關(guān)曉月 錢 華 關(guān)永暉 古麗努爾·阿吾提

根尖周炎是口腔疾病中常見的細菌感染性疾病，多繼發(fā)于齲病及牙髓病，其病理主要表現(xiàn)為根尖周病變區(qū)牙槽骨炎性破壞[1]。高遷移率族蛋白盒1(high mobility group box 1,HMGB1)是一種非組蛋白染色體蛋白，廣泛分布于真核細胞的細胞核中，調(diào)節(jié)細胞分化、基因轉(zhuǎn)錄等[2]。HMGB1作為一種重要的晚期炎性介質(zhì)，對維持和延長機體內(nèi)炎癥反應(yīng)有重要的作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，當單核細胞及巨噬細胞受到內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide,LPS)刺激，可分泌產(chǎn)生有活性的HMGB1，并促其發(fā)揮炎癥細胞因子的作用[4]。HMGB1可少量表達于正常根尖周組織，然而，在炎癥根尖周組織中HMGB1的表達呈強陽性[5]。雌激素對全身骨代謝起著重要作用，雌激素能夠刺激成骨細胞制造骨基質(zhì)；當體內(nèi)雌激素水平降低時，破骨細胞的數(shù)量增多，活性增強，促進骨吸收。雌激素缺乏時，可加劇大鼠根尖周炎病變區(qū)炎性骨吸收[6]。近年來，有研究顯示，雌激素水平的改變可影響HMGB1的表達[7-9]。然而，當雌激素缺乏時，大鼠根尖周炎病變區(qū)炎性細胞浸潤及骨破壞程度的加劇，是否與HMGB1的表達變化相關(guān)，目前尚未可知。本次實驗擬通過建立卵巢去勢大鼠根尖周炎模型，觀察雌激素缺乏對大鼠根尖周炎模型中HMGB1表達的影響。

1.材料及方法

1.1 材料購置40只12-16周齡，體重200g-220g的健康雌性SD大鼠，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK(新)2015-0002。將大鼠隨機分為兩組，OVX組及SHAM組，每組20只。主要試劑：戊巴比妥鈉(Sigma,美國)，Trap試劑盒(Sigma,美國),HMGB1兔抗鼠多克隆抗體(Abcam,美國),二抗SP試劑盒及DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 卵巢摘除術(shù)所購置大鼠于同等環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。在兩名助手幫助下，向大鼠腹腔內(nèi)推入0.3%(3ml/kg)戊巴比妥鈉行全身麻醉，大鼠取仰臥位固定于手術(shù)臺，在腰肌與肋緣相交處備皮，常規(guī)消毒，縱向切開組織、切除卵巢，徹底止血，縫合。SHAM組僅切除卵巢周圍附著的卵巢大小脂肪組織，常規(guī)消炎，關(guān)閉腹腔。給予術(shù)后護理，定期補給飲用水及鼠糧，每日更換墊料。

1.2.2 根尖周炎模型制備及樣本處理

卵巢摘除術(shù)后一周[10]，行根尖周炎模型制備，麻醉方法同上。大鼠取仰臥位，固定四肢及上頜。使用1/2#球鉆對雙側(cè)下頜第一磨牙遠中窩處開髓，探及穿髓點后即停止，防止底穿，隨后將髓腔直接暴露于口腔環(huán)境中。髓腔開放后0d、7d、14d、21d時，OVX組及SHAM組均隨機挑選5只大鼠，全麻下內(nèi)眥靜脈取血3-5ml，分離下頜骨，脫頸處死。修整下頜骨并清理后，10%EDTA 4℃下緩慢脫鈣。二甲苯浸泡，常規(guī)梯度酒精脫水，正丁醇透明，石蠟包埋。對標本行頰舌向連續(xù)切片，切片厚約5um,以切至第一磨牙遠中根根尖孔為標準。對包含下頜第一磨牙遠中根尖孔的切片行HE染色、酶組織化學(xué)染色、免疫組織化學(xué)染色并分析結(jié)果。

1.2.3 血清雌激素水平檢測 大鼠腹內(nèi)眥靜脈血置入2mlEP管，4℃下，1000r/min離心20min,分離血清，放射免疫法檢測血清中雌激素水平。

1.2.4 HE染色 組織學(xué)染色時，OVX組及SHAM組于0d、7d、14d、21d時，各選取3個樣本，每樣本隨機選取3張切片行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察根尖周骨骨破壞范圍及炎性浸潤程度。

1.2.5 酶組織化學(xué)染色 抗酒石酸酸性磷酸酶(Trap)是破骨細胞特異的生化標志物[11]。各實驗分組于0d、7d、14d、21d隨機挑選出三個樣本。將所選標本置于60℃溫箱烤片1h，蒸餾水預(yù)熱，二甲苯I,II脫蠟，下行梯度酒精脫水，37℃下Trap染液孵育1h，蘇木素染色，細胞核返藍，封片。光鏡下觀察破骨細胞形態(tài)及數(shù)目。陰性對照使用PBS。

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色及分析 各實驗分組于0d、7d、14d、21d隨機挑選出三個樣本。各樣本置于二甲苯中常規(guī)脫蠟，梯度酒精入水，37℃下胃蛋白酶消化20min,消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗5min×3次，血清封閉，滴加一抗，HMGB1兔抗鼠多克隆抗體 (1∶500)，4℃過夜。滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。陰性對照以PBS代替一抗。

1.2.7 細胞計數(shù)及統(tǒng)計學(xué)分析 OVX組及SHAM組大鼠血清雌激素水平采用Graphpad軟件進行統(tǒng)計分析。對于Trap染色及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果，采用雙盲法在高倍視野下(400×)隨機選取根尖周病變區(qū)的5個視野對破骨細胞及HMGB1陽性細胞進行計數(shù)，計算平均值。數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組間比較采用方差分析和t檢驗，檢驗水準a=0.05。

2.結(jié)果

2.1 血清雌激素水平 SHAM組血清雌激素水平在實驗全程中處于較為穩(wěn)定，無明顯改變(-39.89±6.72pg/mL)；行雙側(cè)卵巢切除術(shù)的OVX組，術(shù)后第7d血清雌激素水平急劇降低，14d及21d時OVX組血清雌激素水平較7d組無明顯差異，穩(wěn)定保持在較低水平(-10.36pg±2.10pg/mL)。

2.2 組織學(xué)觀察 HE染色可觀察大鼠實驗性根尖周炎模型病變區(qū)骨缺損范圍及炎性細胞浸潤狀態(tài)。本次實驗中，髓腔開放0d時，大鼠下頜第一磨牙根尖周組織結(jié)構(gòu)完整，無炎性吸收及骨破壞。髓腔開放7d時，兩組模型根尖周組織可見以中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤，牙槽骨輕度吸收呈蟲蝕狀。髓腔開放14d時，兩實驗組下頜第一磨牙牙髓組織基本全部壞死，根尖周病變區(qū)多種炎性細胞浸潤加重，牙槽骨吸收較7d時進一步加重。髓腔開放后21d時，根尖周病變區(qū)炎癥進一步增強，出現(xiàn)以淋巴細胞及中性粒細胞為主的炎性細胞大面積浸潤，形成根尖膿腫，牙槽骨吸收于此時達到最大值。本實驗中，OVX組大鼠開髓后7d,14d及21d，其根尖周組織炎性細胞浸潤程度及牙槽骨破壞范圍均較SHAM組顯著。

圖1 根尖周組織HE染色及酶組織化學(xué)染色結(jié)果

2.3 酶組織化學(xué)染色結(jié)果 Trap陽性細胞胞質(zhì)呈深紅色/紫色，胞核呈藍色。在Trap染色中具有兩個或兩個以上細胞核的陽性細胞即為破骨細胞。Trap染色結(jié)果顯示，破骨細胞多分布于根尖周炎病變區(qū)骨破壞前沿。兩組大鼠開髓后0d,7d,14d及21d時，其根尖周病變區(qū)均可見破骨細胞的表達。破骨細胞數(shù)目自開髓后0-14d逐漸增多，并于14d時達到頂峰，21d時其數(shù)目發(fā)生減少。模型建立后0d，7d及14d時，OVX組破骨細胞數(shù)目較SHAM組增加顯著(P＜0.05)。

圖2 根尖周組織酶組織化學(xué)染色結(jié)果

2.4 HMGB1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，髓腔開放后0d，OVX組及SHAM組大鼠根尖周組織中均可少量表達HMGB1，且HMGB1主要分布于細胞核內(nèi)，輕微表達于細胞胞漿。大鼠髓腔開放后7d，HMGB1胞核著色的陽性細胞數(shù)數(shù)目增加，且細胞胞漿對于HMGB1的陽性表達顯著升高。開髓后14d,21d時，兩組大鼠根尖周炎病變區(qū)胞核著色陽性細胞數(shù)較7d時減少,但胞漿HMGB1陽性著色持續(xù)增多，且于21d時胞漿呈HMGB1陽性著色的細胞數(shù)目達到最大值。自根尖周炎模型建立起的7d,14d,21d,OVX組大鼠根尖周炎病變區(qū)HMGB1胞漿著色的陽性細胞數(shù)顯著高于SHAM組，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 根尖周組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×400)

3.討論

雌激素在全身骨代謝的過程中發(fā)揮了重要作用,雌激素的缺乏可通過調(diào)控IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-11,M-CSF,Prostaglandin E(PGE)等細胞因子促進破骨細胞的生成，促進骨吸收[12-15]。本次試驗對OVX組進行雙側(cè)卵巢切除，通過測量OVX組及SHAM組大鼠血清雌激素水平，判定成功建立大鼠雌激素缺乏模型，OVX組血清雌激素水平約為(-10.36pg±2.10pg/mL),SHAM組約為(-39.89±6.72pg/mL)。組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，隨時間推移，OVX組根尖周組織炎性細胞浸潤及骨破壞面積均較SHAM組顯著。另外，酶組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，血清雌激素水平的降低，可促進破骨細胞的形成及功能行使，大鼠開髓后0d、7d、14d時，OVX組根尖周組織破骨細胞數(shù)目明顯多于SHAM組(P＜0.05)。以上結(jié)果與Zhang et al.關(guān)于雌激素缺乏對大鼠根尖周炎的作用的描述相一致[16]。

HMGB1作為一種DNA伴隨因子存在于多種真核細胞的細胞核中，當機體發(fā)生細胞損傷、壞死及炎癥時，HMGB1可從細胞核中脫離進入胞質(zhì)中，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[18]。HMGB1與多種促炎因子之間存在相互影響，如采用LPS，IL-1β、TNF-α刺激巨噬細胞及單核細胞時，可促進HMGB1的產(chǎn)生，而當使用HMGB1刺激巨噬細胞及單核細胞，亦可加強IL-1β、IL-6、TNF-α的產(chǎn)生[3,4]。此外,HMGB1的產(chǎn)生及分泌與骨組織改建存在一定聯(lián)系，破骨細胞及成骨細胞中均可檢測到HMGB1的表達[19]。研究人員證實，HMGB1不僅可通過結(jié)合RANKL DNA序列上調(diào)TNF-α轉(zhuǎn)錄，另外亦促使低于閾值濃度的RANKL誘導(dǎo)破骨細胞生成[20,21]。根尖周炎作為口腔常見炎性骨吸收疾病，HMGB1參與了其發(fā)生發(fā)展過程[5,22]。本文通過免疫組織化學(xué)染色觀察HMGB1在大鼠根尖周炎病變區(qū)的表達，SHAM組大鼠根尖周炎病變區(qū)HMGB1的表達結(jié)果與賈彤彤等一致[22]，即自開髓后0-21d，大鼠根尖周胞質(zhì)染色的HMGB1陽性細胞數(shù)逐漸增加，于21d時達到最大值。OVX組大鼠于髓腔暴露后7d、14d及21d時，其根尖周HMGB1陽性細胞數(shù)較SHAM組明顯增高，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，本研究證實雌激素缺乏可增強大鼠根尖周病變區(qū)HMGB1的表達。

雌激素對于HMGB1的作用已在研究中得以探討，Gonda等人發(fā)現(xiàn)HMGB1可通過與雌激素受體的結(jié)合，增強雌激素效應(yīng)[23]。此外，使用雌激素刺激雌激素敏感細胞時，可觀察到其細胞周期動力學(xué)分布異常，同時伴有HMGB1的高表達[7,8]。本文僅通過免疫組織化學(xué)染色證實雌激素缺乏可影響大鼠根尖周炎病變區(qū)HMGB1的表達，未說明雌激素缺乏是通過何種途徑調(diào)控HMGB1的表達。此外，大鼠根尖周炎病變區(qū)HMGB1表達與其它炎性因子，如TNF-α,IL-1β及IL-6等之間的交互作用亦未得到開展研究。

[1] Zhang XL,Peng B.Immunolocalizaiton of receptor activator of NF Kappa B ligand in rat periapical lesions[J].J Endod,2005,31(8):574-577

[2] Yanai H,Ban T,Wang Z,et al.HMGB1 proteins function as universal sentinels for nucleic-acid-mediated innate immune responses[J].Nature,2009,462(7269):99-103

[3] Yang R,Zou X,Tenhunen J,et al.HMGB1 and extracellular histones significantly contribute to systemic infalmmation and multiple organ failure in acute liver failure[J].Mediators Inflamm,2017,2017:5928078

[4]ChaochaoQ,Lou G,Yang Y,et al.Macrophageinflammatory protein-2in high mobility group box1secretion of macrophage cells exposed to lipopolysaccharide[J].CellPhysiol Biochem,2017,42(3):913-928

[5] Lingshuang L,Jing D,Qiuxia J,et al.High-mobility group box 1 is associated with the inflammatory infiltration and alveolar bone destruction in rats experimental periapical lesions[J].J Endod,2017,43(6):964-969

[6]關(guān)曉月,錢 華,邊 專.雌激素缺乏對大鼠根尖周炎病變區(qū)TLR4表達的影響[J].口腔醫(yī)學(xué)研究,2015,31(8):788-791

[7] Shin JU,Noh JY,Lee JH,et al.In vivo relative quantitative proteomics reveals HMGB1 as a down stream mediator of oestrogen stimulated keratinocyte migration[J].Exp Dermatol,2015,24(6):478-80

[8] Zenclussen A C,Gerlof K,Zenclussen M C,et al.Abnormal T cell reactivity against paternal antigens in spontaneous abortion:Adoptive transfer of pregnancy-induced CD 4+CD 45+T regulatory cells prevents fetal rejection in a m urine abortion model[J].Am J Pathol,2005,166(3):811-822

[9] 青 松,牛國志,袁理想,等.17-β雌二醇對HMGB1過表達THP1細胞的細胞周期進程的影響[J].中國免疫學(xué)雜志,2011,7(21):620-629

[10]Liu S,Cheng Y,Xu W,et al.Protective effects of folliclestimulating hormone inhibitor on alveolar bone loss resulting from experimental periapical lesions in ovariectomized rats[J].J Endod,2010,36(4):658-63

[11]Minkin C.Bone acid phosphatase:tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function[J].Calcif Tissue Int,1982,34(3):285-290

[12]Youssef H,Stashenko P.Interleukin-1 and estrogen protect against disseminating dentoalveolar infections[J].Int J Oral Sci,2017,9(1):16-23

[13]Li JY,Adams J,Calvi M,et al.Ovariectomy expands murine short-term hemopoietic stem cell function through T cell expressed CD40L and Wnt10β[J].Blood,2013,122(14):2346-57

[14]Harada S,Tominari T,Matsumoto C,et al.Nobiletin a polymethoxy flavonoid suppresses bone resorption by inhibiting NF-κB-dependent prostaglandin E synthesis in osteoblasts and prevents bone loss due to estrogen deficiency[J].J Pharmacol Sci,2011,115(1):89-93

[15]Spelsberg TC,Subramaniam M,Riggs BL,et al.The actions and interactions of sex steroids and growth factors/cytokines on the skeleton[J].Mol Endocrinol,1999,13(6):819-828

[16]Xiaolei Z,Bin P,Mingwen F,et al.The effect of estrogen deficiency on receptor activation of nuclear factor kappa B ligand and osteoprotegerin syntesis in periapical lesions induced in rats[J].J Endod,2007,33(9):1053-1056

[17]Goodwin GH,Johns EW.Isolation and characterization of two calf-thymus chromation non-histone proteins with high contents of acidic and basic amino acids[J].Eur J Biochem,1973,40(1):215-219

[18]Lin CW,Chou YE,Yeh CM,et al.A functional variant at the miRNA binding site in HMGB1 gene is associated with risk of oral squamous cell carcinoma[J].Oncotarget,2017,8(21):34630-34642

[19]Zhou Z,Xiong WC.RAGE and its ligands in bone metabolism[J].Front Biosci(School Ed),2011,3:768-776

[20]Yamoah K,Brebene A,Baliram R,et al.High-mobility group box proteins modulate tumor necrosis factor-alpha expression in osteoclastogenesis via a novel deoxyribonucleic acid sequence[J].Mol Endocrinol,2008,22(5):1141-1153

[21]Zhou Z,Han JY,Xi CX,et al.HMGB1 regulates RANKL induced osteoclastogenesis in a manner dependent on RAGE[J].J Bone Miner Res,2008,23(7):1084-1096

[22]賈彤彤.大鼠根尖周炎中HMGB1及其受體RAGE表達的初步研究[D].口腔內(nèi)科學(xué)，首都醫(yī)科大學(xué),2012

[23]MoriyamaG N,Shiina H,Terashima M,et al.Rationale and clinical implication of combined chemotherapy with cisplatin and oestrogen in prostate cancer:primary evidence based on methylation analysis of oestrogen receptor-alpha[J].BJU Int,2008,101(4):485-491