黃志輝，黃逸慧，陳慧英，韋廷佳，蘇紀(jì)平，黃瑋

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

·基礎(chǔ)研究·

大鼠下丘神經(jīng)元鈣蛋白酶1表達(dá)與水楊酸鈉所致聽力損害的關(guān)系

黃志輝，黃逸慧，陳慧英，韋廷佳，蘇紀(jì)平，黃瑋

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

目的 探討下丘神經(jīng)元鈣蛋白酶1表達(dá)與水楊酸鈉所致聽力損害發(fā)生的關(guān)系。方法 將36只健康SD大鼠隨機(jī)分為水楊酸鈉組及對照組，每組18只。水楊酸鈉組腹腔注射水楊酸鈉350 mg/kg(50 mg/mL)，對照組腹腔注射等量生理鹽水，均連續(xù)注射28天。分別于注射前1天、注射1周及注射4周行聽性腦干反應(yīng)測量兩組聽力閾值，Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波潛伏期以及Ⅰ～Ⅴ、Ⅲ～Ⅴ波間潛伏期。采用免疫組織化學(xué)法檢測兩組下丘神經(jīng)元鈣蛋白酶1表達(dá)。結(jié)果 與對照組比較，水楊酸鈉組聽力閾值增大，Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波潛伏期及Ⅰ～Ⅴ、Ⅲ～Ⅴ波間潛伏期延長；下丘神經(jīng)元鈣蛋白酶1相對表達(dá)量增加(P均<0.01)；隨用藥時(shí)間延長上述指標(biāo)變化更為明顯(P均<0.05)。結(jié)論 鈣蛋白酶1參與了水楊酸鈉導(dǎo)致聽力損傷的過程；鈣蛋白酶1在下丘神經(jīng)元表達(dá)量可反映聽力損傷程度。

聽力損傷；水楊酸鈉；下丘神經(jīng)元；鈣蛋白酶1；大鼠

水楊酸鈉是解熱鎮(zhèn)痛藥阿司匹林的活性成分，臨床應(yīng)用廣泛。但其在臨床使用過程中常導(dǎo)致耳聾、耳鳴、聽力下降。已有研究表明，水楊酸鹽可透過血腦屏障，對聽覺系統(tǒng)各個(gè)部位有直接作用[1,2]，其作用于毛細(xì)胞到聽皮層等聽覺通路各個(gè)環(huán)節(jié)影響聽力。下丘是聽覺傳導(dǎo)中樞的中繼站，在聲音頻率、強(qiáng)度、時(shí)間因素及聲源定位的分析中均起重要作用，亦是水楊酸鹽藥物作用的靶點(diǎn)之一。鈣蛋白酶(Calpain)是一種細(xì)胞內(nèi)鈣依賴的半胱氨酸蛋白水解酶，其中μ-鈣蛋白酶和m-鈣蛋白酶在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛存在，參與細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)調(diào)控以及多種神經(jīng)退行性病變等過程。μ-鈣蛋白酶較m-鈣蛋白酶可在更低濃度Ca2+條件下激活，鈣蛋白酶1(Calpain 1)為μ-鈣蛋白酶大亞基，是μ-鈣蛋白酶激活后主要活性成分。本研究探討鈣蛋白酶在水楊酸鈉所致聽力損傷發(fā)生中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年SD大鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，雌雄不限，體質(zhì)量200～250 g，聽性腦干反應(yīng)(ABR)測量聽力閾值≥40 dB SPL。

1.2 動(dòng)物分組及處理 選取符合條件的36只健康大鼠，在廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周；將大鼠隨機(jī)分為水楊酸鈉組和對照組，各18只。水楊酸鈉組每天腹腔注射水楊酸鈉(水楊酸鈉用生理鹽水配制，濃度為50 mg/mL，按350 mg/kg腹腔注射)，對照組腹腔注射等量生理鹽水；共4周。

1.3 ABR檢測 兩組分別于水楊酸鈉注射前1天、注射1周和注射4周時(shí)行ABR檢測：采用美國產(chǎn)Bio-logic多功能電生理儀。檢測前用1%戊巴比妥鈉按50 mg/kg腹腔注射麻醉，15 min后將大鼠固定在固定架上，接上電極。刺激聲采用roaring click短促音，脈沖寬度0.1 ms，掃描時(shí)程10 ms，刺激率為30～50次/s，刺激強(qiáng)度由100 dB SPL到10 dB SPL，以5 dB SPL梯度遞減，揚(yáng)聲器距離大鼠測試耳外耳門約1 cm處固定，采集波濾波范圍設(shè)定為300～3 000 Hz，疊加512次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄時(shí)以Ⅲ波剛消失時(shí)刺激強(qiáng)度作為聽力閾值。測量各時(shí)期Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波潛伏期，Ⅰ～Ⅴ、Ⅲ～Ⅴ波間潛伏期。

1.4 下丘神經(jīng)元Calpain 1表達(dá)檢測 采用免疫組化法。ABR檢測完成后采用4%多聚甲醛對大鼠心臟灌注固定，取出下丘，固定48 h脫水透明，石蠟包埋。石蠟切片厚度為4 μm，每張切片脫蠟后用3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性10 min，PBS沖洗后用枸櫞酸鈉緩沖液高壓修復(fù)10 min，PBS沖洗，滴加5%BSA封閉15 min，一抗4 ℃過夜后二抗孵育10 min。用新鮮配置的DAB溶液顯微鏡下顯色2～10 min，蘇木素復(fù)染，自來水返藍(lán)后脫水透明，以中性樹脂封片。玻片顯微鏡照相后用Image-Pro Plus軟件對圖像進(jìn)行分析，以陽性細(xì)胞染色(細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色)的平均積分光密度值(總IOD/總面積)表示抗原的相對表達(dá)量。Calpain 1單克隆抗體購于ORIGENE公司，SABC試劑盒及DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

2 結(jié)果

2.1 兩組聽力閾值比較 對照組在注射前1天、注射1周、注射4周不同階段聽力閾值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.500，P>0.05)；水楊酸鈉組不同階段測聽力閾值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=106.215，P<0.01)，且不同時(shí)點(diǎn)聽力閾值兩兩比較P均<0.01。注射1周、注射4周水楊酸鈉組聽力閾值均明顯高于對照組(P均<0.01)。見表1。

表1 兩組聽力閾值比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 兩組不同時(shí)期ABR檢測各波潛伏期、波間潛伏期比較 見表2。

表2 兩組各波潛伏期、波間潛伏期比較±s)

注：與注射前1天比較，*P<0.05，#P<0.01；與注射1周比較，△P<0.05。

2.3 兩組下丘神經(jīng)元Calpain 1表達(dá)比較 對照組在實(shí)驗(yàn)不同時(shí)期，Calpain 1陽性染色的神經(jīng)元較少，且染色程度相仿。水楊酸鈉組注射前1天陽性染色神經(jīng)元細(xì)胞較少，且染色較淺；注射1周時(shí)陽性染色神經(jīng)元明顯增多，染色較注射前1天有所加深；注射4周可見神經(jīng)元染色較前兩者顯著的加深；見插頁Ⅰ圖4。兩組注射前1天、注射1周及注射4周Calpain 1相對表達(dá)量比較見表3。

表3 兩組下丘神經(jīng)元Calpain 1相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與同組注射前1天比較，△P<0.01；與同組注射1周比較，#P<0.01。

3 討論

水楊酸鈉不僅對外周的耳蝸具有毒性，亦可透過血腦屏障，直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制耳蝸神經(jīng)信號的傳導(dǎo)，還可顯著增大下丘、內(nèi)側(cè)膝狀體、大腦皮層等多個(gè)部位對聲音信號的反應(yīng)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，人應(yīng)用高濃度水楊酸鹽后不久即會(huì)出現(xiàn)短期耳鳴和聽力損害，水楊酸鹽通過加強(qiáng)螺旋神經(jīng)元(SGN)上的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體的電流而增強(qiáng)NMDA受體介導(dǎo)的神經(jīng)沖動(dòng)；采用NMDA受體阻滯劑美金剛可顯著降低水楊酸鈉的耳毒性[3]，提示水楊酸鈉耳毒性可能與NMDA受體有關(guān)，且NMDA受體激活可促進(jìn)水楊酸鈉對SGN的神經(jīng)毒性，NMDA受體阻滯劑可抑制水楊酸鈉神經(jīng)毒性。此外，水楊酸鈉耳毒性是可逆的，短期應(yīng)用者停藥可恢復(fù)正常，但長期注射水楊酸鈉會(huì)永久減少鼠的耳蝸聽神經(jīng)復(fù)合動(dòng)作電位(CAP)和ABR的振幅[2]，可見除NMDA受體以外，水楊酸鈉對神經(jīng)不可逆聽力損傷還包含其他損傷通路，導(dǎo)致耳蝸神經(jīng)元不可逆損傷。

鈣蛋白酶是谷氨酸能突觸傳遞的一個(gè)下游靶蛋白，主要表達(dá)在神經(jīng)元胞質(zhì)和突觸終端[4～7]。當(dāng)NMDA受體被激活時(shí)，鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，可激活鈣蛋白酶。鈣蛋白酶在細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用[8]，可通過對Bax蛋白剪切生成促凋亡片段[9]及激活caspase-3和caspase-12等通路參與細(xì)胞凋亡途徑[10]。鈣蛋白酶的激活還參與多種神經(jīng)退行性病變，如阿爾茨海默病[11]、亨廷頓病[12]等，皆存在鈣離子代謝失調(diào)以及鈣蛋白酶活性異常，最終引起神經(jīng)元凋亡，在退行性病變中起關(guān)鍵作用。以上研究均說明病理情況下神經(jīng)元鈣離子濃度異常、鈣蛋白酶過度激活是導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能異常的機(jī)制之一。水楊酸鈉長期使用引起的聽力損害作用機(jī)制迄今為止還未明確，有相關(guān)報(bào)道指出水楊酸鈉可增強(qiáng)SGN的NMDA受體電流[13]，并且激活NMDA受體，使神經(jīng)元內(nèi)鈣離子和花生四烯酸依賴性超氧化物水平增高[14，15]，最終導(dǎo)致螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷及凋亡。

本研究結(jié)果顯示，水楊酸鈉組注射水楊酸鈉過程中，聽力閾值明顯高于對照組。Liu等[16]對注射水楊酸的大鼠行ABR檢測，發(fā)現(xiàn)大鼠在多次注射水楊酸鈉的情況下，各波波幅下降，且隨著注射時(shí)間的延長，其ABR反應(yīng)閾不斷上升，各波潛伏期不斷延長，本研究結(jié)果與其相符。此外從水楊酸鈉組Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ波潛伏期變化情況發(fā)現(xiàn)，注射水楊酸鈉1周時(shí)，Ⅰ、Ⅲ潛伏期未發(fā)生明顯改變，但Ⅴ波明顯升高。Ⅴ波主要反映聽覺傳導(dǎo)中樞下丘電流，推測可能水楊酸鈉可能對下丘神經(jīng)元影響較早且較明顯。分析Ⅰ～Ⅲ波間潛伏期結(jié)果可發(fā)現(xiàn)持續(xù)水楊酸鈉作用對大鼠聽力損害程度隨時(shí)間延長而增大，但Ⅲ～Ⅴ波間潛伏期測的結(jié)果卻并非如此，水楊酸鈉注射1周時(shí)Ⅲ～Ⅴ波間潛伏期明顯更長，注射4周時(shí)與注射1周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果產(chǎn)生的原因可能由于NMDA受體本身也是Calpain底物[17]，在水楊酸鈉促進(jìn)NMDA受體表達(dá)的同時(shí)，也被Calpain水解，從而減輕Calpain對神經(jīng)細(xì)胞的損害。本研究結(jié)果顯示，隨著水楊酸鈉應(yīng)用時(shí)間的延長，大鼠聽力損害逐漸加重，下丘神經(jīng)元內(nèi)Calpain 1表達(dá)量隨之增加，推測聽力損害的嚴(yán)重程度可能與神經(jīng)元內(nèi)Calpain 1表達(dá)呈正相關(guān)。Calpain 1是μ-鈣蛋白酶大亞基，當(dāng)鈣離子濃度達(dá)3～50 μmol/L激活Calpain，水楊酸鈉可促進(jìn)下丘谷氨酸表達(dá)增高，并激活NMDA受體，引起鈣離子濃度失調(diào)最終激活Calpain，損傷神經(jīng)元。

總之，Calpain 1參與了水楊酸鈉導(dǎo)致聽力損傷的過程；Calpain 1在下丘神經(jīng)元表達(dá)量可反映聽力損傷的程度。

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黃瑋(E-mail: 13977166636@139.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.008

R651.1

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1002-266X(2017)04-0029-03

2016-02-29)