唐 蓮，江叔芳，唐 歡

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

狼源和羊源長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)菌群分析

唐 蓮，江叔芳，唐 歡※

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128）

采用PC R-D G G E技術(shù)分析狼、羊長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)攜帶菌群情況。無(wú)菌條件下將樣品用液氮研磨成粉，試劑盒提取細(xì)菌總D N A；通用引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rD N A V3區(qū)并進(jìn)行D G G E電泳，分析、選取7條優(yōu)勢(shì)條帶，回收克隆測(cè)序。結(jié)果顯示，狼、羊長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)共攜帶7種優(yōu)勢(shì)菌，其中蘭斯格軍團(tuán)桿菌（Legionella lansingensis）、皮可克立克次氏體（Rickettsia peacockii）、R SV70AB1-2細(xì)菌（Bact eri um SV70AB1-2）、J N C ZJ b F1細(xì)菌（Bact eri um J N C ZJ b F1）為二者共有；不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp）和一種不可培養(yǎng)的細(xì)菌存在于狼源長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)；拉烏爾特立克次氏體（Rickettsia raoultii）存在羊源長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)。長(zhǎng)角血蜱寄生在不同宿主體內(nèi)所攜帶優(yōu)勢(shì)菌群存在一定差異。

PC R-D G G E；長(zhǎng)角血蜱；微生物菌群

蜱（Ti ck）是一類依靠吸食動(dòng)物血液為生的體外寄生蟲(chóng)，隸屬節(jié)肢動(dòng)物門、蛛形綱、蜱螨目，蜱總科，蜱總科分為軟蜱科、硬蜱科、納蜱科三種。全世界已知蜱類有3科18屬897種，中國(guó)有2科10屬119種[1]。長(zhǎng)角血蜱分孤雌生殖[2]和兩性生殖2個(gè)種群，是我國(guó)的優(yōu)勢(shì)蜱種之一，廣泛分布于我國(guó)17個(gè)省市區(qū)[3]。它侵襲人和黃牛、馬、綿羊、山羊、犬、鹿、刺猬等多種動(dòng)物，是伊氏埃立克體[4]、嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體[5]、發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒[6]、瑟氏泰勒蟲(chóng)等多種病原體的傳播媒介，具有重要的流行病學(xué)意義。目前，長(zhǎng)角血蜱寄生在不同宿主攜帶菌群情況報(bào)道較少。本文采用PCR-DGGE技術(shù)，旨在揭示狼、羊長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)攜帶菌群結(jié)構(gòu)，為防治蜱及蜱傳染病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 長(zhǎng)角血蜱

樣品分別采自湖南省長(zhǎng)沙市生態(tài)動(dòng)物園狼體表和河南省信陽(yáng)市家羊體表，經(jīng)體視顯微鏡和分子生物學(xué)鑒定為長(zhǎng)角血蜱，樣品液氮中保存。

1.1.2 主要試劑及儀器

2×EasyTaq PCR SuperM i x,由北京全式金生物技術(shù)有限公司出品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA片段快速純化/回收試劑盒，由天根生化科技（北京）有限公司出品；變性梯度凝膠電泳儀系統(tǒng)（DGGEK-2001），由美國(guó)CBS公司；凝膠成像系統(tǒng)（Quant um ST5），由法國(guó)Vi l berl ourm at公司出品。

1.1.3 擴(kuò)增引物

以341f和907r為引物擴(kuò)增16SrDNA,其序列為：341f（5’-CCTACGGAGGCAGCAG-3’）/907f(5’-CC CCGTCAATTCATTTGAGTTT-3’)；以341f-GC/518R為引物，擴(kuò)增16SrDNA V3其序列為：341f-GC（5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC ACGGGGGG CCTACGGAGCAGCAG-3’）/518R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌DNA的提取

分別采自狼、羊體表長(zhǎng)角血蜱飽血、半飽血雌成蜱若干，用75％乙醇清洗消毒，將樣品于液氮研磨成粉。參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.2 細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)的擴(kuò)增與純化

以341f和907r為引物，分別擴(kuò)增狼、羊長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)細(xì)菌DNA。反應(yīng)體系（50μL）：細(xì)菌DNA 2.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，2×EasyTaq PCR SuperM i x25.0 μL，ddH2O 21.0 μL。反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性5m i n；94℃預(yù)變性30s，61.5℃退火30s，72℃延伸34s；34個(gè)循環(huán)；72℃延伸7m i n。取5.0 μL產(chǎn)物用于1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

以第一次PCR產(chǎn)物為模板，341f-GC和518R為引物擴(kuò)增狼、羊長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)。反應(yīng)體系（50μL）為：第一次PCR產(chǎn)物1.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，2×TransH i FiSuperM i x 25.0 μL，ddH2O 22.0 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5m i n；95℃預(yù)變性30s，66℃退火30s，72℃延伸12s；32個(gè)循環(huán)；72℃延伸7m i n。取5.0 μL產(chǎn)物用于1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物用DNA片段快速純化/回收試劑盒回收。

1.2.3 變性梯度凝膠電泳（DGGE）

制備6％（w/v）的聚丙烯酰胺凝膠，取純化擴(kuò)增產(chǎn)物10μL加入凝膠樣品孔進(jìn)行電泳。電泳條件：60℃、200V，1×TAE電泳10h。EB染色20m i n后，用Quant um ST5凝膠成像系統(tǒng)儀拍照。

1.2.4 切膠回收與測(cè)序

從DGGE凝膠切下優(yōu)勢(shì)條帶，用ddH2O清洗3次后搗碎，再加入50μL無(wú)菌水，置于4℃條件過(guò)夜。將過(guò)夜產(chǎn)物于12 000×g離心5m i n，收集上清液。以此為模板，用引物341f和518R進(jìn)行16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增參數(shù)：95℃預(yù)變性5m i n；95℃預(yù)變性30s，53℃退火30s，72℃延伸12s；32個(gè)循環(huán)；72℃延伸7m i n。取5.0 μL產(chǎn)物用于瓊脂糖凝膠電泳檢查，以DNA片段快速純化/回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，純化產(chǎn)物送華大基因公司測(cè)序。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

將公司所測(cè)序列用DNAm an比對(duì)、分析，全長(zhǎng)序列上傳至GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，Bl ast n搜索同源性和相似性最高的序列。

2 結(jié)果分析

2.1 細(xì)菌16S rD N A PC R結(jié)果

以341f和907r為引物擴(kuò)增采自狼、羊長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)細(xì)菌總DNA，其片段大小約為600bp，與預(yù)測(cè)大小一致（圖1）。

圖1 長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)細(xì)菌16S rD N A PC R擴(kuò)增結(jié)果（M：M arker;1：羊源長(zhǎng)角血蜱;2：狼源長(zhǎng)角血蜱;N：陰性對(duì)照）

2.2 細(xì)菌16S rD N A V3區(qū)PC R擴(kuò)增結(jié)果

以341f-GC和518R為引物擴(kuò)增細(xì)菌16SrDNA V3區(qū)，其片段大小約為250bp,與預(yù)測(cè)大小相符(圖2)。

圖2 長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)細(xì)菌16SrD N A V3區(qū)PC R擴(kuò)增結(jié)果(M：M arker;1：羊源長(zhǎng)角血蜱;2：狼源長(zhǎng)角血蜱)

2.3 細(xì)菌16S rD N A V3區(qū)D G G E電泳圖譜分析

狼、羊長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)DGGE電泳如圖3。由圖可知，狼、羊長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)共攜帶7條優(yōu)勢(shì)菌，其中條帶2、條帶3、條帶5、條帶6為二者共有，條帶1、條帶7僅存在狼源長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)，條帶4僅存在羊源長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)。詳細(xì)見(jiàn)表1。

圖3 狼、羊長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)細(xì)菌D G G E電泳圖(N：陰性對(duì)照;1：狼源長(zhǎng)角血蜱;2：羊源長(zhǎng)角血蜱)

表1 D G G E凝膠中回收條帶序列分析結(jié)果

2.4 結(jié)果分析

本實(shí)驗(yàn)采集了7個(gè)優(yōu)勢(shì)條帶，經(jīng)華大基因公司測(cè)序后，獲取的基因序列與Genbank中登錄的基因序列比對(duì)的結(jié)果如表1。從表1可以直觀看出，狼、羊長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)的主要優(yōu)勢(shì)菌為不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter sp）、蘭斯格軍團(tuán)桿菌（Legionella lansingensis）、立克次氏體（Rickettsia）、SV70AB1-2細(xì)菌（Bact eri um SV70AB1-2）、JNCZJb F1細(xì)菌（Bact eri um JNCZJb F1）和一種不可培養(yǎng)的細(xì)菌，與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)已知序列具有高度的同源性和相似性。結(jié)果表明，狼源和羊源長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)攜帶的優(yōu)勢(shì)菌存在一定的差異，狼源相對(duì)二者共有菌多出2種，而羊源只多出一種。

3 討論

動(dòng)物胃腸道內(nèi)寄生著大量的的微生物菌群，采用傳統(tǒng)的方法無(wú)法準(zhǔn)確分析物種豐度和均勻度[7]。目前，熒光原位雜交(FISH)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)、基因的限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、熒光定量PCR等分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物胃腸道微生物研究領(lǐng)域[8]。但在蜱腸道微生物研究方面，DGGE報(bào)道較少[9]。本文采用PCR-DGGE技術(shù)分析狼、羊長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)攜帶菌群情況。

本次實(shí)驗(yàn)從狼、羊長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)檢測(cè)到7種優(yōu)勢(shì)菌，它們分別為不動(dòng)桿菌屬、皮可克立克次氏體、RSV70AB1-2細(xì)菌、蘭斯格軍團(tuán)桿菌、JNCZJb F1細(xì)菌、拉烏爾特立克次氏體（R.raoultii）及一種不可培養(yǎng)的細(xì)菌。對(duì)于吸血的節(jié)肢動(dòng)物而言，腸道菌群在不斷變化，吸血后，中腸細(xì)菌群體會(huì)經(jīng)歷先增后減的過(guò)程[10]。李春紅[11]等采用細(xì)菌學(xué)方法從未吸血的長(zhǎng)角血蜱腸道內(nèi)分離到5個(gè)菌屬：葡萄球菌屬、考克氏菌屬、短桿菌屬、顯核菌屬和微桿菌屬；廖芷卉[9]等采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)羊源長(zhǎng)角血蜱吸血后中腸優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行檢測(cè)，分離到7個(gè)菌屬：柯克斯氏體屬、腸桿菌屬、泛菌屬、綠膿桿菌屬、克雷伯氏菌屬、假單胞菌屬、歐文氏菌屬，此二者研究證實(shí)，長(zhǎng)角血蜱腸道菌群在在吸血前后存在差異。除此以外，同一種蜱在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段、不同的地域體內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)也有所不同。楊亞[12]等從河南信陽(yáng)、湖南岳陽(yáng)、山西太谷地區(qū)褐黃血蜱中腸內(nèi)容物中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：半飽血雌成蜱和吸血雄成蜱中腸菌群結(jié)構(gòu)基本相同，但飽血雌成蜱3個(gè)地區(qū)間具有較大的差異。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)角血蜱寄生在狼、羊宿主所攜帶菌群之間存在差異。

從長(zhǎng)角血蜱分離到的細(xì)菌，在其他蜱中也有報(bào)道。Ni ebyl ski[13]等從安氏革蜱中檢測(cè)到了皮科克立克次，W en等[14]證實(shí)，從我國(guó)黑龍江地區(qū)的森林革蜱體內(nèi)含有R raoultii。唐昊等[15]從微小牛蜱中腸內(nèi)容物中分離到2株立克次氏體：斯洛伐克立克次氏體、拉烏爾特立克次氏體，其它蜱如篦子硬蜱，褐黃血蜱、鐮形扇頭蜱、中華革蜱等都是類似報(bào)道。皮科克立克次體為蜱蟲(chóng)胞內(nèi)共生菌，對(duì)蜱蟲(chóng)的生長(zhǎng)和發(fā)育有著重要作用；拉烏爾特立克次氏體屬斑點(diǎn)熱群立克次氏體，它能夠引起人和動(dòng)物發(fā)生壞死紅斑和淋巴結(jié)病[16]；蘭斯格軍團(tuán)桿菌它能夠引起肺炎；不動(dòng)桿菌容易引起創(chuàng)口發(fā)炎。由此可見(jiàn)，長(zhǎng)角血蜱即是保菌宿主也是傳播媒介。

綜上所述，狼、羊長(zhǎng)角血蜱體內(nèi)攜帶菌群存在差異，可為蜱及蜱傳染病的防治提供參考。

[1]楊曉軍，陳澤，劉敬澤.蜱類系統(tǒng)學(xué)研究進(jìn)展[J].昆蟲(chóng)學(xué)報(bào),2007，50 (9)：94l-949.

[2]周金林，周勇志，龔海燕，等.我國(guó)長(zhǎng)角血蜱孤雌生殖種群的發(fā)現(xiàn)和生物學(xué)特性的研究[J].中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志，2005,15（3）：173-174.

[3]陳澤，楊曉軍，楊曉紅，等.中國(guó)蜱類地理分布及區(qū)系分析[J].四川動(dòng)物,2008,27(5)：820-823.

[4]LUO L M,Sun J M,Yan J B et al.Detection of a Novel Ehrlichia Species in Haemaphysalis longicornis Tick from China[J].Vector-Borne and Zoonotic Diseases,2016,16(6)：363-367.

[5]張令要，李靜，詹發(fā)先，等.湖北省長(zhǎng)角血蜱攜帶嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的調(diào)查[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2010,26(12)：1148-1150.

[6]王黎源，楊振東，孫毅，等.長(zhǎng)角血蜱攜帶發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒調(diào)查及基因特征分析[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2014,9（7）：629-632.

[7]許文濤，郭星，羅云波，等.微生物菌群多樣性分析方法的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2009，30（7）：258-265.

[8]鮑新宇，楊劍，高新艷，等.DGGE技術(shù)的原理及其在動(dòng)物胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)研究中的應(yīng)用[J].畜牧與飼料科學(xué)，2011，32(11)：25-26.

[9]廖芷卉，陳宏智，唐昊，等.羊源長(zhǎng)角血蜱吸血后中腸優(yōu)勢(shì)菌群分析[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2015,23(4)：61-64.

[10]Azambuja P,Feder D,Garcia E S.Isolation of Serratia marcescens in the midgut of Rhodnius prolixus：impact on the establishment of the parasite Trypanosoma cruzi in the vector[J].Exp Parasitol,2004,107(1-2)：89-96.

[11]李春紅，周勇志，趙素華，等.長(zhǎng)角血蜱腸道細(xì)菌的分離與鑒定[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,33(8)：611-614.

[12]楊亞，劉進(jìn)輝，程天印.褐黃血蜱中腸內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2015，37（4）：270-273.

[13]Niebylski M L,Schrumpf M E,Burgdorfer W,et al.Rickettsia peacockii sp.nov.,a new species infecting wood ticks,Dermacentor andersoni,in western Montana[J].International Journal of Systematic Bacteriology,1997,47(2)：446-452.

[14]Wen J,Jiao D,Wang J.H,et al.Rickettsia raoultii,the predominant Rickettsia found in Dermacentor silvarum ticks in China-Russia border areas[J].Exp Appl Acarol,2014,63：579-585.

[15]唐昊，趙瑜，廖芷卉，等.微小牛蜱中腸內(nèi)容物菌群結(jié)構(gòu)分析[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2015,10(6)：487-490.

[16]Na J,Chun Z.Y,Lan M,et al.Human infections with?Rickettsia raoultii,China[J].Emerg Infect Dis,2014,20(5)：866-868.

S852.746

C

1006-4907（2016）04-0036-04

10.3969/j.i ssn.1006-4907.2016.04.020

2016-05-31

湖南省教育廳項(xiàng)目（N o.14B092）。作者簡(jiǎn)介：唐蓮(1990～)，女，本科，動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)，m 15974244003@163.com。

※通訊作者：唐歡(1990～)，男，碩士研究生，主要從事蜱及蜱傳病研究，13975814172@163.com。