李伯翰 鄂玲玲 謝 瀟 劉洪臣

周圍神經(jīng)損傷的主要原因常見于外傷、產(chǎn)傷、骨發(fā)育異常、鉛和酒精中毒等引起受該神經(jīng)支配的區(qū)域出現(xiàn)感覺障礙、運(yùn)動(dòng)障礙和營養(yǎng)障礙。周圍神經(jīng)損傷后病理生理相當(dāng)復(fù)雜，受損神經(jīng)再生緩慢且容易與周圍組織形成粘連，損傷后可導(dǎo)致神經(jīng)支配區(qū)域功能障礙或喪失，并且患者會(huì)承受持續(xù)的病理性疼痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。但迄今為止，周圍神經(jīng)壓榨或橫斷后,神經(jīng)損傷蛋白質(zhì)微觀變化及其與神經(jīng)再生的關(guān)系研究較少,知之甚微。本研究旨在通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究，檢測面神經(jīng)鉗夾損傷后的大鼠面神經(jīng)與正常大鼠面神經(jīng)的差異蛋白。為面神經(jīng)損傷治療，提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 主要儀器 Eppendorf冷凍離心機(jī)(Eppendorf，美國)；IPGhor等電聚焦儀(GE Healthcare，美國)；DYY-6C電泳儀(DYY-6C，中國)；Biotek酶標(biāo)儀(H4MFPTAD，中國)；ImageMaster 5.0分析軟件(天能，中國)；電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.2 主要試劑 Tris飽和酚(索萊寶，中國)；30%丙烯酰胺溶液、尿素、丙基硫酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、二硫蘇糖醇，十二烷基硫酸鈉、溴酚藍(lán)、甘氨酸、四甲基乙二胺、苯甲基磺酰氟、碘乙酰胺、乙腈(Bio-Rad公司，美國)；硫脲、甲醇，0.25%硝酸銀(北京化學(xué)試劑公司)；胰蛋白酶(Sigma，美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型建立及大鼠面神經(jīng)組織獲取健康成年雄性SD大鼠6只，體重300-350g之間，購自解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，隨機(jī)分為2組，實(shí)驗(yàn)組(面神經(jīng)鉗夾損傷組)和對照組，每組各3只(n=3)。面神經(jīng)鉗夾損傷組手術(shù)方法：1%戊巴比妥鈉(1mL/300g)全身麻醉后，無菌條件下側(cè)外耳道下作弧形切口,切開皮膚,皮下組織,在咬肌表面筋膜處分離暴露面神經(jīng)頰支,蚊式血管鉗單齒(血管鉗單齒寬度約2mm，即損傷長度為2mm)鉗夾，持續(xù)30秒。即建立大鼠面神經(jīng)鉗夾損傷模型為外周神經(jīng)損傷研究中的Sunderland II損傷(圖1A)。于術(shù)后24小時(shí)，取損傷部分面神經(jīng)。對照組：取正常面神經(jīng)頰支一段。

1.3.2 組織形態(tài)學(xué)觀察 切下包括鉗夾傷部位在內(nèi)的上下各5mm坐骨神經(jīng)干，隨即浸入10%甲醛過夜固定，經(jīng)酒精梯度脫水后，石蠟包埋，4μm切片，蘇木精－伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察形態(tài)。

1.3.3 大鼠面神經(jīng)提取及定量 取適量的樣本加入0.4mL的蛋白裂解液；超聲破碎2秒/次，間隔10秒，共5次，整個(gè)操作在冰上進(jìn)行；冰上靜置20分鐘。超聲破碎物4℃，10000g離心30分鐘，取上清轉(zhuǎn)入新管；即我們提取的蛋白液并于-80℃冰箱保存。蛋白裂解液配方：8.0M脲、100mM Tris-HCl(pH 8.0)、1X蛋白酶抑制劑。將最終的蛋白總量遞減為 0μg、2.5μg、5μg、10μg、15μg、20μg和25μg，同一個(gè)蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測點(diǎn)兩個(gè)；總體積為25μl。以此將每一分被檢測的樣本1ul，與24ul水混合；按照比例50∶1混勻BCA試劑，每管加入200μl均勻混合，對比檢測酶標(biāo)板；37℃保溫30分鐘后室溫靜置5分鐘，肉眼觀察是否存在紫色的梯度，如果梯度不明顯，終止下一步檢測；用酶標(biāo)儀檢測，波長562nm；根據(jù)檢測結(jié)果，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，如果相關(guān)性R＜0.90，標(biāo)準(zhǔn)曲線不能用于計(jì)算，重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推導(dǎo)出檢測蛋白的總量，并計(jì)算相應(yīng)濃度。

1.3.4 質(zhì)譜分析 第一步：毛細(xì)管高效液相色譜，首先將每份樣品放入納升甲醇-HPLC(50102；4L；迪馬科技)流速HPLC液相系(ultimate3000，美國)統(tǒng)Ultimate 3000進(jìn)行分離。配置緩沖液：0.1%甲酸水溶液，0.08%甲酸乙腈水溶液(乙腈占80%)。色譜柱以95%的0.1%甲酸水溶液平衡。樣品自動(dòng)進(jìn)樣到質(zhì)譜預(yù)柱C18 trap column(C18 3mm 0.10×20mm)，再通過分析柱 C18 column(C18 1.9mm 0.15×120mm)分離，流速為600nl/min。第二步，質(zhì)譜鑒定，經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后的每份樣品用Q-Exactive HF質(zhì)譜儀(Thermo Scientific)進(jìn)行質(zhì)譜分析。本實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜分析委托北京邦菲生物技術(shù)服務(wù)有限公司技術(shù)人員在國家蛋白質(zhì)研究中心完成。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 首先原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析，將RAW文件利用軟件Mascot和ProteomeDiscoverer(thermo)進(jìn)行查庫鑒定及定量分析。本次數(shù)據(jù)分析所選用的數(shù)據(jù)庫為uniprot-rat_160701fasta，Mascot軟件版本為Mascot2.1。查庫時(shí)先將RAW文件通過Proteome Discoverer提交至Mascot服務(wù)器，選擇已經(jīng)建立好的數(shù)據(jù)庫，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索分析。

1.3.6 SDS-PAGE電泳 各取蛋白質(zhì)樣品25μg按照5∶1(v/v)加入5X上樣緩沖液，沸水浴5min，14000g離心10min取上清，12%SDSPAGE電泳。電泳參數(shù)設(shè)置：恒流：14mA，電泳時(shí)間90min；考馬斯亮藍(lán)染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用x±s表示，采用SPSS15.0軟件對2組蛋白質(zhì)豐度比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有顯著性。

2.結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學(xué)觀察 手術(shù)過程見圖1A，HE染色形態(tài)學(xué)觀察顯示，損傷組大鼠面神經(jīng)損傷區(qū)神經(jīng)纖維較細(xì)，相對松散，數(shù)目少，排列紊亂、不規(guī)則，髓鞘較薄，部分神經(jīng)纖維未見髓鞘和軸突(圖1B、圖 1C)。

2.2 電泳結(jié)果 蛋白條帶清晰，完整，1-3為實(shí)驗(yàn)組，4-6為對照組，每一組選取三個(gè)重復(fù)樣本。從上述電泳結(jié)果分析，蛋白在14-120kDa范圍內(nèi)得到有效分離。

圖1 大鼠坐骨神經(jīng)染色結(jié)果(HE×200)

圖2 電泳圖

2.3 差異候選蛋白質(zhì)的MALDI-TOF/TOF分析及數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果 見附表。

3.討論

蛋白質(zhì)組學(xué)是在整體水平上研究細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及變化規(guī)律的科學(xué)。與傳統(tǒng)的生物學(xué)研究相比具有快速、靈敏、高通量的優(yōu)點(diǎn)。蛋白質(zhì)組學(xué)在神經(jīng)系統(tǒng)中的研究還相對主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病。然而目前，對于外周神經(jīng)損傷后修復(fù)機(jī)制蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究還相對較少，對面神經(jīng)損傷蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究還未見報(bào)道。

外周神經(jīng)損傷后，其再生過程可以分為3個(gè)階段：(1)液體充盈期：外周神經(jīng)損傷第一天，微環(huán)境中營養(yǎng)神經(jīng)和軸突支持活性的液體充滿導(dǎo)管內(nèi)腔；(2)基質(zhì)橋(血纖維橋)形成期：持續(xù)時(shí)間大約為1周，從受損神經(jīng)兩端的成纖維細(xì)胞沿基質(zhì)橋滲透，同時(shí)受損神經(jīng)遠(yuǎn)端發(fā)生Wallerian變性，為軸突再生提供有利的修復(fù)微環(huán)境；(3)細(xì)胞遷移期：雪旺細(xì)胞(Schwann-cell)沿基質(zhì)橋遷移；軸突沿基質(zhì)橋從近端向遠(yuǎn)端延伸；2-8周后；雪旺細(xì)胞髓鞘化[1,2]。大鼠面神經(jīng)鉗夾損失后，修復(fù)過程同樣經(jīng)歷如上三個(gè)修復(fù)時(shí)期。本實(shí)驗(yàn)中選取Sunderland II類外周神經(jīng)損傷模型。鉗夾損傷后2天后，取面神經(jīng)做蛋白質(zhì)組學(xué)研究，即外周神經(jīng)損傷的第二期：基質(zhì)橋(血纖維橋)形成期。

附表 質(zhì)譜鑒定的20個(gè)差異蛋白質(zhì)信息表

我們通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析鉗夾損傷后大鼠面神經(jīng)和正常大鼠面神經(jīng)的差異，發(fā)現(xiàn)在大鼠面神經(jīng)損傷后有19個(gè)蛋白表達(dá)發(fā)生顯著變化，8個(gè)上調(diào)蛋白，11個(gè)下調(diào)蛋白。這些蛋白主要按照功能分類主要參與細(xì)胞組成、分子功能和生物過程三部分。在這些蛋白中，結(jié)合珠蛋白Haptoglobin簡稱Hp，Hp的主要存在形式是與紅細(xì)胞中釋出的自由形式存在，并與血紅蛋白相結(jié)合，每一分子的Hp可以與兩分子的Hp不可逆性結(jié)合，發(fā)生結(jié)合作用后，復(fù)合物將在幾分鐘之內(nèi)迅速轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟組織，由于肝細(xì)胞上的特異性受體，可以有效地結(jié)合，并以Hp-Hb復(fù)合物進(jìn)入肝細(xì)胞后降解，氨基酸和鐵可被機(jī)體再利用。因此Hp可以防止Hb從腎丟失而為機(jī)體有效地保留鐵。結(jié)合珠蛋白量的變化可提示腎臟，肝臟心血管等疾病的病理變化[3]。在大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Hp與游離的Hb結(jié)合形成Hp-Hb復(fù)合物后科通過親道夫受體cd163結(jié)合，經(jīng)內(nèi)吞作用促進(jìn)Hb清楚，減少Hb相關(guān)的毒性反應(yīng)。Hp缺乏時(shí)會(huì)使大腦中樞系統(tǒng)損傷惡化，Hp低表達(dá)式加劇腦損傷，二HP的過渡表達(dá)則減輕腦損傷[4]。本試驗(yàn)研究，鉗夾損傷后的面神經(jīng)中結(jié)合珠蛋白上調(diào)，提示大鼠面神經(jīng)損傷后，結(jié)合珠蛋白合成增加，對中樞神經(jīng)及外周神經(jīng)疾病的診斷及疾病的預(yù)后很大幫助。

Tropomyosin原肌球蛋白(TPM)是肌肉收縮過程中一種重要的調(diào)節(jié)蛋白，以多種異構(gòu)體形式廣泛存在于各種真核細(xì)胞中，并完成體內(nèi)較多生命活動(dòng)。其所編碼的基因突變與多種肌病的發(fā)生有關(guān)。TPM4基因只能編碼一種同源體，即成纖維細(xì)胞TPM4，可穩(wěn)定F-肌動(dòng)蛋白。在神經(jīng)系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)軸突的生長和突觸可塑性相關(guān)，并在未成熟的神經(jīng)元中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平，提示TPM4可能參與了神經(jīng)修復(fù)機(jī)制[5-7]。本實(shí)驗(yàn)中，TMP蛋白上調(diào)，啟動(dòng)并參與了神經(jīng)修復(fù)機(jī)制，促進(jìn)損傷后的面神經(jīng)軸突生長和突觸可塑性增強(qiáng)。

Neurofilament神經(jīng)絲蛋白屬于復(fù)雜的中間絲蛋白多基因家族成員，是神經(jīng)元特異蛋白和細(xì)胞骨架的主要成分，在成熟的軸突中提供彈性使神經(jīng)纖維易于伸展和防止斷裂，起著進(jìn)行性穩(wěn)定細(xì)胞骨架的作用，主要存在于大直徑的有髓神經(jīng)纖維中。由三種特定的蛋白亞基(NF-L，NF-M，NL-H)組裝而成。三種類型的亞單位均含有一個(gè)有310氨基酸的螺旋桿狀區(qū)，一個(gè)球形的氨基(N-)頭端及羧基(C-)端側(cè)壁投射是神經(jīng)細(xì)胞骨架的主要成分，占蛋白重量的80%以上。本實(shí)驗(yàn)中Neurofilament面神經(jīng)損傷后該蛋白下調(diào)，即有髓神經(jīng)纖維Neurofilament蛋白降低軸突斷裂，細(xì)胞骨架穩(wěn)定功能降低。

Periaxin蛋白位于雪旺細(xì)胞中并特異性表達(dá)的支架蛋白。雪旺細(xì)胞包裹軸突形成髓鞘過程中，Periaxin蛋白的主要作用是：調(diào)節(jié)髓鞘的延展長度與修復(fù)受損髓鞘、改變調(diào)節(jié)軸突直徑大小并及時(shí)傳遞細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)。Puentes報(bào)道Periaxin蛋白的缺失或突變,將破壞外周神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)纖維的聚集,從而引發(fā)脫髓鞘型腓骨肌萎縮癥發(fā)生。還可作為成纖維細(xì)胞膜的骨架蛋白,在跨膜信號(hào)傳遞、營養(yǎng)物質(zhì)輸送等過程中發(fā)揮作用。Periaxin蛋白編碼兩種長短不同的periaxin蛋白：L-periaxin亞蛋白和S-periaxin亞蛋白。L-periaxin包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端PDZ結(jié)構(gòu)域、核定位信NLS結(jié)構(gòu)域、重復(fù)區(qū)域以及C端酸性區(qū)域；S-periaxin只包含PDZ結(jié)構(gòu)域[8]。

Periaxin蛋白參與周圍神經(jīng)纖維和細(xì)胞支架作用的蛋白，參與并調(diào)控周圍神經(jīng)纖維發(fā)育的早期階段。Periaxin蛋白參與雪旺細(xì)胞外周神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘化表達(dá)，但是該蛋白在中樞神經(jīng)的軸突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)，也未整合到致密的髓鞘中。1995年Scherer等[9,10]研究發(fā)現(xiàn)，在外周神經(jīng)的發(fā)育過程中，periaxin蛋白主要起到重新定位亞細(xì)胞的作用，在髓鞘未成熟期，該蛋白主要集中在近軸突膜處，而在髓鞘成熟期，該蛋白相對集中于質(zhì)膜處而遠(yuǎn)離軸突膜。我們可以從periaxin的分布、結(jié)構(gòu)與功能開展研究,尋找與其相互作用的蛋白質(zhì)并揭示其互作的生物學(xué)意義,從蛋白質(zhì)水平上研究周圍神經(jīng)的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

面神經(jīng)損傷是口腔頜面外科的常見病,患者會(huì)出現(xiàn)口眼歪斜、患側(cè)面部麻木、眼瞼閉合不全、面部表情功能減弱。嚴(yán)重影響患者面部功能、社會(huì)功能和心理健康。雖然修復(fù)面神經(jīng)損傷的方法多種多樣,但修復(fù)的效果并不理想，常伴有面肌痙攣、聯(lián)帶運(yùn)動(dòng)等并發(fā)癥。本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)面神經(jīng)鉗夾損傷大鼠面神經(jīng)與正常大鼠面神經(jīng)組織的差異蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)面神經(jīng)損傷大鼠面神經(jīng)組織存在的自身缺陷，為面神經(jīng)損傷術(shù)后治療提供研究的新靶點(diǎn)。

[1] Li GS,Li QF,Dong MM,et al.Complement components of nerve regeneration conditioned fluid influence the microenvironment of nerve regeneration[J].Neural Regen Res,2016,11(4):682-686

[2]呂新生,李新營，肖志強(qiáng)，等.大鼠橫斷性損傷坐骨神經(jīng)后近端神經(jīng)干分泌液的蛋白質(zhì)組學(xué)分析和生物活性檢測[J].中國普通外科雜志,2004(7):517-522

[3]閆晶晶.Cohn組分Ⅳ中結(jié)合珠蛋白的純化與鑒定[J].廣西醫(yī)科大學(xué)，2016(8)：85

[4]毛 群，張建寧.結(jié)合珠蛋白基因型與自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣[J].國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志,2012(3):254-256

[5] Moroz N,Guillaud L,Desai B et al.Mutations changing tropomodulin affinity for tropomyosin alter neurite formation and extension[J].Peer J,2013(1):7-14

[6] Guven K,Guven K,Gunning P.TPM3 and TPM4 gene products segregate to the postsynaptic region of central nervous system synapses[J].Bioarchitecture,2011(6):284-289

[7]周 碩，魯 正，吳 華，等.原肌球蛋白的功能與相關(guān)疾病的研究進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2016(11):1601-1604

[8] Puentes F,Van BJ,Boomkamp SD,et al.Neurofilament Light as an Immune Target for Pathogenic Antibodies[J].Immunology,2017[Epub ahead of print]

[9] Scherer SS,Xu YT,Xu YT et al.Periaxin expression in myelinating Schwann cells:modulation by axon-glial interactions and polarized localization during development[J].Development,1995(12):4265-4273

[10]Kim S,Maynard JC,Sasaki Y,et al.Schwann Cell O-Glc-NAc Glycosylation Is Required for Myelin Maintenance and Axon Integrity[J].J Neurosci.2016(37):9633-9646