侯祥平，陳柳丹，林玉潔，陳克芳，麥華超，陳 珂，李建軍

自噬在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖的作用

侯祥平，陳柳丹，林玉潔，陳克芳，麥華超，陳 珂，李建軍

目的 探討自噬對(duì)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)遷移和增殖的影響。方法 采用體外培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs，采用不同濃度AngⅡ(10-10mol/L～10-6mol/L)刺激VSMCs 24 h，免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞自噬標(biāo)志物L(fēng)C3、Beclin1的表達(dá)；采用最佳濃度AngⅡ(10-7mol/L)對(duì)VSMCs刺激不同時(shí)間點(diǎn)(0 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h)，同時(shí)檢測(cè)LC3、Beclin1表達(dá)。采用AngⅡ1型受體阻斷劑(洛沙坦鉀)、AngⅡ型受體阻斷劑(PD123319)進(jìn)行預(yù)孵，之后采用最佳濃度AngⅡ刺激，檢測(cè)LC3表達(dá)。采用自噬特異性阻斷劑3-MA進(jìn)行預(yù)孵，通過(guò)損傷愈合試驗(yàn)，CCK8增殖試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞自噬在AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs遷移和增殖的作用。結(jié)果 AngⅡ刺激可引起VSMCs發(fā)生自噬，表現(xiàn)為L(zhǎng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1上調(diào)，且呈現(xiàn)明顯時(shí)間、劑量效應(yīng)(P<0.05)，10-7mol/L AngⅡ刺激24 h自噬最強(qiáng)。AngⅡ1型受體(AT1)阻滯劑(洛沙坦鉀)能抑制AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs的自噬(P<0.05)，而AngⅡ2型受體(AT2R)阻滯劑(PD123319)不能抑制AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs自噬(P>0.05)。自噬特異性阻斷劑3-MA能抑制AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs的遷移和增殖。結(jié)論 AngⅡ可通過(guò)AT1R誘導(dǎo)VSMCs發(fā)生自噬，從而促進(jìn)VSMCs遷移和增殖。

血管緊張素Ⅱ；自噬；血管平滑肌細(xì)胞；遷移；增殖

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是臨床常見(jiàn)疾病，是缺血性心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，臨床無(wú)特異性藥物治療[1]。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖與遷移的異常是引起AS的重要因素[2]。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的主要效應(yīng)分子可誘導(dǎo)多種炎癥因子，促進(jìn)VSMCs增殖和遷移[3-4]，參與AS的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。選擇性血管緊張素-1型受體(AT1)拮抗劑通過(guò)阻斷AngⅡ與AT1受體結(jié)合產(chǎn)生的一系列生物學(xué)活性物質(zhì)，從而抑制AS形成和發(fā)展[3]。近年來(lái)，自噬在心血管疾病方面研究取得進(jìn)展。目前研究更多關(guān)注自噬與心肌肥厚、心室重構(gòu)、心肌缺血/再灌注損傷的關(guān)系，而在自噬調(diào)控血管組成細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)歸研究甚少[5-6]。

本研究探討自噬在AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖的作用，為探究AngⅡ治療相關(guān)血管疾病提供新策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 鼠抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SM-actin)單克隆抗體(福建邁新生物技術(shù)公司)，AngⅡ(Sigma)，PD123319(Sigma)，兔抗人輕鏈3(LC3)多克隆抗體(美國(guó)Sigma)，兔抗人Beclin-1多克隆抗體，兔抗人β-actin多克隆抗體(美國(guó)SantaCrus)，3-甲基腺嘌呤(3-MA)(Sigma)，CCK-8試劑盒(碧云天)，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、趨化用微孔濾膜(孔徑8 μm，Sigma)。

1.2 大鼠培養(yǎng)及鑒定 健康Wistar大鼠，體重150 g～180 g，斷頸法處死后，無(wú)菌條件下迅速取下主動(dòng)脈，游離動(dòng)脈中層，采用組織貼壁法培養(yǎng)VSMCs。細(xì)胞呈VSMCs特征性“峰”“谷”狀生長(zhǎng)，特異性鼠抗人α-SM-actin免疫組織化學(xué)染色證實(shí)為VSMCs。實(shí)驗(yàn)用生長(zhǎng)旺盛的2代～5代VSMCs。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將血管平滑肌細(xì)胞隨機(jī)分組，AngⅡ刺激組：不同濃度AngⅡ(0 mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L、10-10mol/L)刺激VSMCs 24 h；AngⅡ刺激細(xì)胞不同時(shí)間組：10-7mol/L AngⅡ分別刺激VSMCs 0 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h；3-MA組：5 mmol/L 3-MA預(yù)孵育30 min后，加10-7mol/L AngⅡ刺激24 h；洛沙坦鉀+AngⅡ組：洛沙坦鉀預(yù)孵育30 min后，加10-7mol/L AngⅡ刺激24 h；PD123319+AngⅡ組：10-7mol/L PD123319預(yù)孵育30 min后，加10-7mol/L AngⅡ刺激24 h。

1.4 自噬標(biāo)志蛋白(LC3、Beclin-1)表達(dá) 采用Western blotting法檢測(cè)LC3、Beclin-1的表達(dá)，各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS(磷酸緩沖鹽溶液)洗滌細(xì)胞2次，每組細(xì)胞加入100 lRIPA裂解液(碧云天)(含1 mmol/L苯甲基磺酰氟)，冰上裂解30 min，4 ℃預(yù)冷離心機(jī)12 000 r/min離心5 min，收集上清液，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100 ℃變性5 min每組取30 g蛋白上樣，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，200 mA，30 min將蛋白電轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗(LC3B 1∶1000，Beclin-1 1∶500， β-actin 1∶500)4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次5 min，加二抗(HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG 1∶1000)室溫孵育1 h，洗滌緩(TBST)洗膜3次，每次5 min，發(fā)光液(ECL)顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，結(jié)果以目的蛋白/內(nèi)參的灰度比值表示。

1.5 增殖試驗(yàn) 制備實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)，每孔約100 μL細(xì)胞懸液，同樣樣本做3個(gè)重復(fù)。37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2 h～4 h。加入10 μL CCK8：由于每孔加入CCK8量較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來(lái)誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻?；蛑苯优渲煤?0%CCK8的培養(yǎng)基，以換液形式加入。培養(yǎng)1 h～4 h：細(xì)胞種類(lèi)不同，形成的Formazan量也不一樣。若顯色不夠，可繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)最佳條件。特別是血液細(xì)胞形成Formazan很少，需要較長(zhǎng)顯色時(shí)間(5 h～6 h)。測(cè)定450 nm吸光度：建議采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm～490 nm，參比波長(zhǎng)600 nm～650 nm。

1.6 遷移試驗(yàn) 細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融匯時(shí)減少胎牛血清濃度為0.4%繼續(xù)培養(yǎng)48 h，使VSMCs生長(zhǎng)靜止。相應(yīng)組別用3-MA預(yù)處理60 min后將細(xì)胞懸液(6×108個(gè)/L)加入上室，按不同組別分別與下室中加入AngⅡ、3-MA(總濃度2.4×108個(gè)/L)。37 ℃培養(yǎng)6 h后取出濾膜，固定，蘇木素染色，鏡下計(jì)數(shù)濾膜下層的細(xì)胞(×400)。每張濾膜由同一操作者鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)相鄰視野，相同來(lái)源VSMCs制作成4張獨(dú)立濾膜，均值代表遷移的細(xì)胞數(shù)(cells/HPF)。不同來(lái)源細(xì)胞系重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 AngⅡ誘導(dǎo)VSMCsLC3的表達(dá) 采用不同濃度(10-10mol/L～10-6mol/L)AngⅡ分別干預(yù)VSMCs 24 h后，通過(guò)Western blotting測(cè)定自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的變化。在一定范圍內(nèi)隨著劑量增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)增加(詳見(jiàn)圖1A)。在10-7mol/L濃度時(shí)達(dá)到峰值，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(詳見(jiàn)圖1B)。以10-7mol/L AngⅡ?yàn)楣潭舛却碳ぱ芷交〖?xì)胞，隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)，LC3-Ⅱ表達(dá)逐漸增強(qiáng)(詳見(jiàn)圖1C)，在24 h達(dá)到峰值，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(詳見(jiàn)圖1D)。

圖1 AngⅡ誘導(dǎo)VSMCsLC3的表達(dá)

2.2 AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs Beclin-1的表達(dá) 以10-7mol/LAngⅡ?yàn)楣潭舛却碳ぱ芷交〖?xì)胞，隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)，LC3-Ⅱ表達(dá)逐漸增強(qiáng)(詳見(jiàn)圖2A)，24 h達(dá)到峰值，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(詳見(jiàn)圖2B)。

圖2 AngⅡ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞Beclin-1蛋白的表達(dá)

2.3 AngⅡ受體(ATIR、AT2R)對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá) 采用AngⅡ 1型受體洛沙坦鉀(losartan)預(yù)孵育VSMCs 30 min，加入10-7mol/L AngⅡ刺激血管平滑肌細(xì)胞后，通過(guò)Western blotting法檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)。結(jié)果顯示，AngⅡ可明顯增加VSMCs的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)(P<0.01)；AT1R拮抗劑洛沙坦鉀可降低AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)，與AngⅡ刺激組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(詳見(jiàn)圖3)；AT2R拮抗劑PD123319不可降低AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)，與AngⅡ刺激組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(詳見(jiàn)圖4)。研究表明，AngⅡ誘導(dǎo)ASMC的自噬是通過(guò)ATIR介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。

2.4 自噬抑制劑(3-MA)在AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs遷移與增殖中的作用 未經(jīng)AngⅡ干預(yù)的VSMCs在基礎(chǔ)狀態(tài)下也存在著細(xì)胞遷移，但遷移細(xì)胞數(shù)量很少；給予AngⅡ10-7mol/L處理后顯著增加VSMCs跨膜遷移細(xì)胞數(shù)量(P<0.01)，用5 mmol/L 3-MA預(yù)孵育VSMCs，跨膜遷移細(xì)胞數(shù)量未見(jiàn)明顯增加(P>0.05)，隨后加入10-7mol/L AngⅡ刺激VSMCs 24 h后，與AngⅡ刺激組比較，3-MA抑制AngⅡ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞跨膜遷移細(xì)胞的數(shù)量，遷移細(xì)胞顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(詳見(jiàn)圖6)。同理，給予10-7mol/L AngⅡ處理后顯著增加VSMCs增殖細(xì)胞數(shù)量(P<0.01)，用5 mmol/L 3-MA預(yù)孵育VSMCs，增殖細(xì)胞數(shù)量未見(jiàn)明顯增加(P>0.05)，隨后加入10-7mol/L AngⅡ刺激VSMCs 24 h后，與AngⅡ刺激組比較，3-MA抑制AngⅡ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖細(xì)胞的數(shù)量，增殖細(xì)胞顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(詳見(jiàn)圖7)。表明自噬存在于AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs的遷移與增殖，且其自噬抑制劑對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs的遷移與增殖有抑制作用(詳見(jiàn)圖5)。

圖3 洛沙坦鉀對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的影響

圖4 PD123319對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCsLC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的影響

圖5 蘇木素染色圖

圖6 3-MA在AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs遷移的作用

圖7 3-MA在AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs增殖的作用

3 討 論

自噬作為維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制，通過(guò)對(duì)受損細(xì)胞器和老化蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進(jìn)行降解及再利用，為新蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞器更新提供原料，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，如選擇性地清除受損的可釋放促凋亡因子如細(xì)胞色素C的線粒體[7]，但過(guò)度自噬會(huì)導(dǎo)致自噬性程序性死亡增加。微管相關(guān)蛋白1LC3是公認(rèn)的標(biāo)記性自噬分子。在自噬發(fā)生過(guò)程中，LC3-Ⅰ被Atg7和Atg3在內(nèi)的泛素樣體系修飾和加工，產(chǎn)生相對(duì)分子質(zhì)量較小的LC3-Ⅱ，并定位到自噬小體中，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ變化可用來(lái)判斷自噬是否被誘導(dǎo)[4]。Beclin-1基因是近十多年來(lái)發(fā)現(xiàn)與自噬相關(guān)的一種抑癌基因，其參與自噬，調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡，Beclin-1蛋白是研究自噬的另一個(gè)標(biāo)志性蛋白。

VSMCs是構(gòu)成血管壁的主要細(xì)胞成分之一[4，8]，在動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展過(guò)程中，VSMCs的增殖與分化起重要作用[9-11]。當(dāng)出現(xiàn)高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、再狹窄等多種血管損傷性疾病時(shí)，VSMCs從血管中膜向內(nèi)膜遷移，并以自分泌、旁分泌形式分泌大量細(xì)胞因子和血管活性物質(zhì)，故VSMCs遷移與增殖是血管病變的細(xì)胞基礎(chǔ)病理改變之一[12]。AngⅡ作為RAS主要效應(yīng)分子。血管壁局部生成AngⅡ經(jīng)血管平滑肌細(xì)胞上AngⅡ1型受體(AT1R)直接作用于血管平滑肌細(xì)胞，強(qiáng)烈表達(dá)生物活性，促進(jìn)VSMCs增殖和遷移。

本研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ干預(yù)血管平滑肌細(xì)胞后出現(xiàn)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ向LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化，并呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性，24 h達(dá)最高峰，10-7mol/L濃度時(shí)達(dá)到峰值。Beclin-1在12 h表達(dá)上調(diào)，24 h達(dá)最高峰，提示AngⅡ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生自噬。AngⅡ通過(guò)與細(xì)胞膜上特異性受體結(jié)合而發(fā)揮作用，在人體中以AT1R和AT2R為主，本研究發(fā)現(xiàn)AT1R拮抗劑洛沙坦鉀可降低AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)，而AT2R則不能，表明AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs自噬通過(guò)AT1R介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。3-MA是P13K的抑制劑，被廣泛用作自噬的抑制劑，本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用3-MA可抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移與增殖，進(jìn)一步表明自噬存在于AngⅡ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞遷移與增殖，自噬抑制劑能抑制AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs的遷移與增殖，其自噬可通過(guò)AT1R介導(dǎo)調(diào)節(jié)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs的遷移和增殖，為探究影響自噬藥物治療AngⅡ相關(guān)血管疾病提供新策略。

自噬對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的作用是雙重的，既可能起到保護(hù)作用，又可能起到損傷作用。本課題是在體外細(xì)胞水平上研究自噬在血管平滑肌遷移和增殖的作用。本研究證實(shí)，AngⅡ可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞自噬明顯增加，并與時(shí)間和濃度呈依賴(lài)性。自噬抑制劑3-MA對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs遷移與增殖有抑制作用。提示自噬可能是AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs遷移與增殖的一個(gè)作用環(huán)節(jié)，可能通過(guò)調(diào)節(jié)自噬水平影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，其具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究和探索。

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(本文編輯薛妮)

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院(廣州 510120)

李建軍，E-mail：ljj1965wuan@126.com

R543 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.02.010

1672-1349(2017)02-0161-05

2016-03-22)

引用信息：侯祥平，陳柳丹，林玉潔，等.自噬在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖的作用[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(2)：161-165.