王若楠，范玉磊，梁婷婷，耿小番，劉璇，姚程，孫影

(華北理工大學基礎醫(yī)學院，河北唐山063000)

高血壓小鼠心肌肥厚過程中心肌組織Prx-2、8-OHdG蛋白表達變化及意義

王若楠，范玉磊，梁婷婷，耿小番，劉璇，姚程，孫影

(華北理工大學基礎醫(yī)學院，河北唐山063000)

目的 探討高血壓小鼠心肌肥厚過程中心肌組織硫氧環(huán)蛋白過氧化物酶2(Prx-2)、8-羥基脫氧鳥嘌呤(8-OHdG)蛋白表達變化及其意義。方法 將60只雄性C57BL/6N小鼠分為觀察組40只和對照組20只，觀察組采用兩腎一夾(2K1C)法制備高血壓心肌肥厚模型，對照組只分離左腎動脈，不放置腎動脈夾。兩組分別于術前和術后2、4、8、12周測量尾動脈收縮壓；術后2、4、8、12周分別隨機選擇10只觀察組小鼠及5只對照組小鼠處死，計算全心質量指數和左心室質量指數，分別采用免疫印跡法、免疫組化法檢測左心室心肌組織Prx-2、8-OHdG蛋白表達；分析觀察組術后各時間點Prx-2、8-OHdG蛋白表達的關系。結果 兩組術前尾動脈收縮壓比較無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)，觀察組術后2、4、8、12周尾動脈收縮壓、全心質量指數和左心室質量指數均呈升高趨勢，且均高于對照組同時間點(P均<0.05)；證實建模成功。觀察組術后2、4、8、12周左心室心肌組織Prx-2蛋白相對表達量及8-OHdG蛋白表達均呈升高趨勢，且均高于對照組同時間點(P均<0.05)。觀察組術后2、4、8、12周左心室心肌組織8-OHdG和Prx-2蛋白表達均呈正相關(r分別為0.95、0.97、0.97和0.95，P均<0.01)。結論 高血壓小鼠心肌肥厚過程中左心室心肌組織Prx-2、8-OHdG蛋白表達均升高，二者分別通過抗氧化和促氧化作用參與心肌肥厚的發(fā)生與發(fā)展。

高血壓；硫氧環(huán)蛋白過氧化物酶2；8-羥基脫氧鳥嘌呤；心肌肥厚；活性氧；小鼠

心肌肥厚是高血壓累及心臟最常見的表現，長期心肌肥厚會導致慢性心力衰竭。研究顯示，氧化應激是引起心肌肥厚的重要原因之一[1]。氧化應激是指細胞中促氧化與抗氧化體系之間的平衡失調，促氧化因素增多，導致細胞內穩(wěn)態(tài)紊亂?；钚匝?ROS)是促氧化的主要物質，具有強氧化潛能，8-羥基脫氧鳥嘌呤(8-OHdG)是ROS攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位碳原子形成的產物，是反映ROS水平的可靠標志物[2, 3]。硫氧環(huán)蛋白過氧化物酶-2(Prx-2)是一種新型過氧化物酶，其在多種疾病中表達升高，可通過抗氧化作用而減少ROS引起的氧化應激損傷[4, 5]。目前關于Prx-2及8-OHdG在高血壓誘導心肌肥厚過程中的表達變化鮮見報道。為此，我們于2013年1月～2015年6月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：60只C57BL/6小鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，均為雄性，體質量(22.4±0.8)g。主要試劑及儀器：銀質腎動脈夾(內徑0.15 mm)購于上海奧旺醫(yī)療器械有限公司，Prx-2抗體、8-OHdG抗體均購于英國Abcam公司，小鼠無創(chuàng)血壓測量儀購于上海奧爾科特生物科技有限公司，單壓力心臟導管購于美國Scisence公司。

1.2 高血壓心肌肥厚模型制備 將60只C57BL/6小鼠分為觀察組40只和對照組20只。觀察組采用兩腎一夾(2K1C)法制備高血壓高血壓心肌肥厚模型：小鼠以1 %戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥位進行固定，于腹正中作一1.5 cm切口，切開腹腔后暴露左腎；鈍性分離左腎動脈，銀質腎動脈夾鉗夾左腎動脈，關閉切口。對照組只分離左腎動脈，不放置腎動脈夾。兩組術后均自由進食和飲水。 術前和術后2、4、8、12周采用無創(chuàng)血壓儀通過鼠尾動脈袖套法測量兩組清醒狀態(tài)下的尾動脈收縮壓。每次尾動脈收縮壓測定后分別隨機選擇觀察組10只及對照組5只處死，迅速取出心臟，濾紙吸干水分后稱質量，分離左、右心房和左、右心室并稱重，計算全心質量指數和左心室質量指數。全心質量指數=全心質量(mg)/體質量(g)，左心室質量指數=左心室質量 (mg)/體質量 (g)。結果顯示，兩組術前尾動脈收縮壓比較無明顯統(tǒng)計學差異(P均>0.05)，觀察組術后2、4、8、12周尾動脈收縮壓均明顯高于術前及對照組術后同時間點(P均<0.05)。見表1。觀察組術后2、4、8、12周全心質量指數和左心室質量指數均呈升高趨勢，且均高于對照組同時間點(P均<0.05)。見表2、3。本研究兩組術前尾動脈收縮壓比較無明顯統(tǒng)計學差異，但觀察組術后2、4、8、12周尾動脈收縮壓均明顯高于術前及對照組術后同時間點；觀察組術后2、4、8、12周全心質量指數和左心室質量指數均呈升高趨勢，且均高于對照組同時間點。提示高血壓心肌肥厚模型制備成功。

表1 兩組造模前后尾動脈收縮壓比較±s)

注：與同組術前比較，*P<0.05；與對照組同時間點比較，#P<0.05。

表2 兩組造模后全心質量指數比較±s)

注：與對照組同時間點比較，*P<0.05。

表3 兩組造模后左心質量指數比較±s)

注：與對照組同時間點比較，*P<0.05。

1.4 相關指標觀察

1.4.1 左心室心肌組織Prx-2蛋白表達 采用免疫印跡法。將兩組術后2、4、8、12周稱重后的左心室心肌組織分為兩部分進行凍存，分別用于檢測Prx-2和8-OHdG蛋白表達。取其中一部分凍存的左心室心肌組織，加入蛋白裂解液進行裂解，超聲波擊碎后，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，-70 ℃保存?？捡R斯亮藍R-250染色測定蛋白濃度，取50 μg總蛋白進行電泳并轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h；加入Prx-2和GAPDH一抗(1∶10 00稀釋)后4 ℃孵育過夜，加入二抗 (1∶3 000稀釋)后室溫孵育45 min，NBT/BCIP顯色劑顯色。采用Image J軟件掃描并分析蛋白表達條帶的灰度值，Prx-2與GAPDH的灰度值比值為Prx-2相對表達量。

1.4.2 左心室心肌組織8-OHdG蛋白表達 采用免疫組化法。將另一部分左心室心肌組織冰凍切片室溫晾干后，4 ℃丙酮固定10 min，PBS洗滌。37 ℃10%驢血清封閉1 h，滴加8-OHdG一抗(1∶50稀釋)，4 ℃過夜后滴加熒光二抗Dylight549，常溫避光1 h后封片。每張切片于400倍光鏡下隨機選取6個視野，8-OHdG陽性表達呈紅色熒光；采用IPP圖像軟件分析心肌細胞的積分光密度(IOD)值，取平均值。

2 結果

2.1 兩組左心室心肌組織Prx-2蛋白相對表達量比較 觀察組術后2、4、8、12周左心心肌組織Prx-2蛋白相對表達量均呈升高趨勢，且均高于對照組同時間點(P均<0.05)。見表4、圖1。

表4 兩組手術后左心室心肌組織Prx-2蛋白相對表達量比較

注：與對照組同時間點比較，*P<0.05。

注：1～4為對照組術后2、4、8、12周；5～8:2K1C術后組2、4、8、12周。

圖1 兩組左心心肌組織Prx-2蛋白曲泳結果

2.2 兩組左心室心肌組織8-OHdG蛋白表達比較 觀察組術后2、4、8、12周左心心肌組織8-OHdG蛋白表達呈升高趨勢，且均高于對照組同時間點(P均<0.05)。見表5。

表5 兩組手術后左心室心肌組織8-OHdG蛋白表達比較

注：與對照組同時間點比較，*P<0.05。

2.3 左心室心肌組織8-OHdG與Prx-2表達的關系 Pearson相關分析結果顯示，觀察組術后2、4、8、12周左心室心肌組織中8-OHdG和Prx-2蛋白表達均呈正相關(r分別為0.95、0.97、0.97和0.95，P均<0.01)。

3 討論

高血壓引起的心臟結構重建主要為左心室肥厚，是心臟對慢性壓力和容量超負荷的適應性變化，也是高血壓的一種常見的并發(fā)癥，早期代償性表現為向心性肥厚，晚期則失代償表現為離心性肥厚，進而心功能下降，最終導致心力衰竭。

研究表明，動脈粥樣硬化小鼠內源性ROS水平增高，并伴有Prx-2高表達；如果Prx-2缺乏，則加重小鼠動脈粥樣硬化損傷[15]。Zhao等[16]報道，心臟缺血再灌注小鼠心肌細胞中Prx-2表達減少，ROS表達和心肌細胞凋亡率升高；提高Prx-2表達可降低H2O2水平，并通過抑制caspase 3、9、12和激活Bcl-2途徑，減少心肌細胞凋亡，表明Prx-2對ROS引起的心肌細胞損傷具有保護作用。本研究觀察組術后2、4、8、12周左心室心肌組織Prx-2蛋白相對表達量呈升高趨勢，且均高于對照組同時間點。

在正常生理條件下，機體的抗氧化能力和氧化損傷之間保持著相對的動態(tài)平衡，氧化應激產生的ROS能迅速被機體內抗氧化系統(tǒng)清除。但在某些病理情況下，機體抗氧化防御能力下降，受有害刺激時ROS產生增多，就會出現體內ROS產生增加和(或)清除減少，導致ROS在體內蓄積，引發(fā)氧化應激導致的組織損傷[7, 8]。堿基配對時8-OHdG與腺嘌呤A配對，導致DNA鏈G:C→T:A顛換，這種突變難以修復或修復極慢，因此8-OHdG蛋白表達可以反映機體DNA氧化損傷程度，是一個可靠的評價機體DNA氧化損傷和氧化應激狀態(tài)的標志物[9]。研究表明，在心肌肥厚的發(fā)展過程中，心肌細胞耗氧逐漸增加，線粒體氧化磷酸化加強，電子傳遞鏈中氧泄漏增多，線粒體內產生大量ROS，如不及時清除則會造成細胞的損傷甚至死亡[10, 11]。本研究觀察組術后2、4、8、12周左心室心肌組織8-OHdG蛋白表達呈升高趨勢，且均高于對照組同時間點；說明腎性高血壓可引起心肌組織ROS產生和清除嚴重失衡，使ROS在心肌細胞內蓄積，導致氧化應激的發(fā)生，直接引起心肌細胞的氧化損傷。病理狀態(tài)下，增高的ROS作為第二信使傳遞AngⅡ等細胞外信號，通過激活多種細胞內的級聯傳遞信號和轉錄因子，誘導心肌肥厚基因的表達，進而促進細胞增殖和心肌肥厚[11, 12]。研究表明，在腫瘤、神經系統(tǒng)等多種疾病中ROS水平增高，相應的Prx-2蛋白表達也上調，發(fā)揮其抗氧化作用[13, 14]。本研究觀察組術后2、4、8、12周左心室心肌組織中8-OHdG和Prx-2表達均呈正相關。以上提示高血壓小鼠心肌肥厚過程中心肌組織ROS表達增加。為降低ROS引起的氧化應激損傷，機體通過高表達Prx-2以清除增多的ROS。

綜上所述，高血壓小鼠心肌肥厚過程中心肌組織Prx-2、8-OHdG蛋白表達均升高，二者分別通過發(fā)揮抗氧化和促氧化作用參與心肌肥厚的發(fā)生。

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Expression changes of Prx-2 and 8-OHdG protein in mice with hypertension-induced myocardial hypertrophy

WANGRuonan,FANYulei,LIANGTingting,GENGXiaofan,LIUXuan,YAOCheng,SUNYing

(SchoolofBasicMedicalSciences,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To investigate the expression and significance of peroxiredoxin-2 (Prx-2) and 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine (8-OHdG) in mice with hypertension-induced myocardial hypertrophy. Methods Sixty male mice were randomly divided into the observation group (n=40) and control group (n=20). Mice in the observation group received 2-kidney1-clip (2K1C) to make the models of mice with hypertension-induced myocardial hypertrophy, while there was no silver clip in mice of the control group. The systolic blood pressure (SBP) was measured in all mice before the operation, and 2, 4, 8 and 12 weeks after 2K1C. Ten mice in observation group and five mice in the control group were scarified at 2, 4, 8 and 12 weeks after surgery to measure the whole heart quality index and left ventricle quality index. Prx-2 and 8-OHdG protein expression was detected by Western blotting and Immunohistochemistry. And then, we analyzed the correlation between Prx-2 and 8-OHdG. Results No significant difference was found in the preoperative SBP between the control and observation groups (P>0.05). Compared with the control group, SBP, whole heart quality index and left ventricle quality index was increased in the observation group at 2, 4, 8 and 12 weeks after surgery, indicating that the hypertension model was successful (allP<0.05). The expression levels of 8-OHdG and Prx-2 protein in the observation group at 2, 4, 8 and 12 weeks after surgery were significantly higher than those of the control group (allP<0.05), and the expression levels of 8-OHdG and Prx-2 protein was positively correlated with each other (r=0.95, 0.97, 0.97 and 0.95,P<0.05). Conclusion The expression levels of Prx-2 and 8-OHdG in mice with hypertension-induced myocardial hypertrophy are increased, and they participate the occurrence and development of myocardial hypertrophy through oxidation and anti-oxidation.

hypertension; peroxiredoxin-2; 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine; myocardial hypertrophy; reactive oxygen; mice

國家自然科學基金資助項目(81200188)；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201410081023)。

王若楠(1992-)，女，研究方向為高血壓的發(fā)病機制。E-mail: 764024174@qq.com

孫影(1976-)，女，教授，研究方向為高血壓的發(fā)病機制。E-mail: 1565756268@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.007

R544.1

A

1002-266X(2017)04-0005-04

2015-01-14)