王 娜，李澎濤，邢 鵬，殷晨星

(河北省保定市婦幼保健院生殖中心，河北 保定 071000)

·論著·

短時受精失敗或低受精率周期不同受精來源卵母細(xì)胞發(fā)育潛能比較

王 娜，李澎濤，邢 鵬，殷晨星

(河北省保定市婦幼保健院生殖中心，河北 保定 071000)

目的評估常規(guī)體外受精(in vitro fertilization，IVF)受精失敗或低受精率周期中自然受精卵母細(xì)胞與補(bǔ)救受精卵母細(xì)胞受精后發(fā)育潛能及預(yù)后。方法對短時受精失敗或低受精率的117個周期不孕癥患者資料進(jìn)行回顧分析，比較自然受精卵母細(xì)胞(A組)與補(bǔ)救受精卵母細(xì)胞(B組)受精后的異常受精率、2PN卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、胚胎利用率、著床率、妊娠率及多胎妊娠率。結(jié)果A組優(yōu)質(zhì)胚胎率高于B組(P<0.05)；2組異常受精率、2PN卵裂率、囊胚形成率、胚胎利用率、著床率、妊娠率、多胎妊娠率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論對常規(guī)IVF短時受精失敗或低受精率卵母細(xì)胞進(jìn)行早補(bǔ)救卵胞漿內(nèi)單精子注射可獲得與自然受精卵母細(xì)胞相似的發(fā)育潛能及臨床結(jié)局。

體外受精；胚胎移植；卵母細(xì)胞

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.12.026

體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF-ET) 技術(shù)為眾多不孕不育夫婦提供了一個新的、有效的治療方法，與IVF相比短時受精可以明顯提高臨床妊娠率及胚胎種植率[1]，目前國外報道有10%～20%IVF周期受精完全失敗或受精率<20%[2]，國內(nèi)報道為3%～5%[3]。多種原因可以造成受精失敗，男性生育能力下降，精卵結(jié)合能力降低或完全障礙是造成受精失敗的首要原因；精卵結(jié)合障礙導(dǎo)致受精失敗的另一重要原因是卵母細(xì)胞透明帶表面缺乏精子受體[4]。在短時受精聯(lián)合早補(bǔ)救卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技術(shù)之前，晚補(bǔ)救即D1補(bǔ)救ICSI的受精率、妊娠率均很低，尤其抱嬰回家率低。將補(bǔ)救ICSI的時間提前至加精后6 h，通過觀察第二極體(2PB)是否釋放判斷受精，可明顯提高卵子受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及患者妊娠率。為比較短時受精失敗或低受精率周期不同受精來源卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能，本研究回顧分析行短時受精失敗或受精率低于30%的低受精率周期，比較不同受精途徑的胚胎繼續(xù)發(fā)育的卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、胚胎著床率及胚胎移植后的臨床結(jié)局。報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選擇2013年3月—2016年5月我院生殖中心短時受精完全失敗或低受精率117個周期所獲卵1 438枚，1 103枚成熟卵母細(xì)胞，252枚卵子自然受精(自然受精卵母細(xì)胞組，A組)，972枚卵子進(jìn)行早補(bǔ)救ICSI受精738枚(補(bǔ)救受精卵母細(xì)胞組，B組)。A組女方年齡(31.38±3.94)歲，B組女方年齡(29.67±4.00)歲。男方精液處理后前向運(yùn)動精子總數(shù)≥1×106條，女方基礎(chǔ)促卵泡激素<12 U/L。

1.2方法 卵子來源：女方采用常規(guī)長方案、短方案或超長方案降調(diào), 重組人促卵泡生成素促卵泡生長。依據(jù)陰道B超和血激素值監(jiān)測卵泡生長。當(dāng)有4個以上>18 mm 卵泡時給予絨毛膜促性腺激素10 000 U，36 h 在超聲引導(dǎo)下取卵。精子來源：男方禁欲3～7 d手淫取精，采用密度梯度-上游法收集精子。精卵共培養(yǎng)：獲卵3.5 h后采用群受精法授精，受精濃度為10～30萬/mL。精卵共孵育4 h，觀察2PB釋放。當(dāng)2PB卵母細(xì)胞數(shù)為0判斷為受精失??；當(dāng)2PB卵母細(xì)胞數(shù)小于成熟卵母細(xì)胞總數(shù)的30%，需延長受精觀察時間至加精后6 h，如仍未達(dá)到30%，判斷為低受精率，即刻行補(bǔ)救性ICSI。補(bǔ)救受精后18 h觀察原核。

胚胎評級：IVF第3天卵裂期胚胎評級，胚胎評級標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 胚胎評級標(biāo)準(zhǔn)

胚胎選擇：選擇可移植及可冷凍胚胎，優(yōu)先選擇優(yōu)質(zhì)胚胎移植，剩余優(yōu)質(zhì)胚胎冷凍保存，非優(yōu)質(zhì)胚胎繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，選擇可冷凍的囊胚玻璃化冷凍保存。判斷妊娠：胚胎移植后14 d檢測血絨毛膜促性腺激素，移植后30 d陰道B超見宮內(nèi)孕囊診斷為臨床妊娠。

1.3觀察指標(biāo) 異常受精率=(1PN數(shù)+3PN數(shù))/獲MⅡ卵總數(shù)(1PN：一原核；3PN：三原核；MⅡ卵：無核，一個極體的卵母細(xì)胞)。2PN卵裂率=2PN卵裂總數(shù)/2PN數(shù)(2PN：二原核)。優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN卵裂數(shù)。囊胚形成率=囊胚數(shù)/囊胚培養(yǎng)數(shù)。胚胎利用率=冷凍胚胎數(shù)+移植胚胎數(shù)/卵裂胚胎總數(shù)。著床率=胎囊數(shù)(胚胎著床數(shù))/移植胚胎總數(shù)。妊娠率=妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)。多胎妊娠率=多胎妊娠周期數(shù)/妊娠周期數(shù)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

A組優(yōu)質(zhì)胚胎率高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2組異常受精率、2PN卵裂率、囊胚形成率、胚胎利用率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1，2。

表1 2組觀察指標(biāo)結(jié)果比較 (%，胚胎數(shù))

表2 2組胚胎移植后結(jié)局比較 (%，周期數(shù))

3 討 論

IVF-ET是指將同一不孕不育夫婦的卵子和精子取出體外在實(shí)驗(yàn)室的體外培養(yǎng)體系中使其自然結(jié)合、受精形成胚胎，并將胚胎移植到女性子宮內(nèi)以實(shí)現(xiàn)妊娠的技術(shù)[5]。1978 年世界首例試管嬰兒誕生，自此IVF技術(shù)經(jīng)歷了30多年的發(fā)展，仍不可避免受精失敗這一難題[6]。IVF技術(shù)中，受精率直接影響后續(xù)臨床妊娠結(jié)局，而影響受精率的因素很多[7]，因?yàn)槭芫莻€紛繁復(fù)雜的過程，不僅包括精子的獲能、精子穿過卵丘細(xì)胞和放射冠，而且還包括精子與卵母細(xì)胞透明帶結(jié)合進(jìn)而引發(fā)頂體反應(yīng)、精子與卵母細(xì)胞融合、卵母細(xì)胞激活、雌雄原核形成等過程[8]，受精過程中任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生障礙均可能導(dǎo)致受精失敗。

目前在常規(guī)IVF-ET周期中受精失敗是無法完全避免的，常規(guī)IVF發(fā)生受精失敗的概率為5%～10%[9]，造成常規(guī)IVF低受精和完全不受精的原因尚不明確[10]。

受精失敗的主要原因包括兩類。①各種原因?qū)е碌木訜o法進(jìn)入卵母細(xì)胞：精子功能異常，未能成功穿過透明帶進(jìn)入卵母細(xì)胞；卵母細(xì)胞質(zhì)量差，透明帶增厚、變硬及精子結(jié)合位點(diǎn)的改變導(dǎo)致精子穿透障礙；不孕原因及技術(shù)因素。②卵母細(xì)胞激活失敗即卵母細(xì)胞不能對精子誘導(dǎo)的激活產(chǎn)生反應(yīng)和不能將精子核去濃縮形成雄原核，這類卵母細(xì)胞即使行ICSI操作，仍有2%～3%受精失敗的可能[11]。

趙芳等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞的成熟與否影響IVF受精率，對胚胎的質(zhì)量也有重要影響，進(jìn)而導(dǎo)致優(yōu)質(zhì)胚胎率降低，可利用胚胎數(shù)減少。Miyara等[14]發(fā)現(xiàn)常規(guī)IVF失敗的卵母細(xì)胞中85.5%卵母細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)精子，顯然精子未進(jìn)入卵母細(xì)胞內(nèi)。鄧華麗等[15]報道不明原因不育夫婦原發(fā)不育者更容易出現(xiàn)IVF受精失敗。本研究亦發(fā)現(xiàn)多年原發(fā)不育癥患者容易出現(xiàn)受精失敗，故對于這部分患者應(yīng)多加關(guān)注，及時補(bǔ)救受精。Swain[16]研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)體系的 pH值及其緩沖能力對配子及胚胎的質(zhì)量有嚴(yán)重影響。 因此，認(rèn)為IVF周期中合適的培養(yǎng)基pH值能夠保證得到更好的臨床妊娠結(jié)局[17]。

對受精失敗的補(bǔ)救方法目前有2種，一是受精后20 h 補(bǔ)救ICSI(晚補(bǔ)救); 二是受精后6 h補(bǔ)救ICSI(早補(bǔ)救)。在短時受精結(jié)合早補(bǔ)救ICSI技術(shù)之前，大多采用晚補(bǔ)救ICSI,但其臨床妊娠率極低，可能與卵子的老化有關(guān)。卵子的老化可能導(dǎo)致卵母細(xì)胞mRNA和蛋白質(zhì)的減少,影響胚胎的發(fā)育,優(yōu)胚率下降。正常情況下微絲主要存在于卵母細(xì)胞質(zhì)的皮質(zhì)區(qū),微絲對減數(shù)分裂時紡錘體的遷移、旋轉(zhuǎn)和原核的靠近起著重要作用,即使受精后有絲分裂紡錘體的行為也受微絲控制[18-19]，而老化的卵母細(xì)胞微絲排列被破壞[20]，故限制了其在臨床中的應(yīng)用。

自2003年短時受精結(jié)合早補(bǔ)救ICSI技術(shù)應(yīng)用于臨床，得到國內(nèi)眾多中心的認(rèn)可及應(yīng)用，在臨床治療效果上取得了與常規(guī)IVF受精相近的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及著床率[21，11]。短時受精結(jié)合早期補(bǔ)救性 ICSI 技術(shù)可較早地發(fā)現(xiàn)受精失敗，早期進(jìn)行ICSI補(bǔ)救，在很大程度上避免了完全受精失敗的發(fā)生，故此項(xiàng)技術(shù)已被越來越多的生殖中心所采用[22]。趙芳等[12]的研究結(jié)果顯示，短時受精聯(lián)合早期ICSI可有效克服常規(guī)IVF受精障礙，顯著提高受精率，獲得良好的妊娠結(jié)局，因此可以作為臨床挽救受精失敗的最佳選擇。

短時受精結(jié)合早補(bǔ)救雖然提高了受精率、妊娠率，但由于短時受精去除顆粒細(xì)胞時的機(jī)械刺激對透明帶的損傷導(dǎo)致異常受精率亦明顯增加[23]。同時因?yàn)?PB釋放平均時間在受精后2 h 39 min,加精后6 h 90%受精卵釋放極體，但讓10%的卵母細(xì)胞未釋放2PB導(dǎo)致判斷失誤[24]。本研究中受精失敗補(bǔ)救ICSI部分的異常受精率雖然略高于自然受精部分，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。異常受精主要原因是個別卵母細(xì)胞雖然受精但2PB排除延遲，或者是對3級碎極體的判斷失誤而進(jìn)行了補(bǔ)救ICSI，導(dǎo)致多精受精。但受精失敗的自然受精僅10.21%，如果放棄對其補(bǔ)救受精將明顯降低卵母細(xì)胞的利用率，對患者造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失及精神壓力。對于胚胎的利用上，對第3天的胚胎選擇優(yōu)質(zhì)胚胎移植和冷凍，剩余所有胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)，而對于沒有優(yōu)質(zhì)胚胎的患者除移植胚胎外剩余胚胎皆囊胚培養(yǎng)。冼英杰等[25]的研究中繼續(xù)培養(yǎng)非優(yōu)質(zhì)胚胎至囊胚期，從而有效挑選出哪些非優(yōu)質(zhì)胚胎具有發(fā)育潛能，盡管在此過程中一些可冷凍的非優(yōu)質(zhì)胚胎未發(fā)育成可冷凍囊胚而廢棄，降低了胚胎利用率，造成胚胎浪費(fèi)，但減少了患者不必要的解凍移植次數(shù)，提高了胚胎的移植效率，降低了患者經(jīng)濟(jì)壓力。

本研究2組僅優(yōu)質(zhì)胚胎率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而移植自然受精組胚胎的臨床妊娠率、著床率與移植補(bǔ)救ICSI組胚胎的數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因可能是由于移植自然受精組數(shù)據(jù)太少，結(jié)果的真實(shí)性有待更多的數(shù)據(jù)支持。

本研究也證實(shí)了早期補(bǔ)救的時間優(yōu)勢避免了卵子的過度老化，保證了胚胎發(fā)育與內(nèi)膜種植的同步性，理論上有利于臨床結(jié)局的改善。

綜上所述，短時受精結(jié)合早補(bǔ)救ICSI是預(yù)防受精失敗的有效方法，增加了胚胎利用率，減少了無胚胎移植的風(fēng)險，挽救了部分受精失敗，使這類患者的臨床結(jié)局得到了很大改善。雖然早補(bǔ)救ICSI技術(shù)取得了良好的臨床結(jié)局，沒有明顯增加安全性風(fēng)險，但臨床仍需大樣本隨訪。

[1] Zhang XD,Liu JX,Liu WW,et al. Time of insemination culture and outcomes of in vitro fertilization:a systematic review and meta-analysis[J]. Hum Reprod Update,2013,19(6):685-695.

[3] 張曦倩，董云巧，周娜,等.短時受精聯(lián)合早期補(bǔ)救性ICSI與重復(fù)周期直接ICSI的臨床數(shù)據(jù)分析[J].南方大學(xué)學(xué)報,2015,35(8):1219-1220.

[4] Swain JE,Pool TB. ART failure:oocyte contributions to unsuccessful fertilization[J]. Hum Reprod Update,2008,14(5):431-446.

[5] 簡啟亮，王芳，丁楠，等.短時受精與常規(guī)受精在體外受精周期效果的Meta分析[J].中國詢證醫(yī)學(xué)雜志,2014,14(12):1504-1509.

[6] 張純，張帆，鄭潔，等.短時受精對體外受精及臨床妊娠結(jié)局的影響[J].廣州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2015,43(1):36-39.

[7] Johnson LN,Sasson IE,Sammel MD,et al. Does intracytoplasmic sperm injection improve the fertilization rate and decrease the totalfertilization failure rate in couples with well-defined unexplained infertility?A systematic review and meta-analysis[J]. Fertil Steril,2013,100(3):704-711.

[8] Tulsiani DR,Abou-Haila A. Molecular events that regulate mammalian fertilization[J]. Minerva Ginecol,2011,63(2):103-118.

[9] Geary TW,Smith MF,MacNeil MD,et al.Influence offollicular characteristics at ovulation on early embryonic survival[J]. J Anim Sci,2013,91(7):3014-3021.

[10] 劉琨，胡俊平，馬曉玲，等.體外授精中卵母細(xì)胞受精失敗因素分析及早期補(bǔ)救ICSI的應(yīng)用探討[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2016,25(7):619-622.

[11] 韓樹標(biāo)，韓偉，黃國寧.短時受精結(jié)合早期補(bǔ)救ICSI技術(shù)的臨床應(yīng)用[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2014，23(3)：211-213.

[12] 趙芳，呂玉珍，王娟，等.常規(guī)IVF/部分受精失敗后行早期補(bǔ)救ICSI的應(yīng)用價值[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2015,24(2)：87-92.

[13] 孫梅，馮云，陳子江.取卵數(shù)目與卵子成熟對IVF-ET的影響[J].生殖與避孕，2000,20(3):184-186.

[14] Miyara F,Aubriot F,Glissant A,et al. Multiparameter analysis of human oocytes at metaphase Ⅱ stage after IVF failure in non-male infertility[J]. Hum Reprod,2003,18(7):1494-1503.

[15] 鄧華麗，葉虹，陳巧莉，等.不同類型不明原因不孕患者的體外受精-胚胎移植助孕結(jié)局探討[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2014，22(9):154-158.

[16] Swain JE.Optimizing the culture environment in the IVF laboratory:impact of pH and buffer capacity on gamete and embryo quality[J]. Reprod Biomed Online,2010,21(1):6-16.

[17] Swain JE. Is there an optimal pH for culture media used in clinical IVF?[J]. Hum Reprod Update,2012,18(3):333-339.

[18] Grondahl ML,Yding Anderson C,Bogstad J,et al. Gene expression profiles of single human mature oocytes in relation to age[J]. Hum Reprod,2010,25(4):957-968.

[19] Leoni GG,Bebbere D,Succu S,et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes[J]. Mol Reprod Dev,2007,74(2):249-257.

[20] Kim NH,Moon SJ,Prather RS,et al. Cytoskeletal alteration in aged porcine oocytes[J]. Mol Reprod Dev,1996,43(4):513-518.

[21] 蒲艷，丁潔，顧斌，等，分析短時受精及早補(bǔ)救ICSI的應(yīng)用價值[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2016,24(7)：120-122.

[22] 趙志明，曹金鳳，杜元杰，等.早期補(bǔ)救及后續(xù)卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射在常規(guī)體外受精受精失敗及低受精率周期的應(yīng)用[J].中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志,2013，29(11):882-886.

[23] 馬蘭,楊曉玲，陳靜思,等.IVF-ET治療中短時受精對治療結(jié)局的影響[J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2015,36(11):108-111.

[24] Nagy ZP,Janssensw illen C,Janssens R,et al. Timing of oocyte activation,pronucleusf ormation and cleavage in humans af ter int racytoplasmic sperm injection( ICSI ) with test icular spermatozoa and after ICSI or inOvitr of ert ilization on sibling oocytes with ejaculat ed spermat ozoa[J]. Hum Reprod,1998,13(6):1606-1612.

[25] 冼英杰，陳彩蓉，梁小青，等.繼續(xù)囊胚培養(yǎng)篩選非優(yōu)質(zhì)胚胎中具有發(fā)育潛能胚胎的可行性研究[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2014,35(18):2662-2664.

2017-03-13；

2017-04-06

王娜(1977-),女,河北保定人，河北省保定市婦幼保健院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事生殖醫(yī)學(xué)研究。

R321.33

B

1007-3205(2017)12-1464-04

趙麗潔)