薛 爽

（湖南省長(zhǎng)沙市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長(zhǎng)沙410013）

豬偽狂犬基因缺失疫苗的的研究進(jìn)展

薛 爽

（湖南省長(zhǎng)沙市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，湖南長(zhǎng)沙410013）

豬偽狂犬?。≒s eudorabi es）是由偽狂犬病病毒(Ps eudorabi esvi rus，PR V)引起的多種家畜以發(fā)熱、奇癢(豬除外)、繁殖障礙、腦脊髓炎為主要癥狀的一種高度接觸性傳染病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)很大的危害。而對(duì)該病最有效的預(yù)防措施是采取疫苗免疫，疫苗免疫是預(yù)防該病的主要手段，臨床上使用的疫苗又以豬偽狂犬基因缺失疫苗為主。文章就目前豬偽狂犬基因缺失疫苗的研究現(xiàn)狀及主要的商品化基因缺失疫苗做一簡(jiǎn)要綜述。

豬偽狂犬；基因缺失疫苗；商品化疫苗

豬偽狂犬?。≒seudorabi es）是由偽狂犬病病毒(Pseudorabi esvi rus，PRV)引起的多種家畜以發(fā)熱、奇癢(豬除外)、繁殖障礙、腦脊髓炎為主要癥狀的一種高度接觸性傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病?，F(xiàn)在已有40多個(gè)國(guó)家報(bào)道40多種動(dòng)物感染該病，我國(guó)自1948年劉永純首次報(bào)道豬偽狂犬病以來(lái)，已有20多個(gè)省市報(bào)道此病的發(fā)生。近年來(lái)的研究報(bào)道表明，豬偽狂犬病的發(fā)生逐年增加，成為我國(guó)當(dāng)前危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一。

對(duì)于該病的防控最為有效的方法是疫苗免疫。目前臨床上使用較多時(shí)是PRV基因缺失疫苗。PRV基因缺失疫苗是利用基因工程技術(shù)，在基因組中缺失或插入一段或幾段序列使PRV的某些基因不能表達(dá)，從而致弱PRV，同時(shí)又保持其較強(qiáng)的免疫原性而制成的疫苗。隨著研究的不斷深入。目前已構(gòu)建出了多種單基因、雙基因及多基因缺失疫苗。

1 豬偽狂犬基因缺失疫苗研究進(jìn)展

1.1 單基因缺失疫苗株

（1）TK基因缺失株：第一代基因缺失疫苗PRV的主要缺失的毒力基因是TK基因。TK基因缺失疫苗不存在毒力返強(qiáng)，使用安全。Ki t等[1]以PRV BUK為起始材料，并以BUK疫苗株為親本通過(guò)缺失TK基因序列中的148bp片段，構(gòu)建出PRV的 TK缺失株P(guān)RV BUK-d13株。試驗(yàn)證明，該疫苗對(duì)豬是安全的，并能提供有效的保護(hù)。1986年該毒株被美國(guó)批準(zhǔn)為上市的第一個(gè)基因工程疫苗毒株。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳煥春[2]通過(guò)構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pU EKPZ，將該質(zhì)粒與偽狂犬病病毒鄂A株基因組共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，構(gòu)建了PRV Ea株TK基因缺失株。蘇鑫銘等[3]構(gòu)建了PRV上海株TK基因缺失株，并對(duì)其生物學(xué)特性有部分的研究。PRV上海株缺失TK基因后不影響病毒的增殖，同時(shí)，對(duì)小鼠的致死能力很低，甚至失去對(duì)小鼠的毒力，但是對(duì)豬仍然具有感染力。陳瑞愛等[4]利用PCR構(gòu)建豬偽狂犬病毒容A株（PRV-Ra）TK基因缺失重組病毒，該重組病毒在體外傳代30代后仍其有良好的遺傳穩(wěn)定性。

（2）gE基因缺失疫苗株：張松林等[5]將中間轉(zhuǎn)移載體pl ESE和偽狂犬病毒Ea株基因組共轉(zhuǎn)染構(gòu)建了Ea株gE基因缺失突變株，并證明該缺失突變株在體外能夠穩(wěn)定遺傳。目前市面上流通的商品苗大多都是gE基因缺失苗Bart ha株。Bart ha株是一株弱毒活疫苗，是國(guó)外從牛身上分離的偽狂犬病毒gE基因缺失Bart ha株為基礎(chǔ)研制的疫苗。

（3）gD基因缺失疫苗株：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)石德時(shí)[6]采用真核表達(dá)質(zhì)粒介導(dǎo)的方法與逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的方法構(gòu)建了一種新型PRV gD基因缺失株。1994年P(guān)eet ers等[7]構(gòu)建一株gD基因缺失株。病毒能夠直接在細(xì)胞和細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，但是感染細(xì)胞釋放的子代病毒無(wú)感染性，缺失gD的毒株將失去從免疫動(dòng)物向非免疫動(dòng)物傳染的能力，對(duì)接種豬能產(chǎn)生明顯的保護(hù)性，證明gD缺失突變株是一種安全、不散毒的活疫苗。

（4）gG基因缺失株：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)王鑫等[8]利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法，將轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒PUSG與PRV基因組DNA共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，構(gòu)建出含GFP報(bào)告基因的偽狂犬病病毒Ea株gG基因缺失重組病毒。

1.2 雙基因缺失株

第二代基因缺失疫苗除了缺失了主要的毒力TK基因外，還缺失了一個(gè)編碼非必需糖蛋白的基因，有些同時(shí)在缺失雙基因的基礎(chǔ)上插入一個(gè)報(bào)告基因LacZ+或GFP（報(bào)告基因編碼綠色熒光蛋白，能自身催化形成發(fā)光結(jié)構(gòu)并在藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。

(1)TK/gC雙基因缺失活疫苗：1987年Ki t等[9]在PRV BUK-d13株的基礎(chǔ)上，通過(guò)缺失gC基因序列的l100bp，構(gòu)建了PRV TK/gC一雙基因缺失疫苗株。動(dòng)物試驗(yàn)表明，用該缺失疫苗接種的動(dòng)物不能產(chǎn)生抗gC的抗體，用gC-ELISA可將接種動(dòng)物與自然感染動(dòng)物區(qū)分開，有利于檢疫工作的開展。

(2)TK/gG雙基因缺失活疫苗：在我國(guó)，陳煥春、劉正飛等[10]以國(guó)內(nèi)地方分離株鄂A株為親本，采用外切酶Ⅲ和綠豆核酸酶酶切,構(gòu)建了缺失主要毒力TK基因重組質(zhì)粒pSTK1-4,經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)移質(zhì)粒改造，用Ecol R1消化PRV鄂A株TK/LacZ+突變株基因組DNA，然后轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞構(gòu)建了TK-/LacZ+突變株重組病毒，進(jìn)一步提取TK缺失突變株基因組DNA,通過(guò)磷酸鈣法與含gG-LacZ轉(zhuǎn)移質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞建立了PRV EaTK/gG一疫苗株。測(cè)定結(jié)果表明：該毒株具有較好的安全性，良好的遺傳穩(wěn)定性，很強(qiáng)的免疫原性，可以作為候選毒株用于偽狂犬病基因工程疫苗的研制。目前，由陳煥春主持構(gòu)建的PRV EaTK/gG一疫苗株已按新獸藥證書的要求完成了中試與區(qū)域試驗(yàn)，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和中試應(yīng)用證明該產(chǎn)品在產(chǎn)生抗體的時(shí)間和保護(hù)效果優(yōu)于目前的國(guó)內(nèi)外同類產(chǎn)品，命名為該疫苗株為PRV H B-98突變株，經(jīng)過(guò)8年實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，于2006年獲得國(guó)家新獸藥注冊(cè)證書和生產(chǎn)許可證[11]。

(3)TK/gE雙基因缺失活疫苗：梁苑燕等[12]以PRV-JSZ株為親本毒株，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)為報(bào)告基因，以Cre/l oxP系統(tǒng)，可先構(gòu)建出帶有l(wèi) oxP位點(diǎn)的rPRV-gE-/GFP，通過(guò)Cre重組酶處理后，獲得剔除EG-FP的gE單缺失株rPRV-gE一；再以rPRV-gE一為母本，以相同方法構(gòu)建gE/TK雙基因缺失株rPRV-gE/TK一株。劉正飛等用gE轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSPFZ與PRV EaTK一基因組DNA共轉(zhuǎn)染豬腎傳代細(xì)胞IBRS-2,在X-gal存在下進(jìn)行藍(lán)斑篩選,挑取藍(lán)班進(jìn)行空班純化,空班純化三次后獲得重組病毒PRV EaTK/gE一/LacZ+突變株。

1.3 三基因缺失活疫苗

2003年由郭萬(wàn)柱主持陳陸等[13]通過(guò)對(duì)其PRV閩A株TK基因缺失株改造構(gòu)建了gE/gI/TK/LacZ+三基因缺失疫苗株(SA215)，通過(guò)對(duì)該株致細(xì)胞病變效應(yīng)、安全性、免疫原性和接種動(dòng)物抗體消長(zhǎng)規(guī)律等生物學(xué)特性測(cè)定及田間試驗(yàn)結(jié)果顯示，SA215株是一株安全、免疫原性好的疫苗株。目前，SA215株正式獲得國(guó)家新獸藥證書。

1.4 四基因缺失活疫苗

M et t enl ei t er等構(gòu)建了含gG、gD、gE、gI缺失的4基因缺失疫苗株。1994年，M et t enl ei t er等[14]利用已整合PRV gD的細(xì)胞系，構(gòu)建了gG/gE/gI/gD四基因缺失疫苗，該疫苗不會(huì)散毒，非常安全，對(duì)豬失去毒性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生對(duì)PRV的保護(hù)性免疫。

2 國(guó)內(nèi)外主要商品化豬偽狂犬基因缺失苗

隨著豬偽狂犬基因缺失疫苗技術(shù)的研究成功，商品化的豬偽狂犬疫苗也隨著出現(xiàn)。目前，市場(chǎng)上主要流通的毒株是Bart ha毒株和Bucharest毒株。同時(shí)，市面主要流通的疫苗種類是：弱毒活疫苗，是以國(guó)外引進(jìn)的分離自牛的偽狂犬病毒gE基因缺失的Bart ha株為基礎(chǔ)研制的基因缺失疫苗、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳煥春研究的TK/gG一雙基因缺失（H B-98株）疫苗毒株疫苗和美國(guó)輝瑞林肯廠使用的Bucharest毒株疫苗。

目前，國(guó)內(nèi)已獲得批文的豬偽狂犬基因缺失疫苗生產(chǎn)廠家有15家，部分生產(chǎn)廠家具體信息見表1。國(guó)內(nèi)流通的進(jìn)口豬偽狂犬基因缺失疫苗的生產(chǎn)廠家有6家，具體信息見表2。

表1 部分國(guó)產(chǎn)豬偽狂犬基因缺失活疫苗的信息表

表2 進(jìn)口豬偽狂犬基因缺失活疫苗的信息匯總表

3 小結(jié)與展望

隨著豬偽狂犬基因缺失疫苗在生產(chǎn)實(shí)踐中的廣泛使用，該基因缺失疫苗與傳統(tǒng)滅活苗相比，其優(yōu)勢(shì)也越來(lái)越明顯。豬偽狂犬基因缺失疫苗的優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在：①基因缺失疫苗穩(wěn)定，不易發(fā)生毒力返祖增強(qiáng)；②PRV基因缺失株毒力低，但免疫原性強(qiáng)，保護(hù)時(shí)間長(zhǎng)；③可用于疫苗免疫動(dòng)物與自然感染動(dòng)物的鑒別診斷。當(dāng)然，豬偽狂犬基因缺失疫苗也存在引起潛伏感染和排毒等方面的危險(xiǎn)性。但隨著基因缺失疫苗的研究和應(yīng)用，通過(guò)對(duì)免疫程序、免疫方式、免疫佐劑等的改變，結(jié)合血清學(xué)抗體檢測(cè)技術(shù)和野毒鑒別技術(shù)，最終通過(guò)整體的豬偽狂犬凈化方案，從而根除豬偽狂犬病。

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S852.659.1

A

1006-4907（2016）04-0047-03

10.3969/j.i ssn.1006-4907.2016.04.024

2016-05-09

薛爽(1987～),男,漢族,本科,助理獸醫(yī)師,現(xiàn)從事動(dòng)物疫病預(yù)防領(lǐng)域工作,1026689455@qq.com.