何 強，張 穎(綜述)，任秀敏(審校)

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北 石家莊 050000)

·綜述·

氨基糖苷類藥物耳毒性機制研究

何 強，張 穎(綜述)，任秀敏(審校)

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院耳鼻咽喉科，河北 石家莊 050000)

氨基糖苷類；藥物毒性；藥理作用分子作用機制

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.12.031

自氨基糖苷類抗生素(aminoglycoside antibiotic,AmAn)廣泛應用于臨床以來，由AmAn致聾的病例時有發(fā)生。AmAn是化學結(jié)構(gòu)中含有氨基糖分子的一類抗生素，較主要的有鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素和新霉素等。AmAn主要作用于革蘭陰性菌，抗菌作用原理是阻礙細菌蛋白質(zhì)的生物合成。這類藥物可能會對腎臟、前庭和耳蝸造成不同程度的損傷[1]。近年來，對AmAn的耳蝸毒性機制[2]進行了深入細致的研究，形成了許多種學說，但這些學說并不能完全解釋這類藥物耳毒性的機制，隨著科學技術(shù)的進步，從分子水平上對AmAn耳毒性機制的研究進一步深入，取得了一定的突破，并在藥物治療AmAn所致耳蝸毒性和預防耳蝸損傷上有所進展,現(xiàn)綜述如下。

1 氧自由基與氨基糖苷類藥物耳毒性

1.1耳蝸氧自由基形成 自由基是指帶有不成對電子的分子、原子、原子團或離子。氧自由基是生物體內(nèi)有氧代謝產(chǎn)生的含氧的自由基，包括羥自由基OH、超氧陰離子O2-、烷氧自由基RO及烷過氧自由基等。對氧自由基檢測可采用電子順磁共振法。氧自由基對生物大分子具有很強的損傷作用，可造成細胞的多種功能紊亂，特別是可引發(fā)線粒體損傷。氧的利用率高，是氧自由基的一個重要來源。耳蝸線粒體的DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)可編碼呼吸鏈細胞色素b，細胞色素c氧化酶亞單位CoⅠ、CoⅡ、CoⅢ，ATP合成酶6，ATP合成酶8。mtDNA損傷常造成這些酶的活性部分或全部喪失[2]，而這些酶是線粒體呼吸鏈的重要組分，活性喪失使呼吸鏈氧化磷酸化功能出現(xiàn)異常，線粒體電子漏增多，從而改變了電子載體的氧化還原電位，O2-和OH自由基明顯增多。有研究報道，AmAn在耳蝸毛細胞積累的主要部位是線粒體，可刺激氧自由基產(chǎn)生[3]。推測是AmAn可與鐵通過鐵-AmAn復合物的形成[4]，誘發(fā)谷氨酸興奮毒性作用[5-6]和細胞內(nèi)游離Ca2+增多[7]的原因。

1.2耳蝸內(nèi)的抗氧化系統(tǒng) 在耳蝸的細胞中存在著各種各樣的氧自由基清除劑，如維生素C、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)等。耳蝸的抗氧化防御系統(tǒng)主要存在于Corti′s器和血管紋[7]。SOD是一種金屬酶，可分為CuZn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD 3種。已有研究發(fā)現(xiàn)在耳蝸中也有SOD的分布[8]，而且它在耳蝸內(nèi)的活性較強，由于金屬離子的存在，使超氧陰離子更易接近SOD的活性中心，發(fā)生催化反應，達到清除O2-自由基的目的。GSH是細胞內(nèi)另外一種重要的抗氧化劑，為氧化還原反應提供了大量的還原力。GSH的濃度在血管紋的基底細胞和中間細胞內(nèi)尤為豐富，在內(nèi)外毛細胞和支持細胞內(nèi)有少量存在。而且發(fā)現(xiàn)在耳蝸聽神經(jīng)上皮、聽神經(jīng)、外壁組織和血管組織也有GSH和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的表達。

1.3氧自由基與氨基糖苷類藥物耳毒性 Park等[9]用慶大霉素氧化花生四烯酸的實驗來測定其誘發(fā)生成氧自由基的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)慶大霉素單獨在0.05～10 mmol/L范圍內(nèi)，并不能使花生四烯酸形成過氧化脂質(zhì)，而在存在鐵鹽的條件下可生成氧自由基。慶大霉素是一個鐵離子的螯合劑，鐵離子-慶大霉素復合物的生成是氧自由基產(chǎn)生的催化劑。Zholudeva等[10]用去鐵胺和新霉素同時給豚鼠注射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鐵離子螯合劑去鐵胺可明顯拮抗新霉素的耳毒性。Park等[9]的進一步研究表明，2，3-二羥基苯甲酸鹽與甘露醇的聯(lián)合使用在聽功能及形態(tài)學指標上可以完全拮抗慶大霉素的耳毒性，氧自由基清除劑和鐵離子螯合劑的合用對于慶大霉素血藥濃度及其抗菌活性均不影響。當慶大霉素達一定劑量后，慶大霉素會導致耳蝸氧自由基的產(chǎn)生大大超過耳蝸組織的抗氧化能力，使聽覺系統(tǒng)發(fā)生進行性損害。所以，慶大霉素的耳毒性作用要有一個級聯(lián)激活過程，這種激活經(jīng)過一個氧化還原反應，即鐵與慶大霉素復合物的形成，可在體外促發(fā)氧自由基的產(chǎn)生。慶大霉素與多磷酸肌醇的親和力也與其耳毒性密切相關(guān)。在機體內(nèi)耳和腎組織中的多磷酸肌醇的含量相對較高，易使慶大霉素與磷脂結(jié)合而中毒。而在pH值適合的細胞溶酶體內(nèi)，聚DL-天冬氨酸的濃度足夠時其可從磷脂中置換出慶大霉素，從而可延緩溶酶體磷脂沉積病態(tài)發(fā)展，抑制溶酶體因為超負荷而破裂使細胞壞死的一系列中毒過程的發(fā)生，能起到一定的拮抗作用。水楊酸即鄰羥基苯甲酸，可與氧自由基反應生成2,3-二羥基苯甲酸,這是慶大霉素耳毒性的拮抗劑。所以，水楊酸可通過直接和間接的雙重作用清除慶大霉素誘發(fā)產(chǎn)生的氧自由基,而且作用部位準確。另外的實驗研究表明， 川芎嗪也可有效減輕慶大霉素耳毒性損傷[11]，且與川芎嗪具有抗氧化作用有關(guān)，對離體鼠耳蝸神經(jīng)組織分析，得出其為慶大霉素耳毒性拮抗劑[12-13]，但尚不明確其確切的抗氧化機制。

2 細胞凋亡與氨基糖苷類藥物耳毒性

2.1細胞凋亡的分子機制 細胞凋亡亦稱程序性細胞死亡，是生理狀態(tài)下發(fā)生的細胞自殺過程，在機體中具有重要的生物學意義。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，各種研究表明特異性蛋白酶的酶學變化是細胞死亡機制的核心成分，從分子水平看凋亡實質(zhì)上是蛋白酶一系列級聯(lián)切割的過程，故抑制蛋白酶活性的因素也就可以抑制凋亡的發(fā)生。細胞凋亡是一個很復雜的生理和病理過程，很多因素均可影響細胞凋亡的發(fā)生。某些因素可特異性地誘導某種或某類細胞發(fā)生凋亡，如某些生長因子依賴性細胞，當撤除生長因子時則發(fā)生凋亡；而某些基因的表達產(chǎn)物對細胞凋亡具有明顯的促進或抑制作用。細胞凋亡的激發(fā)和抑制是受遺傳因素影響的，有多種基因參與了細胞凋亡的調(diào)節(jié)控制。而在細胞凋亡中，并非存在一成不變的代謝途徑。細胞凋亡對細胞增殖、器官發(fā)生、器官自身平衡的維持有重要意義，是很重要的細胞分子生物學事件。

2.2耳蝸細胞凋亡與氨基糖苷類藥物 損傷聽力的各種因素，一般均會造成耳蝸毛細胞的損傷，大量毛細胞的急性損傷會破壞感覺上皮結(jié)構(gòu)的完整性，這將對毛細胞損傷后的修復造成很大的影響[14]。細胞凋亡是一個重要過程,其對內(nèi)耳的正常發(fā)育以及去除氧化應激所致的感覺細胞損傷同等重要。AmAn對耳蝸的損傷與耳蝸老化的病理改變很相似。AmAn損傷耳蝸感覺上皮，損傷毛細胞的胞體在上皮內(nèi)變性，即發(fā)生細胞凋亡，這一過程表明毛細胞對組織損傷過程的自我控制和自我保護，與感覺上皮損傷后的修復過程有重要聯(lián)系。

3 一氧化氮(nitric oxide,NO)與氨基糖苷類藥物耳毒性

3.1NO的性質(zhì)及生物合成 NO是一種無機小分子化合物，在很早就為人們所熟知。近年來對NO的生物學作用取得進一步認識，NO有第二信使和神經(jīng)遞質(zhì)的功能，故它是一種細胞信息傳遞的重要載體，廣泛參與了各種生理功能的調(diào)節(jié)。NO的化學性質(zhì)極不穩(wěn)定，半衰期很短，僅為5 s左右，而且可被血紅蛋白、氧自由基、氫醌等迅速滅活。NO極易與氧發(fā)生反應生成NO2-，之后在中性體液中迅速轉(zhuǎn)化為NO3-而喪失其生物學活性，這可能是NO失活的生理機制。上世紀80年代研究發(fā)現(xiàn)了硝酸甘油類的擴血管作用來源于其活性代謝產(chǎn)物NO，后又證實中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在NO作用。

3.2一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)的催化作用 NOS是NO生物合成的關(guān)鍵因素，一般NOS可分成神經(jīng)元型內(nèi)皮型一氧化碳合成酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、神經(jīng)型一氧化氮合酶(nerves of nitric oxide synthase,nNOS)和誘生型一氧化氮合酶(induce nitric oxide synthase，iNOS)。其中nNOS和eNOS依賴于Ca2+/CaM(鈣蛋白)，不受內(nèi)毒素等誘導，統(tǒng)稱為原生型酶( constitutive nitric oxide synthase,cNOS)，而iNOS不依賴于Ca2+/CaM，可由內(nèi)毒素等誘導產(chǎn)生。為闡明NOS的催化過程和調(diào)節(jié)因子，利用雙重聚合酶鏈反應技術(shù)，證明了NOS具有催化L-精氨酸合成NO的活性。NOS蛋白質(zhì)上有潛在磷酸化位點，因此酶的磷酸化必然影響酶的活力。蛋白激酶A、蛋白激酶G、蛋白激酶Ⅱ、磷酯酶C和磷酯酶A2均參加了NOS的調(diào)節(jié)過程，有的使酶活力增加，有的使酶活力降低。而且，控制mRNA半衰期是許多因子影響NOS基因表達的共同途徑。

3.3NO的生物學作用 NO具有強大的松弛血管平滑肌作用、抑制血小板聚集、神經(jīng)傳導功能、免疫功能及細胞毒性等。NO的細胞毒性作用是非特異性宿主防御反應的組成部分。人體免疫系統(tǒng)的重要成員成纖維細胞、巨噬細胞均可釋放內(nèi)源性NO殺死外來的病原體。另外，NO也在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮細胞間信息傳遞的作用。在腦細胞中，NO的小量釋放可作為信號分子傳遞信息，而大量釋放時可殺死腦細胞。從耳蝸鼓階灌注NO供體硝普鈉會產(chǎn)生聽力損失及耳蝸毛細胞和支持細胞的嚴重損傷[15-16]。

3.4NO與氨基糖苷類藥物耳毒性 Takumida等[17]發(fā)現(xiàn)豚鼠螺旋器感覺細胞受到AmAn刺激時會表達iNOS，生成大量的NO，也同時產(chǎn)生大量活性氧，二者對細胞均有破壞作用，而且NO與活性氧發(fā)生反應可生成氮的過氧化物，它對細胞也有較強的毒性作用。Inai等[18]證實經(jīng)靜脈給予NOS競爭性抑制劑或NOS的天然底物L-精氨酸，則能降低或提高耳蝸血流。Takumida等[17,19]給豚鼠聽泡內(nèi)注射慶大霉素或生理鹽水，即分為實驗組和對照組，豚鼠的螺旋器和前庭終器的iNOS采用免疫組織化學的方法檢測，豚鼠聽泡內(nèi)先注射N-硝基-L-甲基-精氨酸(即NOS的拮抗劑)和ebselen (氮的過氧化物清除劑)，再給予慶大霉素，形態(tài)學結(jié)果顯示，暴露于慶大霉素的豚鼠螺旋器和前庭器的感覺細胞結(jié)構(gòu)遭到嚴重破壞，但經(jīng)N-硝基-L-甲基-精氨酸及ebselen預處理的豚鼠感覺細胞破壞程度較前者輕。

4 耳蝸微循環(huán)與氨基糖苷類藥物耳毒性

4.1內(nèi)皮舒張因子與耳蝸微循環(huán) 內(nèi)皮依賴性舒張因子是由血管內(nèi)皮細胞利用L-精氨酸合成的內(nèi)源性硝基血管擴張劑,它的實質(zhì)為NO[20]。在基礎(chǔ)狀態(tài)下,血管內(nèi)皮細胞持續(xù)釋放NO,有舒張血管、抗血小板和粒細胞黏附、聚集等作用。如NO合成及作用障礙，較易致血管收縮和形成血栓，導致微循環(huán)障礙。內(nèi)耳微循環(huán)非常特殊，與其他臟器微循環(huán)具有不同的解剖結(jié)構(gòu)，因而具有不同的剪切應力。耳蝸的彈簧樣結(jié)構(gòu)使其血管受到血液流動的切變應力降低，這是促使內(nèi)皮依賴性舒張因子釋放的因素之一。其次在內(nèi)耳血管壁內(nèi)皮細胞中含有大量的內(nèi)皮依賴性舒張因子合成酶，該部位有合成更多內(nèi)皮依賴性舒張因子的生理基礎(chǔ)。

4.2血管紋黑色素與氨基糖苷類藥物 研究表明，在人和雜色動物的內(nèi)耳中分布有黑色素，AmAn作用于內(nèi)耳后黑色素含量明顯增加,證明黑色素與AmAn耳毒性有關(guān)[21]。AmAn作用于內(nèi)耳后，血管紋細胞出現(xiàn)變性改變，如線粒體嵴斷裂并腫脹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張等，不過黑素體結(jié)構(gòu)并無明顯改變，但中間細胞內(nèi)的黑素體數(shù)目明顯增多。AmAn的耳毒性與其誘導耳蝸產(chǎn)生自由基有關(guān)，黑色素是一種穩(wěn)定的自由基捕獲劑，可防止自由基的損害作用，如自由基造成的細胞DNA鏈斷裂、堿基破壞以及形成DNA-蛋白變聯(lián)等。通過以上作用，黑色素可減輕AmAn類藥物的耳毒性作用。

5 能量代謝與氨基糖苷類藥物

耳蝸細胞的正常生理功能有賴于能量的充足供應和細胞內(nèi)能量代謝的正常進行。三羧酸循環(huán)在細胞能量代謝中非常重要，而以琥珀酸脫氫酶和乳酸脫氨酶為指標，可了解AmAn對糖有氧氧化和糖酵解的作用。實驗證明，AmAn可使琥珀酸脫氫酶的活性受到明顯抑制，細胞能量代謝降低，細胞的能量供應下降[22]，開始表現(xiàn)為毛細胞功能障礙，后出現(xiàn)毛細胞結(jié)構(gòu)改變。同時，毛細胞內(nèi)乳酸脫氫酶活性也明顯被抑制，該酶活性被抑制的程度以基底周外毛細胞顯著，與毛細胞的病理損害過程一致。AmAn中毒后干擾和降低了毛細胞的糖酵解過程，進一步加重了能量供給的不足，使毛細胞內(nèi)能量代謝出現(xiàn)紊亂。

6 Ca2+與氨基糖苷類藥物

近年來對Ca2+的研究表明，Ca2+的生理學功能很重要而且很復雜[7]。Ca2+在細胞膜上是以磷酸肌醇酯和蛋白質(zhì)相結(jié)合的狀態(tài)存在。AmAn與毛細胞接觸首先是與其細胞膜上的磷酸肌醇酯相結(jié)合，而當AmAn濃度在一定比例關(guān)系時AmAn和Ca2+可以競爭性地與磷酸肌醇酯相結(jié)合，也即二者有競爭抑制作用。當AmAn與磷酸肌醇酯結(jié)合以后，可以使Ca2+釋放出來，這樣可以改變細胞膜上的離子通道，導致細胞的死亡。

7 鐵離子與氨基糖苷類藥物

Ezraty等[5]提出慶大霉素耳毒性可能是由于慶大霉素在體內(nèi)形成慶大霉素-鐵復合物，這個復合物的生成可催化產(chǎn)生自由基而損傷毛細胞。鐵螯合劑甲磺酸去鐵胺可與鐵離子或三價鋁離子形成復合物，形成的復合物通過膽汁和尿液可完全排泄，從而可減少鐵或鋁在器官的病理性沉積。Polony等[4]實驗證實，應用甲磺酸去鐵胺組聽反應閾在實驗過程中保持穩(wěn)定，表明其安全而無毒性；慶大霉素+甲磺酸去鐵胺組聽反應閾平均較慶大霉素組明顯降低，耳蝸毛細胞形態(tài)學損傷與聽反應閾升高的程度相平行。鐵離子提供電子產(chǎn)生羥自由基，是機體內(nèi)的氧自由基由酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)產(chǎn)生某些復合物催化的Haber-Weiss反應的重要環(huán)節(jié)。

8 氨基糖苷類藥物耳毒性的防治進展

AmAn造成耳中毒過程中，自由基的作用非常重要，應用自由基清除劑可拮抗AmAn耳毒性。聚天冬氨酸對慶大霉素所致耳蝸組織自由基的產(chǎn)生有抑制作用，并且隨著用藥時間的延長這種抑制作用越來越明顯，提示聚天冬氨酸對慶大霉素耳毒性拮抗作用與聚天冬氨酸抑制慶大霉素致耳蝸組織自由基的產(chǎn)生密切相關(guān)。近期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)耳毛細胞突觸可能是氨基苷類藥物耳毒性的作用靶點，為經(jīng)典的耳聾發(fā)病機制的研究和干預策略的制定提供了更新的思路[23-24]。由于NO與AmAn耳毒性的密切關(guān)系，可應用NO拮抗劑治療和預防AmAn耳毒性。在應用藥物治療中，要注意體內(nèi)NO的水平，在保證其生理作用的前提下，適量減少NO的濃度。聯(lián)合使用利尿劑等藥物以進一步增強藥物的耳毒性，因而這種誘導條件下，產(chǎn)生的耳蝸損害常十分嚴重[25]。N-硝基-L-甲基-精氨酸作為一種NOS的競爭性抑制劑可抑制AmAn的耳毒性，作用機制有待進一步研究。同時，鐵離子螯合劑甲磺酸去鐵胺等抗氧化劑也有拮抗AmAn耳毒性的作用。水楊酸制劑可以在安全范圍內(nèi)有效預防AmAn耳毒性作用。川芎嗪等中藥有活血化瘀、改善內(nèi)耳微循環(huán)等作用，同時作為氧自由基的清除劑，通過對超氧陰離子的清除阻止了細胞脂質(zhì)過氧化，在預防和治療AmAn耳毒性中起一定作用?；蛑委熓峭ㄟ^直接抑制有害基因的表達,或者通過過表達和插入缺失或下調(diào)的基因,直接在靶細胞進行基因操作[26-27]。12S rRNA是線粒體的一個熱點突變，近年的研究發(fā)現(xiàn)很多與氨基糖苷類抗生素耳毒性相關(guān)的12S rRNA突變位點[28-31]，因而基因治療在氨基糖甙類藥物耳毒性的防治中顯示出明顯的應用前景。

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2017-06-16；

2017-08-07

河北省醫(yī)學科學研究重點課題(20170085)

何強(1968-)，男，北京人，河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事耳疾病基礎(chǔ)與臨床研究。

R978.12

A

1007-3205(2017)12-1484-05

許卓文)