魯媛，葛章文，劉杰麟

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽(yáng)550004)

乳腺癌干細(xì)胞BLM、RecQ4蛋白表達(dá)變化及意義

魯媛，葛章文，劉杰麟

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽(yáng)550004)

目的 探討乳腺癌干細(xì)胞BLM、RecQ4蛋白表達(dá)變化及其臨床意義。方法 采用無(wú)血清培養(yǎng)法從乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞中分離乳腺癌干細(xì)胞(以下稱(chēng)干細(xì)胞)，并鑒定。觀(guān)察MDA-MB-435細(xì)胞裸鼠及干細(xì)胞成瘤能力，RT-PCR法檢測(cè)二者ATP結(jié)合盒膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G2(ABCG2)mRNA相對(duì)表達(dá)量，Western blotting法和免疫組化法檢測(cè)二者BLM、RecQ4蛋白表達(dá)。結(jié)果 干細(xì)胞膜表面CD44+CD24-/low比例明顯高于、CD44+CD24+比例明顯低于MDA-MA-435細(xì)胞(P均<0.05)；兩種細(xì)胞膜表面CD44-CD24+、CD44-CD24-比例比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與接種相同密度MDA-MB-435細(xì)胞比較，接種干細(xì)胞的裸鼠成瘤時(shí)間早、腫瘤體積大；干細(xì)胞ABCG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.753±0.025，MDA-MB-435細(xì)胞為0.563±0.112；兩者比較P<0.05。干細(xì)胞BLM蛋白表達(dá)低、RecQ4蛋白表達(dá)高于MDA-MB-435細(xì)胞(P均<0.05)。結(jié)論 乳腺癌干細(xì)胞成瘤能力強(qiáng)；細(xì)胞BLM蛋白表達(dá)降低、RecQ4蛋白表達(dá)升高可能為其機(jī)制。

乳腺癌；無(wú)血清培養(yǎng)；乳腺癌干細(xì)胞；RecQ家族解旋酶

腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)認(rèn)為乳腺癌干細(xì)胞是乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的根源[1,2]。RecQ解旋酶是一種DNA解旋酶，人體中存在RecQL、BLM、WRN、RecQ4和RecQ5五種RecQ解旋酶，BLM、RecQ4突變將會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)疾病的發(fā)生，患者存在基因型不穩(wěn)定和癌癥易患性等共同特征[3]。2013年9月～2015年7月，本研究觀(guān)察了乳腺癌干細(xì)胞(以下稱(chēng)干細(xì)胞)BLM、RecQ4蛋白表達(dá)變化，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞由法國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院陸核教授饋贈(zèng)。動(dòng)物：雌性BALB/c系裸鼠18只，SPF級(jí)，4～6周齡，體質(zhì)量16～20 g，合格證號(hào)為S1K(黔)2002-0001，購(gòu)于貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房。試劑：recombinant Human EGF、Recombinant Human FGF-Basic、B27 Supplement(50×) 均購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司，鼠抗人CD24-FITC抗體、兔抗人CD44-PE抗體、同型對(duì)照均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，RecQ4抗體、BLM抗體、RecQ5抗體和β-actin抗體均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.2 干細(xì)胞分離及鑒定

1.2.1 干細(xì)胞分離 采用無(wú)血清培養(yǎng)法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-435細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，吸盡PBS液，加入胰酶消化2～3 min。采用含10% FBS的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基中止消化，800～1 000 r/min離心5 min，棄上清。采用含10% FBS的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)。將細(xì)胞以2×104個(gè)/mL接種至培養(yǎng)瓶，加入含生長(zhǎng)因子的無(wú)血清DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基至8～10 mL，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。采取半換液法進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變黃時(shí)，進(jìn)行全換液法培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)3～4周，200倍光鏡下觀(guān)察其生長(zhǎng)情況可見(jiàn)：存活下來(lái)的MDA-MB-435細(xì)胞(簡(jiǎn)稱(chēng)分離細(xì)胞)在完全培養(yǎng)基中貼壁生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形；轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞由梭形變?yōu)閳A形，呈懸浮生長(zhǎng)，并成串形成微球體，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。

1.2.2 干細(xì)胞鑒定 將MDA-MB-435細(xì)胞去掉培養(yǎng)基后PBS沖洗2次，胰酶消化細(xì)胞。將懸浮細(xì)胞移入離心管中，800～1 000 r/min離心5 min，棄上清。將其與1.2.1中的分離細(xì)胞采用PBS沖洗2遍，重懸成密度為2×107個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液。各取50 μL單細(xì)胞懸液于離心管中，分別加入50 μL PBS混勻，同時(shí)設(shè)實(shí)驗(yàn)管、空白管、同型對(duì)照管。實(shí)驗(yàn)管中加入5 μL CD44-FITC、0.625 μL CD24-PE，4 ℃避光孵育30 min。PBS沖洗2遍，加入500 μL PBS重懸細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液?？瞻坠懿患尤肟贵w，同型對(duì)照管加入同型對(duì)照抗體，其余步驟同實(shí)驗(yàn)管。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜表面CD44 CD24各表型細(xì)胞比例，包括CD44-CD24+、CD44-CD24-、CD44 + CD24-/low、CD44+CD24+(其中CD44+CD24-/low為干細(xì)胞表面標(biāo)志物)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果顯示，分離細(xì)胞膜表面CD44+CD24-/low比例明顯高于、CD44+CD24+比例明顯低于乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞(P均<0.05)；兩種細(xì)胞膜表面CD44-CD24+、CD44-CD24-比例比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；見(jiàn)表1。證實(shí)分離細(xì)胞為干細(xì)胞。

表1 MDA-MB-435及分離細(xì)胞膜表面CD44CD24各表型細(xì)胞比例比較±s)

注：與MDA-MB-435細(xì)胞比較，*P<0.05。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀(guān)察

1.3.1 成瘤能力 參照上述方法將MDA-MB-435細(xì)胞和干細(xì)胞分別制成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，分別將其密度調(diào)整為1×105、1×104、1×103個(gè)/mL，4 ℃條件下保存。將18只雌性裸鼠隨機(jī)分為6組，每組3只。各組均于兩側(cè)腋窩分別皮下注射上述密度的MDA-MB-435細(xì)胞和干細(xì)胞懸液100 μL。接種后將裸鼠送回SPF級(jí)飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，每天定時(shí)觀(guān)察腫瘤生長(zhǎng)情況，記錄成瘤時(shí)間。每周固定時(shí)間采用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤結(jié)節(jié)的最長(zhǎng)徑(a)和垂直方向最短徑(b)，計(jì)算腫瘤體積(V)，V=0.5ab2，共12周。

1.3.2 ATP結(jié)合盒膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G2(ABCG2)mRNA表達(dá) 采用RT-PCR法檢測(cè)。取MDA-MB-435細(xì)胞和干細(xì)胞分別加入裂解液，用加樣器吹打數(shù)次，15～30 ℃放置5 min。按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，采用M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。ABCG2上游引物：5′-TTAGGATTGAAGCCAAAGG-3′，下游引物：5′-TAGGCAATTGTGAGGCAATGAG-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度446 bp；以β-actin為內(nèi)參，上游引物：5′-GTCATCACCATTGGCAATGAG-3′，下游引物：5′-CGTCACACTTCATGATGGAGTT-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度121 bp。PCR反應(yīng)體系25 μL：上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，cDNA 2 μL(0. 2 μg)，去離子水補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；70 ℃延伸10 min。采用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，120 V電泳30 min。凝膠成像儀進(jìn)行拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件分析灰度值。以目的基因與β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶灰度值的比值計(jì)算ABCG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 BLM、RecQ4蛋白表達(dá) ①Western blotting法：采用蛋白抽提試劑盒提取MDA-MB-435細(xì)胞和干細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。配制8% SDS-PAGE、12% SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠，濃縮膠電泳80 V，分離膠電泳120 V，當(dāng)溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳。PVDF轉(zhuǎn)膜，室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉1 h。加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，次日在室溫下脫色搖床上搖動(dòng)孵育1 h，TBST沖洗3次。加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶2 000)，室溫下孵育1 h，TBST沖洗3次，進(jìn)行電泳蛋白條帶顯影。以Histone H3.1為內(nèi)參，采用掃描儀將膠片結(jié)果進(jìn)行掃描，凝膠圖象處理系統(tǒng)分析灰度值。以目的蛋白和內(nèi)參蛋白灰度值的比值計(jì)算BLM、RecQ4蛋白相對(duì)表達(dá)量。②免疫組化法：將MDA-MB-43細(xì)胞和干細(xì)胞用預(yù)溫的PBS沖洗3次，每次10 min。加入4%多聚甲醛室溫固定20～30 min，PBS沖洗3次，每次10 min。采用0.2% TritonX-100透化10 min，加入5%羊血清室溫封閉30 min。加入BLM、RecQ5抗體(用1%羊血清稀釋)，4 ℃過(guò)夜。PBS沖洗3次后加入Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG(用1%羊血清稀釋)，室溫避光孵育30 min。采用PBS沖洗3次，加入1% Hoechst33342(用PBS稀釋)，室溫避光孵育5 min，PBS沖洗3次，每次10 min。加入抗熒光衰減劑，95%甘油封片。熒光顯微鏡下拍照，采用Image J軟件分析光密度值。

2 結(jié)果

2.1 成瘤能力 接種1×105個(gè)/mL MDA-MB-435細(xì)胞的裸鼠于接種后第36天出現(xiàn)結(jié)節(jié)，接種1×105、1×104個(gè)/mL干細(xì)胞的裸鼠分別于接種后第23、30天出現(xiàn)結(jié)節(jié)，并逐漸增大。接種1×104、1×103個(gè)/mL MDA-MB-435細(xì)胞和接種1×103個(gè)/mL干細(xì)胞的裸鼠均未成瘤。與接種相同密度MDA-MB-435細(xì)胞比較，接種干細(xì)胞的裸鼠成瘤時(shí)間早、腫瘤體積大。裸鼠接種不同密度MDA-MB-435細(xì)胞和干細(xì)胞后1～3周均未成瘤，裸鼠接種MDA-MB-435細(xì)胞和干細(xì)胞后4～12周成瘤體積比較見(jiàn)表2。

表2 裸鼠接種MDA-MB-435細(xì)胞和干細(xì)胞后4～12周成瘤體積比較

注：與MDA-MB-435細(xì)胞同濃度、同時(shí)間比較，*P<0.01。

2.2 ABCG2 mRNA表達(dá) 干細(xì)胞及MDA-MB-435細(xì)胞ABCG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.753±0.025、0.563±0.112；兩者比較P<0.05。

2.3 BLM、RecQ4蛋白表達(dá) Western blotting法：干細(xì)胞及MDA-MB-435細(xì)胞BLM蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.92±0.01、0.77±0.03，RecQ4蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.78±0.01、0.95±0.03，兩者比較P均<0.05。免疫組化法：干細(xì)胞及MDA-MB-435細(xì)胞BLM蛋白表達(dá)(光密度值)分別為0.042±0.002、0.032±0.001，RecQ4蛋白表達(dá)分別為0.056±0.002、0.076±0.001，兩者比較P均<0.05。

3 討論

朱敬之等[4]在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加了bFGF、EGF、B27等只維持細(xì)胞生存的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)可使腫瘤干細(xì)胞增殖而形成微球體，維持不分化的狀態(tài)；而非腫瘤干細(xì)胞則貼壁生長(zhǎng)，最后死亡。本研究采用無(wú)血清培養(yǎng)法富集MDA-MB-435細(xì)胞中的干細(xì)胞，研究結(jié)果顯示，干細(xì)胞CD44+/CD24-/low比例明顯高于MDA-MB-435細(xì)胞，說(shuō)明成功從MDA-MB-435細(xì)胞中篩選出干細(xì)胞。

研究證實(shí)，腫瘤干細(xì)胞能在裸鼠體內(nèi)形成完整的惡性腫瘤，并且有與原發(fā)腫瘤相似的組織學(xué)特性；體內(nèi)高致瘤性是腫瘤干細(xì)胞重要的特性之一。郭崇勇等[5]研究表明，富集的腫瘤干細(xì)胞體內(nèi)成瘤性明顯高于乳腺癌MCF-7細(xì)胞。本研究裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與MDA-MB-435細(xì)胞比較，接種同樣密度干細(xì)胞的裸鼠成瘤時(shí)間早、腫瘤體積較大。ABCG2是一種多藥耐藥基因，均可以作為各種來(lái)源干細(xì)胞的重要標(biāo)志物，在腫瘤干細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色[6]。Hiraga等[7]研究發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-231細(xì)胞中ABCG2 mRNA在側(cè)群細(xì)胞的表達(dá)明顯高于非側(cè)群細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，干細(xì)胞ABCG2 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于MDA-MB-435細(xì)胞。以上說(shuō)明乳腺癌干細(xì)胞具有高成瘤能力和高耐藥性。

RecQ解旋酶是一個(gè)高度保守的蛋白質(zhì)家族，在保持基因組的完整性上具有關(guān)鍵作用。Sassi等[8]研究發(fā)現(xiàn)，BLM基因突變可能與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)。RecQ4與p53可阻止mtDNA的不穩(wěn)定性，從而抑制腫瘤的發(fā)生[9]。RecQ4被認(rèn)為與血液惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)，還可通過(guò)與生存素結(jié)合而避免乳腺癌細(xì)胞凋亡[10]。但不僅RecQ4的突變會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，其過(guò)量表達(dá)也會(huì)引骨肉瘤、前列腺癌、乳腺癌和宮頸癌等腫瘤的發(fā)生[11,12]。研究表明，RecQ4在乳腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，其與生存素結(jié)合而抑制乳腺癌細(xì)胞的凋亡[13]。Lao等[14]研究表明，在直腸癌組織中BLM和RecQ4表達(dá)均增加。本研究Western blotting法和免疫組化法檢測(cè)結(jié)果均顯示，干細(xì)胞BLM蛋白表達(dá)低于MDA-MB-435細(xì)胞，RecQ4蛋白表達(dá)高于MDA-MB-435細(xì)胞。

綜上所述，乳腺癌干細(xì)胞BLM蛋白表達(dá)降低、RecQ4蛋白表達(dá)升高，可能與其耐藥性和成瘤能力強(qiáng)有關(guān)。

[1] Hui XL, Xiao LL, Chen FD. Epigenetic and metabolic regulation of breast cancer stem cell[J]. J Zhejiang Univ Sci B, 2015,16(1):10-17.

[2] Li HZ, Yi TB, Wu ZY. Suspension culture combined with chemotherapeutic agents for sorting of breast cancer stem cells[J]. BMC Cancer, 2008(8):135.

[3] Monnat RJ, Sidorova J. Human RECQ helicases: roles in cancer, aging, and inherited disease[J]. Adv Genomics Genet, 2014,15(5):19-33.

[4] 朱敬之,吳志勇.乳腺癌干細(xì)胞的有效富集[J].中國(guó)臨床醫(yī)師雜志(電子版),2011,5(10):2856-2863.

[5] 郭崇勇,李克,周凌,等.長(zhǎng)程多柔比星化療富集乳腺腫瘤干細(xì)胞[J].腫瘤雜志,2012,32(1):27-31.

[6] Gong W, Wang Z, Wan Y, et al. Downregulation of ABCG2 protein inhibits migration and invasi in U251 glioma stem cells[J]. Neuroreport, 2014,28(5):625-632.

[7] Hiraga T, Ito S, Nakamura H. Side population in MDA-MB-231 human breast cancer cells exhi- bits cancer stem cell-like properties without higher bone-metastatic potential[J]. Oncl Rep, 2011,25(1):289-296.

[8] Sassi A, Popielarski M, Synowiec E, et al. BLM and RAD51 genes polymorphism and Susceptibility to breast cancer[J]. Pathol Oncol Res, 2013,19(3):451-459.

[9] 唐超智,楊鈞棠,王文晟.RECQL4在維持基因組穩(wěn)定中的作用[J].湖北農(nóng)業(yè)學(xué),2014,53(4):745-749.

[10] 梁樂(lè),唐超智,趙哲.RecQL4與腫瘤發(fā)生的關(guān)系[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(bào),2014,42(5):116-124.

[11] Maire G， Yoshimoto M, Chilton-MacNeill S, et al. Recurrent RecQL4 imbalance and increased gene expression levels are associated with structural chromosomal instability in sporadic osteosarcoma[J].Neoplasia, 2009,11(3):260-268.

[12] Su Y, Meador JA, Calaf GM, et al. Human RecQL4 helicase plays critical roles in prostate carcinogenesis[J]. Cancer Res, 2010,70(22):9207-9217.

[13] Fang H, Nie L, Chi Z, et al. RecQL4 helicase amplification is involved in human breast tumorigenesis[J]. PLoS One, 2013,8(7):e69600.

[14] Lao VV, Welcsh P, Luo Y, et al. Altered RECQ helicase expression in sporadic primary colorectal cancers[J]. Transl Oncol, 2013,6(4):458-469.

Expression changes and significance of BLM and RecQ4 helicases in breast cancer stem cells

LUYuan,GEZhangwen,LIUJielin

(GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To investigate the expression changes of BLM and RecQ4 helicases in breast cancer stem cells. Methods Breast cancer stem cells were screened from breast cancer MDA-MB-435 cells and were cultured in serum-free medium. The tumorigenicity of breast cancer stem cells and MDA-MB-435 cells was observed by tumor formation in nude mice. The drug resistance gene ATP-binding cassette transporter G2(ABCG2)mRNA of stem cells was detected by RT-PCR. The protein expression of BLM and RecQ4 was detected in breast cancer MDA-MB-435 cells and their stem cells by Western Blotting and fluorescent staining. Results The proportion of surface markers CD44+CD24-/lowin cancer stem cells was significantly higher, but the proportion of membrane surface CD44+CD24+was significantly lower than that of MDA-MB-435 cells (allP<0.05). No statistical significance was found in the proportions of cell membrane surface CD44-CD24+and CD44-CD24-between these two kinds of cells (allP<0.05). The mRNA expression of ABCG2 was 0.753±0.025 in stem cells, and it was 0.563±0.112 in the breast cancer MDA-MB-435 cells (P<0.05). Compared with the nude mice inoculated with the same density of MDA-MB-435 cells, the nude mice inoculated with stem cells had an early tumor formation time and a large tumor volume. The BLM protein expression of stem cells was lower and RecQ4 protein expression was higher than that of MDA-MB-435 cells (allP<0.05). Conclusion The tumorigenicity is high in breast cancer stem cells, which may be associated with low expression of BLM and high expression of RecQ4 in breast cancer stem cells.

breast carcinoma; serum-free culture; breast cancer stem cells; RecQ family helicases

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360349)；貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長(zhǎng)專(zhuān)項(xiàng)基金資助項(xiàng)目[黔科合字(2006)57號(hào)]。

魯媛(1987-)，女，碩士，研究方向?yàn)槟[瘤免疫學(xué)。E-mail: luyuanuse@163.com

劉杰麟(1963-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榕R床免疫學(xué)。E-mail： liujlin63@yahoo.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.003

R392.9

A

1002-266X(2017)04-0017-04

2015-02-03)