王萌影 彭麗敏 苑程鯤 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科 （黑龍江 哈爾濱 150040）

DNA測(cè)序技術(shù)及其在婦產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用

王萌影 彭麗敏 苑程鯤＊黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科 （黑龍江 哈爾濱 150040）

DNA測(cè)序技術(shù)即基因測(cè)序技術(shù)，它推動(dòng)了生物學(xué)的發(fā)展，并將對(duì)婦產(chǎn)領(lǐng)域的進(jìn)步具有極大的推進(jìn)作用。該技術(shù)現(xiàn)廣泛應(yīng)用于染色體非整倍體如21、18和13三體綜合征篩查，精確排查流產(chǎn)的遺傳學(xué)因素，用于胚胎植入前篩查與診斷，極大地提高了試管嬰兒的移植率及妊娠率，日后必將在染色體微缺失/微重復(fù)及單基因病的產(chǎn)前遺傳篩查方面具有更大價(jià)值體現(xiàn)。文章對(duì)DNA測(cè)序技術(shù)及其在婦產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用做一綜述，旨在為產(chǎn)科應(yīng)用尤其在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域更好應(yīng)用這一技術(shù)提供借鑒，并在為患者提供個(gè)體化治療等方面提供更為合適的臨床方案參考。

DNA測(cè)序技術(shù) 婦產(chǎn)科 遺傳篩查

DNA，即脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid）又稱去氧核糖核酸，其主要功能是長(zhǎng)期性的信息儲(chǔ)存，有學(xué)者將此功能比喻為生物發(fā)育和運(yùn)作的“藍(lán)圖”，引導(dǎo)生物發(fā)育與生命機(jī)能運(yùn)作。DNA測(cè)序技術(shù)即基因測(cè)序技術(shù)，它推動(dòng)了生物學(xué)的發(fā)展，在婦產(chǎn)領(lǐng)域，目前廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前篩查、精確排查流產(chǎn)的遺傳學(xué)因素、胚胎植入前篩查與診斷等方面，未來在該領(lǐng)域必定具有更大的意義及推進(jìn)作用。

1.DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史

DNA是一種最重要的生命基礎(chǔ)分子。帶有遺傳訊息的DNA片段稱為基因，其他的DNA序列，有些直接以自身構(gòu)造發(fā)揮作用，有些則參與調(diào)控遺傳信息的表達(dá)。DNA是一種長(zhǎng)鏈聚合物，由核苷酸重復(fù)排列組成，組成DNA的核苷酸分四種，分別是腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）。通常在生物體內(nèi)，DNA并非單一分子，而是形成兩條互相配對(duì)并緊密結(jié)合的雙螺旋結(jié)構(gòu)的分子。使成對(duì)的兩條DNA相互結(jié)合的另一部分稱為堿基，組成生物界DNA的堿基主要有四種，分別稱為A、T、C、G，這些堿基沿著DNA長(zhǎng)鏈排列所形成的序列，即是遺傳信息。DNA測(cè)序技術(shù)（DNA Sequencing Technology），又稱基因測(cè)序技術(shù)，就是一項(xiàng)對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行堿基序列測(cè)定，并進(jìn)行各種相關(guān)分析的技術(shù)，如對(duì)突變進(jìn)行定位和鑒定比較。從20世紀(jì)70年代至今，DNA測(cè)序技術(shù)已歷經(jīng)4代，即被稱為DNA測(cè)序始祖的第1代測(cè)序技術(shù)、邊合成邊測(cè)序的第2代測(cè)序技術(shù)、不依賴于PCR擴(kuò)增的第3代測(cè)序技術(shù)，以及被稱為納米孔測(cè)序技術(shù)的第4代測(cè)序技術(shù)[1,2]。

第一代基因測(cè)序技術(shù)誕生于1977年，是由美國(guó)生物化學(xué)家Maxam和Gilbert發(fā)明的化學(xué)降解法測(cè)序。同年，英國(guó)生物化學(xué)家Sanger發(fā)明了雙脫氧末端終止法，即至今廣泛應(yīng)用的Sanger測(cè)序法。這一技術(shù)的應(yīng)用使科學(xué)家于2001年完成了首次人類全基因的測(cè)序工作。Sanger后來將此測(cè)序法進(jìn)行許多改進(jìn)，并為后來的大規(guī)模測(cè)序提供了技術(shù)支持[3,4]。上世紀(jì)90年代初出現(xiàn)的熒光自動(dòng)測(cè)序技術(shù)逐步代替了雙脫氧末端終止法，并且將DNA測(cè)序帶入自動(dòng)化測(cè)序時(shí)代。而后的第二代測(cè)序技術(shù)較之第一代，進(jìn)步主要體現(xiàn)在高通量與低成本上。突破第二代測(cè)序瓶頸的結(jié)果，是科學(xué)家們最終發(fā)現(xiàn)了單分子的測(cè)序技術(shù)，即基于單分子水平的邊合成邊測(cè)序技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了單分子納米級(jí)別的測(cè)量，被稱為第三代測(cè)序技術(shù)。第三代測(cè)序技術(shù)的最大特點(diǎn)就是測(cè)序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有著更快的數(shù)據(jù)讀取速度，在使用時(shí)，人們只需要提供唾液、毛發(fā)、血液等含有生命物質(zhì)的物品，并且，測(cè)序之前的樣品制備不需要單獨(dú)準(zhǔn)備。這是多領(lǐng)域、多個(gè)學(xué)科共同努力、深度交叉的成果。在我國(guó)由南科大研發(fā)的GenoCare基因測(cè)序儀通量和準(zhǔn)確度兩個(gè)方面都達(dá)到世界領(lǐng)先，在30x測(cè)序深度下其準(zhǔn)確率達(dá)99.9%。第四代測(cè)序技術(shù)不再利用光信號(hào)，也不再需要經(jīng)生物或化學(xué)手段預(yù)處理材料，而是對(duì)不同的堿基通過納米孔時(shí)產(chǎn)生的電信號(hào)變化進(jìn)行解析以識(shí)別基因中堿基對(duì)的排列順序，基于物理的原理完成測(cè)序。納米孔測(cè)序技術(shù)實(shí)現(xiàn)了從低讀長(zhǎng)到超高讀長(zhǎng)、從光學(xué)檢測(cè)到電子傳導(dǎo)檢測(cè)的雙重跨越，但測(cè)序準(zhǔn)確率有待提高[5,6]。目前，納米孔測(cè)序技術(shù)已被應(yīng)用于臨床并將實(shí)現(xiàn)廣泛開展[7-9]。

2.DNA測(cè)序技術(shù)婦產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1 DNA檢測(cè)技術(shù)用于胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查

基于高通量基因測(cè)序技術(shù)的胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（Preimplantation Genetic Diagnosis，PGD）和胚胎植入前遺傳學(xué)篩查（Preimplantation Genetic Screening，PGS）是指對(duì)具有遺傳風(fēng)險(xiǎn)或胚胎異常風(fēng)險(xiǎn)患者在體外受精形成的胚胎進(jìn)行種植前活檢和遺傳學(xué)分析，對(duì)異常胚胎進(jìn)行診斷，從而進(jìn)行優(yōu)選，獲得正常胎兒的胚胎植入宮腔，提高臨床妊娠率，降低流產(chǎn)率和出生缺陷率。適應(yīng)癥：①高通量測(cè)序PGD的適應(yīng)證：包括多種遺傳疾病如基因性疾病、非平衡的染色體結(jié)構(gòu)異常、染色體數(shù)目異常，以及染色體微小片段插入、缺失與重復(fù)等；②高能量測(cè)序PGS的適應(yīng)證：自然流產(chǎn)≥3次或2次自然流產(chǎn)且其中至少1次流產(chǎn)物檢查證實(shí)存在病理意義的染色體或基因異常的患者，反復(fù)種植失敗（移植優(yōu)質(zhì)胚胎3次及以上，或移植不少于10個(gè)可移植胚胎）的患者，也可用于＞37歲的高齡且需要采用輔助生殖技術(shù)的患者。

隨著此項(xiàng)技術(shù)的日臻成熟，胚胎活檢方法的不斷改進(jìn)，其不足和缺陷也將日趨完善，目前，對(duì)于胚胎植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)應(yīng)用的安全性國(guó)內(nèi)外學(xué)者亦均有關(guān)注，如此項(xiàng)技術(shù)對(duì)妊娠結(jié)局、后代的影響等。雖然有少量報(bào)導(dǎo)PGD/PGS不會(huì)對(duì)妊娠結(jié)局和后代有不良影響，但仍缺乏大樣本支持，如若后續(xù)更多大樣本數(shù)據(jù)支持這一結(jié)果，則此項(xiàng)技術(shù)的受益者眾多，尤其那些反復(fù)種植失敗的患者[10-15]。

2.2 DNA檢測(cè)技術(shù)用于產(chǎn)前檢測(cè)/篩查

無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)（Non-invasive Prenatal Testing，NIPT）和無創(chuàng)產(chǎn)前篩查（Non-invasive Prenatal Screening，NIPS）是指在出生前對(duì)胚胎或胎兒的發(fā)育狀態(tài)、是否患有疾病等方面進(jìn)行檢測(cè)，以便及早采取措施避免殘疾兒的出生，提高出生人口的素質(zhì)，是優(yōu)生學(xué)的重要組成部分。產(chǎn)前診斷方法依據(jù)取材和檢查手段的不同，一般分為兩大類，即創(chuàng)傷性方法和非創(chuàng)傷性方法。目前產(chǎn)前診斷中創(chuàng)傷性方法以羊膜腔穿刺和絨毛取樣兩種最常用。取材時(shí)具有以下風(fēng)險(xiǎn)：胎兒一過性心動(dòng)過緩；0.1%～0.9%的比例發(fā)生早產(chǎn)或胎兒宮內(nèi)死亡；取臍血后臍帶胎盤滲血；取羊水后極少見的羊膜腔內(nèi)感染。非創(chuàng)傷性方法包括超聲波檢查、母體外周血清標(biāo)志物測(cè)定和胎兒細(xì)胞檢測(cè)等，經(jīng)大量臨床研究證實(shí)高通量測(cè)序技術(shù)在NIPT/NIPS中的可行性及其具有非侵入和準(zhǔn)確的特點(diǎn)，同時(shí)對(duì)患者及胎兒影響較小，使得其在各大醫(yī)院得到了陸續(xù)開展[16-18]。需要指出的是，除了常規(guī)檢測(cè)結(jié)果，某些次要結(jié)果如基因組拷貝數(shù)變異篩查的陽性結(jié)果準(zhǔn)確性較高，但目前尚未達(dá)到診斷水平[19]。此項(xiàng)技術(shù)不能檢出染色體結(jié)構(gòu)異常病例，因此，對(duì)于唐氏綜合征血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，不能完全替代傳統(tǒng)的羊水細(xì)胞染色體核型分析，但可以作為有益補(bǔ)充[20]。

2.3 DNA檢測(cè)技術(shù)用于雙胎妊娠

由于我國(guó)生育政策的調(diào)整及輔助生殖技術(shù)的成熟并廣泛應(yīng)用，雙胎妊娠率逐年升高，然而侵入性產(chǎn)前診斷的方式將使雙胎妊娠的孕婦面對(duì)更高的流產(chǎn)、早產(chǎn)、宮內(nèi)感染等風(fēng)險(xiǎn)，承擔(dān)更多的恐懼及擔(dān)憂。無創(chuàng)DNA檢測(cè)技術(shù)無疑成為此類人群的福音，目前，對(duì)于此項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于雙胎妊娠診斷循證醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)較少，一項(xiàng)近期發(fā)表的關(guān)于雙胎NIPS的mata分析結(jié)果顯示，在雙胎妊娠21三體異常篩查中NIPS具有較高的敏感性和特異性，18三體次之，由于樣本量較小，NIPS對(duì)于13三體異常診斷的敏感性和特異性則不能確定[21]。總結(jié)國(guó)內(nèi)外學(xué)者所得結(jié)論：NIPT檢測(cè)雙胎21、18和13-三體綜合征是產(chǎn)前篩查的一種新選擇，檢測(cè)雙胎（單卵雙生）非整倍體的準(zhǔn)確性同單胎接近，由于雙卵雙胎染色體核型常不一致，檢測(cè)結(jié)果可能因正常胎“掩蓋”了異常胎而導(dǎo)致結(jié)果顯示低風(fēng)險(xiǎn)，則假陰性率提高[22-25]。

綜上所述，歷經(jīng)四代的DNA檢測(cè)技術(shù)以其更先進(jìn)、更高效、更低廉、更不可比擬的優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域?；贒NA測(cè)序技術(shù)的NIPT/NIPS用于孕婦檢測(cè)唐氏綜合癥胎兒所具有的高敏感性和特異性已毋庸置疑。NIPT/NIPS胎兒染色體非整倍體作為一種新的產(chǎn)前篩查方式極具前景，但應(yīng)告知孕婦無創(chuàng)基因檢測(cè)不能檢測(cè)所有染色體，更不能替代產(chǎn)前診斷，如絨毛穿刺和羊膜腔穿刺；它也不能評(píng)估胎兒結(jié)構(gòu)異常如神經(jīng)管缺陷或腹壁缺陷等，同時(shí)需注意與其他檢測(cè)方式聯(lián)合，提高臨床診斷率，更大程度提高人口出生質(zhì)量并避免不必要的資源浪費(fèi)。

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DNA Sequencing Technology and Its Application in the Field of Obstetrics and Gynecology

WANG Meng-ying PENG Li-min YUAN Cheng-kun＊Department of Obstetrics and Gynecology, First Affiliated Hospital, Heilongjiang University of Chinese Medicine(Heilongjiang Harbin 150040)

1006-6586(2017)23-0022-02

R197.39

A

2017-10-20

苑程鯤。