究表明減少結(jié)核分枝桿菌外膜通道蛋白CpnT介導(dǎo)的外膜通透性可能導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌耐藥[45]，編碼孔蛋白的MspA基因突變引起的孔蛋白丟失可能導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)鏈霉素耐藥[46]，分枝桿菌的MspA基因缺失與利福平耐藥有關(guān)[47]。但與結(jié)核分枝桿菌耐利福平的相關(guān)通道蛋白及具體機(jī)制目前尚不清楚。

4 其他機(jī)制

與外排、轉(zhuǎn)運(yùn)和毒力相關(guān)的基因簇Rv0559c(參與細(xì)胞壁和細(xì)胞過程)、Rv0560c(編碼參與中間代謝和呼吸的蛋白)在結(jié)核分枝桿菌耐利福平中起關(guān)鍵作用，但具體促發(fā)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[48]。Zheng等[49]認(rèn)為野生型與耐藥型菌株的混合感染是無rpoB基因突變耐利福平菌株的可能耐藥機(jī)制，并提出摩奴2(Manu2)譜系菌株作為混合感染中的主要群體，有協(xié)助或影響宿主免疫應(yīng)答導(dǎo)致混合感染的能力，由其引起的混合感染是沒有任何rpoB基因突變的耐利福平菌株的可能耐藥機(jī)制。但混合感染可能引起GeneXpert等檢測(cè)方法的敏感性降低，導(dǎo)致耐利福平菌株突變可能被DNA測(cè)序錯(cuò)過[50]。

綜上所述，結(jié)核分枝桿菌耐利福平機(jī)制包括藥物作用靶基因突變、外排泵機(jī)制、細(xì)胞壁通透性變化等，其中靶基因突變，尤其是編碼RNA聚合酶β亞基的rpoB基因突變是其主要耐藥機(jī)制。相關(guān)基因中rpoA、rpoC作為補(bǔ)償基因，主要作用為增強(qiáng)耐藥菌株傳播能力。但目前仍有部分利福平耐藥機(jī)制尚不完全清楚。了解已知的利福平耐藥機(jī)制，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)新的耐利福平相關(guān)基因及其耐藥機(jī)制，能為耐藥結(jié)核病的早期診治及控制奠定理論和臨床實(shí)踐的基礎(chǔ)。

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Mechanism of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis and its research progress.

XIANG Min,ZHANG Hong,CHEN Ling.Respiratory DepartmentⅡ,Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi 563003,Guizhou,CHINA

Tuberculosis is a global public health problem that seriously endanger public health,and the spread of drug-resistant tuberculosis,especially multidrug-resistant tuberculosis(MDR-TB),makes tuberculosis more severe. Rifampicin is one of the important first-line anti-tuberculosis drugs and serves as an alternative marker for MDR-TB. Therefore,understanding the mechanism of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis is of great significance to the prevention and control of drug-resistant tuberculosis.In this paper,the mechanism of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis and its research progress is reviewed.

Mycobacterium tuberculosis;Rifampicin;Drug resistance;Mechanism

R378.91+1

A

1003—6350（2017）17—2853—04

2017-03-12)

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.17.031

國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81360002）通訊作者：陳玲。E-mail：lingjuncd@163.com