張俊玲+王培毅+續(xù)飛+魏燕+任濱+王軍

[摘要]目的探討塞來昔布抑制非小細(xì)胞肺癌腫瘤增殖及血管生成的效果。方法48只裸鼠建立非小細(xì)胞肺癌模型后，分為兩組，均使用含有塞來昔布的飼料喂養(yǎng)，觀察組則聯(lián)合使用濃度為100μmol/L的塞來昔布治療，持續(xù)120d后，比較兩組細(xì)胞增殖情況及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平和微血管密度。結(jié)果觀察組72h抑瘤率高于對(duì)照組（P<0.05），細(xì)胞凋亡染色率（TUNEL法）高于對(duì)照組（P<0.05），血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子整體水平低于對(duì)照組（P<0.05），微血管密度低于對(duì)照組。結(jié)論對(duì)非小細(xì)胞肺癌大鼠，使用100μmol/L塞來昔布治療能較好的抑制肺癌腫瘤細(xì)胞的增殖以及新生血管的形成，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑瘤率提高。

[關(guān)鍵詞]塞來昔布；非小細(xì)胞肺癌；腫瘤增殖；血管生成；實(shí)驗(yàn)研究

以往研究已經(jīng)證實(shí)，COX-2的表達(dá)與多種實(shí)體惡性腫瘤存在相關(guān)性，針對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者，其同樣呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，而且COX-2的高表達(dá)性，預(yù)示著腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲性以及早期的淋巴轉(zhuǎn)移傾向。其機(jī)制包括：促使腫瘤細(xì)胞的增殖抑制凋亡、促進(jìn)腫瘤組織新生血管的形成同時(shí)抑制機(jī)體免疫反應(yīng)等。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為非甾體抗炎藥物可在體內(nèi)及體外均起到抑制人非小細(xì)胞肺癌的增殖的作用，尤其是塞來昔布治療后，一般于4周左右，肺癌腫塊出現(xiàn)明顯縮小，其發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)間延長(zhǎng)，幾率降低。鑒于目前對(duì)于使用非甾體抗炎藥物輔助治療非小細(xì)胞肺癌尚無推薦劑量。本研究主要通過比較新型非甾體抗炎藥物一塞來昔布對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及對(duì)血管生成的影響，探討其治療非小細(xì)胞肺癌的臨床效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1材料及試劑來源

所選人肺腺癌A549細(xì)胞株購(gòu)置于上海微生物細(xì)胞研究所。所選塞來昔布由安徽合肥森瑞化工有限責(zé)任公司生產(chǎn)，Annexin V-FITC凋亡試劑盒由美國(guó)PharMingen公司提供，噻唑藍(lán)試劑由華美生物材料公司生產(chǎn)，DMEM培養(yǎng)基由美國(guó)GIBCO公司提供，細(xì)胞原位凋亡檢測(cè)試劑盒由美國(guó)瑞馳生物公司提供。二氧化碳孵育箱由美國(guó)NAPCOInternational Corporatio提供，倒置型電子顯微鏡由日本奧利巴斯公司提供，Epicsrxl型四色流式細(xì)胞儀由美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司提供，Mr5000型全自動(dòng)酶標(biāo)儀由美國(guó)Dynatech公司提供。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及建模

細(xì)胞培養(yǎng)首先將人肺腺癌A549細(xì)胞置于13%滅活小牛血清DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，于37℃5%二氧化碳及40%濕度條件恒溫箱內(nèi)，保持培養(yǎng)基內(nèi)青霉素和鏈霉素濃度控制在100U/mL。裸鼠建模：將含有2×10⁶細(xì)胞數(shù)的細(xì)胞懸液200μL分別注入6周齡裸鼠右前肢腋下，并將人組48只裸鼠進(jìn)行隨機(jī)分為兩組，每組各24只，并于接種腫瘤細(xì)胞后第2天開始服用藥物，均使用含有塞來昔布1250mg/kg的飼料喂養(yǎng)，連續(xù)喂養(yǎng)120d，喂養(yǎng)期間對(duì)裸鼠精神食欲及排便情況進(jìn)行觀察并記錄，每周對(duì)裸鼠體重及腫瘤大小進(jìn)行監(jiān)測(cè)。腫瘤體積計(jì)算（單位：mm3）=短徑²x長(zhǎng)徑/2，120d后使用空氣注射法處死裸鼠，對(duì)腫瘤結(jié)節(jié)稱重并測(cè)量其體積。

1.3塞來昔布對(duì)A549細(xì)胞增殖作用的影響

觀察組將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人肺腺癌A549細(xì)胞5x10³個(gè)/孔接種至96孔培養(yǎng)板內(nèi)，分別于24h及72h后，觀察組塞來昔布濃度為100μmol/L，加入助溶劑DMSO 5mL，對(duì)照組使用相同劑量的生理鹽水，培養(yǎng)液含有助溶劑DMSO 5mL，37℃40%濕度條件恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)4h，去除培養(yǎng)液后加入150μL助溶劑。使用全自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)定A 549nm值，計(jì)算兩組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（對(duì)照組A 549nm-觀察組A549nm）/對(duì)照組A 549nm]x100%。通過腫瘤結(jié)節(jié)重量計(jì)算抑瘤率：[1-（觀察組腫瘤結(jié)節(jié)質(zhì)量/對(duì)照組腫瘤結(jié)節(jié)質(zhì)量）1x100%。采用TUNEL法測(cè)定腫瘤細(xì)胞凋亡情況，并使用400倍高倍鏡觀察。

1.4兩組血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平及微血管密度檢測(cè)

均采用免疫組化實(shí)驗(yàn)SP法進(jìn)行，通過石蠟包埋并制備成厚4μm石蠟切片。分別進(jìn)行常規(guī)HE染色和光鏡檢查，以及脫蠟與水化處理，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子中免疫組化陽(yáng)性為棕黃色，測(cè)定并計(jì)算平均吸光度。微血管密度計(jì)數(shù)采用Tanaka法進(jìn)行，將腫瘤區(qū)內(nèi)染成棕黃色單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇視為1個(gè)血管計(jì)數(shù)，由低倍鏡下確定5個(gè)高血管密度區(qū)，并確定為1個(gè)“熱點(diǎn)”，于高倍鏡下計(jì)算被染成黃色微血管平均數(shù)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，兩組間均數(shù)的比較使用t檢驗(yàn)，組間率的比較采用x²檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組24h及72h抑瘤率比較

對(duì)照組24h抑瘤率為（7.20±2.58）%，72h抑瘤率為（11.35±3.74）%，觀察組24h抑瘤率為（34.15±12.41）%，72h抑瘤率為（65.31±15.38）%，觀察組24h及72h抑瘤率顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。見圖1。

2.2兩組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比較

觀察組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為（931±4.85）%，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為（2.59±1.18）%，觀察組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率高于對(duì)照組（P<0.05）。見圖2，表1。

2.3兩組微血管密度比較

觀察組微血管密度為（17.5±5.6）個(gè)/m㎡，對(duì)照組為（36.6±13.9）個(gè)/m㎡，觀察組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率低于對(duì)照組（P<0.05）。見圖3，表1。

3討論

環(huán)氧化酶主要是催化前列腺素類因子生成的限速酶，其包括COX-1與COX-2兩種形式。大量研究提示，COX-2的過度表達(dá)是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)因素。對(duì)肺癌患者的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌的腺癌患者中的COX-2表達(dá)最為強(qiáng)烈，而小細(xì)胞肺癌患者則幾乎未見COX-2的過度表達(dá)。提示在非小細(xì)胞肺癌，尤其是腺癌患者使用COX-2抑制劑，可能取得較好的臨床效果。

本研究結(jié)果提示，觀察組24h抑瘤率為（34.15±12.41）%，72h抑瘤率為（65.31±15.38）%，觀察組24h及72h抑瘤率顯著高于對(duì)照組，見圖1?？赡苁且?yàn)槭褂煤腥麃砦舨硷暳衔桂B(yǎng)的結(jié)果，但其效果遠(yuǎn)不及觀察組，分別于37℃培養(yǎng)基下培養(yǎng)24h和72h，發(fā)生兩組在24h的抑瘤率低于72h，且有效濃度者抑瘤率高于低濃度者。故可以認(rèn)為，塞來昔布對(duì)肺癌細(xì)胞增殖抑制效果，在藥物安全范圍內(nèi)，隨著藥物濃度增高而增強(qiáng)。在使用有效濃度的塞來昔布治療后，達(dá)到了抑制肺癌細(xì)胞增值的有效濃度，促使肺癌細(xì)胞阻滯在C0/G1期，通過TUNEL法檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)觀察組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為（9.31±4.85）%，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為（2.59±1.18）%，見圖2。提示觀察組其TUNEL法細(xì)胞凋亡染色率顯著高于對(duì)照組。出現(xiàn)以上結(jié)果可能的原因是，有效濃度塞來昔布治療將肺癌細(xì)胞增值阻滯于細(xì)胞周期的GO/G1期，同時(shí)更好的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)針對(duì)兩組微血管密度比較發(fā)現(xiàn)，觀察組微血管密度為（17.5±5.6）個(gè)/m㎡，對(duì)照組為（36.6±13.9）個(gè)/m㎡，觀察組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率低于對(duì)照組，見圖3。可考慮與塞來昔布對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制效果呈時(shí)間相關(guān)性有關(guān)，藥物使用時(shí)間越長(zhǎng)，其抑瘤率提高。其原因可能是，塞來昔布使用后將影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期，延緩肺癌細(xì)胞的快速增殖，促使其凋亡。而且使用塞來昔布后，有效的抑制了COX-2的過度表達(dá)，從而抑制了肺癌細(xì)胞的增殖，促使肺癌細(xì)胞凋亡。且COX-2的抑制后，體內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)水平降低，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)被降解，腫瘤相關(guān)的血管生長(zhǎng)因子表達(dá)顯著降低從而引起促進(jìn)肺癌組織血管形成、侵襲與轉(zhuǎn)移的活性降低，故使用塞來昔布后其微血管密度顯著降低。

綜上所述，對(duì)非小細(xì)胞肺癌大鼠，使用100μmol/L的塞來昔布治療，能較好的抑制肺癌腫瘤細(xì)胞的增殖以及新生血管的形成，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，能更好的提高其抑瘤率。