趙書林，蔡雙山，夏木陽，夏德才，胡 銳，楊齊華,閔征橋，張 念

(湖北福星生物科技有限公司，湖北 孝感 432100)

生物工程

裂殖壺菌不同破壁方法的研究

趙書林，蔡雙山，夏木陽，夏德才，胡 銳，楊齊華,閔征橋，張 念

(湖北福星生物科技有限公司，湖北 孝感 432100)

裂殖壺菌細胞結構緊密，對其進行破壁是二十二碳六烯酸(DHA)高強度發(fā)酵的重點工序。以裂殖壺菌為實驗菌種，比較了水洗法、膜過濾法、高壓均質法、酶解法和膜過濾高壓均質法5種破壁方法，觀察了每種方法破壁前后細胞形態(tài)特征，同時測定細胞破壁率、發(fā)酵液含油量、DHA產量和DHA含量。結果表明：膜過濾高壓均質法效果最為理想，破壁率達到100%；膜過濾高壓均質法的含油量、DHA產量、DHA含量均為最高，分別達到16.98 g/L、7.08 g/L、41.71%；從生產的連續(xù)性和有效性來講，膜過濾高壓均質法是最佳的破壁方法。

裂殖壺菌；破壁；DHA

裂殖壺菌是海洋微藻的一種，在裂殖壺菌藻細胞油脂中，二十二碳六烯酸(DHA)含量高達35%～50%[1-2]，利用裂殖壺菌高密度發(fā)酵生產富含DHA的油脂，具有很大的經濟效益和社會效益[3]。裂殖壺菌的脂質主要存在于由細胞壁包裹的裂殖壺菌菌體細胞內，很難分離出來。微藻的細胞壁很難破碎，導致DHA油脂的提取率不高[4-5]。因此，理想的破壁方法是DHA高強度發(fā)酵的關鍵。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

裂殖壺菌(Schizochytrium)，來自湖北福星生物科技有限公司。培養(yǎng)基均為常用的培養(yǎng)基。

堿性蛋白酶(酶活20萬U/g)，正己烷、無水乙醇、氯化鈉等均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

Agilent 7890A氣相色譜儀，電子顯微鏡，XSP-BM-2CA生物顯微鏡，SPX-150C 恒溫恒濕箱，SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺，LDZX-75KB 立式蒸汽滅菌器，RE-52C 旋轉蒸發(fā)器，JZH-50 均質機，陶瓷膜過濾器。

1.2 實驗方法

1.2.1 裂殖壺菌的富集和培養(yǎng)

從平板中挑選裂殖壺菌單菌落到搖瓶中進行一級種子培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)溫度為28℃，轉速為200 r/min；培養(yǎng)3 d后以10%的接種量進入二級種子培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)溫度為28℃，轉速為200 r/min； 培養(yǎng)3 d后以5%的接種量進入100 L發(fā)酵罐進行培養(yǎng)，罐壓0.03 MPa，通氣量8 m3/h，攪拌速度40 r/min，發(fā)酵7 d后收獲菌體[6]。

1.2.2 破壁方法

1.2.2.1 水洗法

取1 L發(fā)酵液，5 000 r/min離心5 min收集下層菌體，經3次水洗離心后提取油脂。

1.2.2.2 膜過濾法

取1 L發(fā)酵液，首先經1.2 μm陶瓷膜循環(huán)過濾水洗，其次經0.3 μm陶瓷膜循環(huán)過濾水洗，最后提取油脂。

1.2.2.3 高壓均質法

取1 L發(fā)酵液，5 000 r/min離心5 min得到發(fā)酵濃縮液，經高壓均質機均質(均質壓力40 MPa)2次后提取油脂[7]。

1.2.2.4 酶解法

取1 L發(fā)酵液，5 000 r/min離心5 min得到發(fā)酵濃縮液，經堿性蛋白酶酶解破壁(酶解溫度60℃，pH 8.0，酶解時間8 h)，然后提取油脂[8-9]。

1.2.2.5 膜過濾高壓均質法

取1 L發(fā)酵液，首先經1.2 μm陶瓷膜循環(huán)過濾水洗，其次經0.3 μm陶瓷膜循環(huán)過濾水洗，最后經高壓均質機均質(均質壓力40 MPa)1次后提取油脂。

1.2.3 破壁率計算

用顯微鏡觀察細胞破壁前后的發(fā)酵液，用血球計數(shù)板計數(shù)破壁前后的完整細胞數(shù)[10]。

式中：X為破壁率；N為破壁前的完整細胞數(shù)；N0為破壁后的完整細胞數(shù)。

1.2.4DHA油脂提取方法

取不同方法破壁的菌液，首先按1∶1的體積加入無水乙醇，振蕩15min離心分離除去上清液水-乙醇相；其次按1∶1的體積向底層菌泥加入正己烷，振蕩15min離心收集上清液，反復3次直到上清液無色透明，最后60℃旋轉蒸發(fā)收集DHA油脂，測定含油量、DHA含量和產量[9,11-12]。

1.2.5 掃描電鏡觀察細胞形態(tài)

分別選取破壁前后的菌液，真空冷凍干燥24h，用牙簽挑取少量菌絲置于觀察盒上噴金，在掃描電鏡下觀察其細胞形態(tài)特征[13]。

2 結果與討論

2.1 不同破壁方法的破壁率比較

用平板計數(shù)法計數(shù)細胞破壁前后的完整細胞數(shù)，計算破壁率，結果見圖1。

圖1 不同破壁方法的破壁率比較

破壁率間接反映細胞的出油率，破壁率越高，出油率越高，反之相反[14]。從圖1可以看出，膜過濾高壓均質法破壁率最高，達100%，其次為酶解法和高壓均質法，分別為98%和89%，膜過濾法和水洗法效果一般，分別為60%和38%。

2.2 破壁前后細胞形態(tài)的比較

為分析不同破壁方法對細胞形態(tài)的影響，使用掃描電鏡觀察破壁前后的細胞形態(tài)，結果見圖2[15-16]。

從圖2可以看出，破壁前裂殖壺菌細胞表面粗糙有褶皺，直徑在15μm左右，細胞形態(tài)為卵形[17]。水洗法破壁后的細胞表面光滑，無細胞內容物質滲出，細胞結構完整；膜過濾法破壁后的細胞表面更加光滑，無細胞內容物質滲出，但細胞壁出現(xiàn)裂痕，如果稍加外力作用細胞壁便會完全裂開，可達到破壁效果；高壓均質法破壁后的細胞破裂比較嚴重，有少量內容物質滲出在細胞表面，細胞形態(tài)為卵形；酶解法破壁后的細胞破裂最為嚴重，細胞內容物質大量滲出，細胞形態(tài)呈不規(guī)則形態(tài)；膜過濾高壓均質法破壁后的細胞破裂比較嚴重，未破裂的細胞壁出現(xiàn)裂痕，少量細胞內容物質滲出，但細胞表面光滑，細胞形態(tài)為卵形。

2.3 不同破壁方法效果分析

不同破壁方法的含油量、DHA產量和DHA含量見表1。

圖2 破壁前后細胞形態(tài)的比較 表1 不同破壁方法的含油量、DHA產量和DHA含量

項目水洗法膜過濾法高壓均質法酶解法膜過濾高壓均質法含油量/(g/L)6．8510．2914．8816．1416．98DHA產量/(g/L)2．744．126．086．657．08DHA含量/%39．9940．0140．8841．1841．71

從表1可以看出，5種破壁方法收集的油脂DHA含量相差不大，水洗法收集的油脂DHA含量最低，為39.99%，膜過濾高壓均質法收集的油脂DHA含量最高，達到41.71%。

由于破壁效果不同，導致含油量相差甚大。水洗法細胞損失較大，破壁率為38%，收集的油脂基本無腥味，含油量為6.85 g/L；膜過濾法可以去除發(fā)酵液中水溶性雜質以及小分子多糖、含氮等物質，收集的油脂基本無腥味，破壁率為60%，含油量為10.29 g/L；高壓均質法在40 MPa的壓力下均質2次，破壁率為89%，收集的油脂略有短暫腥味，含油量為14.88 g/L；酶解法破壁率為98%，但是酶解時間長，酶本身也帶有異味，實際生產中油脂很容易變質，特別是夏天，收集的油脂腥味很重，滯留時間很長，含油量為16.14 g/L；膜過濾高壓均質法破壁率為100%，經過膜過濾的發(fā)酵液只需在40 MPa的壓力下均質1次，油脂無腥味，含油量最高，達到16.98 g/L。

目前國內外不少學者對裂殖壺菌的發(fā)酵工藝進行了研究，Hibbeln等[18]對SchizochytriumBL10培養(yǎng)168 h后采用均質法破壁收集的油脂DHA含量和含油量達到38.9%和14.40 g/L，而本研究中膜過濾高壓均質法收集的油脂DHA含量和含油量達到41.71%和16.98 g/L。

3 結 論

(1)從破壁前后的細胞形態(tài)可以看出，水洗法破壁和膜過濾法破壁很難使細胞破壁完全；酶解法破壁，細胞內容物質大量滲出，故收集的油脂腥味很重，滯留時間很長；然而膜過濾高壓均質法破壁，細胞壁雖然破裂，但只有少量細胞內容物質滲出，故收集的油脂品質好、無腥味。

(2)從破壁率可以看出，酶解法和膜過濾高壓均質法都可以滿足破壁工藝要求，但是酶解法耗時長，收集的油脂品質差，所以從生產的連續(xù)性和有效性來講，膜過濾高壓均質法是最佳的破壁方法，因此膜過濾高壓均質法完全可以適用DHA高強度的生產。

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Different wall-breaking methods ofSchizochytrium

ZHAOShulin，CAIShuangshan，XIAMuyang，XIADecai，HURui，YANGQihua，MINZhengqiao，ZHANGNian

(HubeiFuxingBiologicalTechnologyCo.，Ltd.，Xiaogan432100,Hubei,China)

Schizochytrium’s cell structure is tight, so wall-breaking is the key process of DHA high strength fermentation.WithSchizochytriumas experimental bacteria, the wall-breaking methods, including water-washing,membrane filtration, high pressure homogeneous, enzymolysis and high pressure homogeneous composite membrane filtration were compared, and the morphological characteristics of cells before and after wall-breaking by each method were observed, in the same time the cell wall-breaking rate, oil content of fermentation liquid, and productivity and content of DHA were determined. The results showed that the effect of high pressure homogeneous composite membrane filtration method was the best with wall-breaking rate 100%, also the oil content of fermentation liquid, and productivity and content of DHA of that method were the highest, reaching 16.98,7.08 g/L and 41.71%,respectively. So high pressure homogeneous composite membrane filtration method was the best way to break the wall from the aspect of continuity and efficiency of production.

Schizochytrium; wall-breaking; DHA

2016-05-13；

2016-10-24

國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)項目(2014AA021702)

趙書林(1989)，男，工程師，碩士，主要從事微生物油脂的研究(E-mail)396858346@qq.com。

TS218;TQ92

A

1003-7969(2017)01-0109-04