李 裕，鄧舜洲，傅勝才，黃 勇，高 華，劉文峰，張文波，陳松昌，萬文忠，張 順

（1.湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，湖南長沙410006；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330045；3.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長沙410006；4.沅江市畜牧水產(chǎn)局，湖南沅江413100；5.南昌金牧動物保健服務(wù)有限公司，江西南昌330013)

豬圓環(huán)病毒2型O R F2基因片段的原核表達

李 裕1，鄧舜洲2，傅勝才3，黃 勇1，高 華4，劉文峰2，張文波2，陳松昌5，萬文忠5，張 順5

（1.湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，湖南長沙410006；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330045；3.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長沙410006；4.沅江市畜牧水產(chǎn)局，湖南沅江413100；5.南昌金牧動物保健服務(wù)有限公司，江西南昌330013)

豬圓環(huán)病毒2型（PC V2）的衣殼蛋白由O R F2編碼。采用PC R技術(shù)擴增得到O R F2基因片段，克隆入pU C m-T載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pU C m-PC V2-O R F2。根據(jù)pU C m-PC V2-O R F2測序結(jié)果設(shè)計引物，用Pf u酶擴增替換稀有密碼子三聯(lián)體。改造后的基因片段連接入表達載體pG EX-4T-1，并轉(zhuǎn)化到BL21(D E3)宿主菌，成功構(gòu)建了G ST-PC V2-O R F2蛋白大腸桿菌工程菌。經(jīng)誘導(dǎo)表達后，對以包涵體形式存在的G ST-PC V2-O R F2重組蛋白進行純化、復(fù)性。復(fù)性后的G ST-PC V2-O R F2重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

PC V2；O R F2；基因；原核表達

豬圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬。根據(jù)致病性、抗原性、基因序列的不同，豬圓環(huán)病毒分為豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)。PCV1和PCV2都廣泛存在于全世界的豬群中。PCV1無致病性。PCV2能損傷豬的免疫系統(tǒng)，表現(xiàn)出多種病癥。這些病癥有斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PM W S)、皮炎腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸道疾病復(fù)合癥(PRDC)、繁殖障礙、肉芽腫性腸炎、滲出性皮炎、壞死性淋巴結(jié)炎、仔豬先天性震顫。

PCV2基因組開放閱讀框2（ORF2）編碼的衣殼蛋白具有型特異性[1]，因此ORF2編碼的衣殼蛋白是PCV2亞單位疫苗的理想抗原，也是用來檢測PCV2抗體水平的理想抗原。本研究嘗試?yán)迷吮磉_載體pGEX-4T-1表達PCV2的ORF2基因片段，期望能得到具有良好抗原活性、較高純度的PCV2衣殼蛋白。

1 材料

1.1 毒株、質(zhì)粒與菌株

感染PCV2(JX1株)的PK15細胞由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院鄧舜洲博士惠贈。DH 5α e.col i菌、BL21(DE3)e.col i菌、pGEX-4T-1質(zhì)粒由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院張文波博士惠贈。pUCm-T載體購自上海生工生物工程公司。

1.2 主要試劑

Taq酶、Pf u酶購自北京天根生物技術(shù)公司。Bam H I限制性內(nèi)切酶、Xho I限制性內(nèi)切酶購自大連寶生物工程有限公司。離心柱型質(zhì)粒小提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京天根生物技術(shù)公司。DNA快速連接試劑盒購自Prom aga公司。100bp LadderDNA M arker、小分子量蛋白質(zhì)M arker購自天根生物技術(shù)公司。PCV2陽性血清、PCV2陰性血清（SPF豬血清）由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院鄧舜洲博士惠贈。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.3 引物

參照genbank已知的PCV2序列,使用Pri m er軟件輔助設(shè)計兩對引物。

引物ORF2-F1：5'-TAG GAT CCT GGA(C)ATT (C)TTC AAC AG(C)C C-3'（25nt）；ORF2-R1：5'-GGC TCG AGT TTA GGG TTA AGT GGG-3'（24nt）。產(chǎn)物為593bp的ORF2片段。引物ORF2-F2：5'-GTG GAT CCC GTA TTC GTA AGG TTA AGG TTG AAT TCT G-3'(37nt)；ORF2-R2：5'-TGC TCG AGT TAC GGG TTA AGT G-3'(22nt)。產(chǎn)物為430bp的ORF2片段。由上海生工生物工程公司合成。

2 方法與結(jié)果

2.1 目的基因的擴增與克隆

提取感染PCV2的PK15細胞總DNA，使用引物ORF2-F1、ORF2-R1進行PCR擴增，得到ORF2片段（593bp），對其膠回收純化。將純化好的DNA與T載體的連接成pUCm-PCV2-ORF2質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入DH 5α菌。提取pUCm-PCV2-ORF2質(zhì)粒，送上海生工生物工程公司測序。將測得的PCV2(PCVJX1) ORF2序列與Genbank已發(fā)表的其它PCV2序列進行比對。使用Basi c Local Al i gnm ent Search Tool（BLAST）進行搜索，結(jié)果顯示該段序列與國內(nèi)大多數(shù)PCV2毒株ORF2的同源性高達99％。

提取pUCm-PCV2-ORF2質(zhì)粒，用引物ORF2-F2、ORF2-R2對ORF2片段進行高保真PCR擴增。如圖1所示，目的條帶與預(yù)期（430bp）相符。

圖1 使用Pf u酶從pU C m-PC V2-O R F2質(zhì)粒中擴增O R F2片段（M：100bp Ladder；1：擴增產(chǎn)物；2：陰性對照）

對膠回收純化好的ORF2片段(430bp）、pGEX-4T-1質(zhì)粒分別雙酶切后，連接得到重組質(zhì)粒pGEX-PCV2-ORF2。轉(zhuǎn)入感受態(tài)BL21(DE3)菌。

2.2 目的基因的原核表達

對攜帶pGEX-PCV2-ORF2質(zhì)粒BL21(DE3)菌進行誘導(dǎo)表達，產(chǎn)物進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析（見圖2）。誘導(dǎo)后的菌在蛋白質(zhì)M arker 45KDa左右處有明顯的條帶（箭頭所指處），而未誘導(dǎo)的表達菌在該處無明顯條帶。說明該條帶為誘導(dǎo)產(chǎn)物。大小與預(yù)期的42KDa相符。產(chǎn)物的量隨誘導(dǎo)時間增加不斷提高，4h時到達峰值。誘導(dǎo)5h時和誘導(dǎo)4h并沒有明顯區(qū)別，所以確定最佳誘導(dǎo)時間為4h。將誘導(dǎo)4h的菌裂解，分別將上清、沉淀進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（見圖2）。可見沉淀為比較純的42KDa條帶，而上清中幾乎沒有目的條帶。說明表達產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在。

圖2 pG EX-PC V2-O R F2表達全菌、上清、沉淀SD S-PAG E（1-4：均為帶pG EX-PC V2-O R F2質(zhì)粒的BL21(D E3)菌;1：未誘導(dǎo)；2：誘導(dǎo)4h全菌；3：誘導(dǎo)4h菌裂解上清；4：誘導(dǎo)4h包涵體）

2.3 表達產(chǎn)物的純化

將誘導(dǎo)表達的菌用溶菌酶、超聲波裂解。加入0.1m ol/L二硫蘇糖醇溶液混勻后離心棄去上清。20％脫氧膽酸鈉溶液重新懸浮沉淀，再次離心棄去上清，得到高純度的包涵體沉淀。十二烷基肌氨酸鈉溶液充分溶解沉淀，然后用0.3％十二烷基肌氨酸鈉緩沖溶液稀釋至蛋白濃度為1m g/m L。用復(fù)性緩沖液進一步稀釋使蛋白濃度至40μg/m L。加入100 m m ol/L還原型谷胱甘肽溶液，使終濃度至2 m m ol/L，混勻后4℃靜置1小時。加入20％ PEG4000溶液，使終濃度至0.2％。加入50 m m ol/L氧化型谷胱甘肽溶液，使氧化型谷胱甘肽濃度為1 m m ol/L，4℃靜置3小時。裝入透析袋中，用十倍體積pH 9.6的碳酸鹽緩沖液放置4℃冰箱緩慢透析。10小時后更換碳酸鹽緩沖液，重復(fù)兩次。透析復(fù)性后的蛋白液中加入疊氮鈉溶液至終濃度0.05％。4℃保存。用分光光度計測定260nm、280nm吸光值，計算蛋白終濃度。

2.4 活性驗證

在酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為1：5000的情況下，將純化好的蛋白液分別以30μg/m L、15μg/m L、7.5μg/m L、5μg/m L、2.5μg/m L、1.25μg/m L的濃度包被酶標(biāo)板，每個濃度重復(fù)16孔。以1：10、1：20、1：40、1：80、1：160、1：320、1：640、1：1280 PBS稀釋的PCV2陽性、陰性血清進行ELISA方陣試驗，在抗原包被濃度為7.5μg/m L和血清稀釋倍數(shù)為1：80時，陽性血清孔的吸光度值為1.376，陰性血清孔的吸光度值為0.168。P/N值達到了8.19，表明該蛋白有良好的PCV2反應(yīng)原性。

3 討論

市面上已有桿狀病毒表達制成的PCV2亞單位商品疫苗[2]。由于桿狀病毒表達系統(tǒng)成本高，導(dǎo)致該疫苗價格昂貴，目前一般用于種豬接種。大腸桿菌表達系統(tǒng)成本低，但PCV2衣殼蛋白N端有較多的堿性氨基酸和大腸桿菌稀有密碼子，不利于在大腸桿菌中表達[3]。在眾多大腸桿菌稀有密碼子當(dāng)中,編碼精氨酸的AGG和AGA是使用頻率最低的兩種。當(dāng)有兩個AGA相距很近時,會嚴(yán)重影響翻譯進程。本實驗克隆的PCV2（JX1株）ORF2序列中包含AGA ATA AGA稀有密碼子三聯(lián)體，會對表達造成很大的影響。本實驗最初試圖表達克隆得到的593bp片段，但誘導(dǎo)后未獲得表達產(chǎn)物，可能就是這個原因。接著本實驗選擇稀有密碼子三聯(lián)體至3'末端的430bp進行表達。設(shè)計引物ORF2-F2對影響表達的稀有密碼子三聯(lián)體進行了同義置換（AGA ATA AGA-＞cgtat tcgt）。將PCV2 ORF2 3'端430bp序列插入表達載體pGEX-4T-1進行表達。全菌SDS-PAGE結(jié)果表明表達成功。

表達產(chǎn)物以包涵體形式存在。經(jīng)過簡單的細菌裂解、去雜步驟，能得到純度較高的包涵體[4]。包涵體的組成比較單一，絕大部分是外源性表達產(chǎn)物。這給蛋白純化帶來了方便。溶解包涵體、復(fù)性這一步驟比較繁瑣和耗時，這是最關(guān)鍵的一步，決定了活性蛋白的得率[5]。復(fù)性好的蛋白可溶，包被酶標(biāo)板后同豬PCV2陰陽性血清進行反應(yīng)，ELISA結(jié)果表明復(fù)性后蛋白有很好的反應(yīng)原性。

本實驗使用的pGEX-4T-1是一種融合表達載體，將克隆基因表達成與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）相融合的蛋白質(zhì)。用該載體表達的融合蛋白可以選用GST融合蛋白純化試劑盒進行純化。用該載體表達的融合蛋白質(zhì)包含有凝血酶（Thrombi n）的識別序列，它是由緊挨多克隆位點前的DNA編碼的，因此可以選用Throm bi n切除掉GST。

本實驗構(gòu)建的GST-PCV2-ORF2工程菌每100m L菌液可獲得20m g的融合蛋白，產(chǎn)量令人滿意。已做方陣試驗初步確定了ELISA方法的包被蛋白濃度、血清稀釋倍數(shù)、酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)等參數(shù)?？蛇M一步與商品化的知名品牌PCV2抗體檢測ELISA試劑盒對比驗證吻合度?？紤]到現(xiàn)實的成本因素，要想實現(xiàn)生豬養(yǎng)殖上能用得起的PCV2原核表達亞單位疫苗，還需繼續(xù)探索更低成本的原核表達、蛋白純化方法。

[1]Nawagitgul P,Morozov I.Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein[J].Gen.Virol,2000,81：2281-2287.

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[3]解庭波．大腸桿菌表達系統(tǒng)的研究進展[J]．長江大學(xué)學(xué)報，2008，5（3）：77-82．

[4]D.R.馬歇克，J.T.門永，R.R.布格斯，等.蛋白質(zhì)純化與鑒定實驗指南[M]．北京：科學(xué)出版社，2000.

[5]高永貴，關(guān)治新.包涵體蛋白的變復(fù)性研究[J].科技通報，2003，19（1）：27-33.

S852.43

A

1006-4907（2016）04-0039-03

10.3969/j.i ssn.1006-4907.2016.04.021

2016-07-20

李裕（1979～），男，漢族，湖南益陽人，碩士研究生，獸醫(yī)師，主要從事獸藥、飼料，畜產(chǎn)品質(zhì)量安檢測工作，6603770@qq.cpm