祝雨筱，王盈盈，金青哲，王興國，王小三

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

油脂改性

酶法合成1,2-甘油二酯的工藝研究

祝雨筱，王盈盈，金青哲，王興國，王小三

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122)

以固定化脂肪酶Lipozyme 435為催化劑，在無溶劑體系下催化高油酸葵花籽油與無水乙醇發(fā)生醇解反應(yīng)合成1,2-甘油二酯。通過單因素試驗確定的最優(yōu)反應(yīng)條件為：高油酸葵花籽油與無水乙醇摩爾比1∶50，加酶量6%(占底物總質(zhì)量)，反應(yīng)溫度50℃，反應(yīng)時間1 h。在最優(yōu)反應(yīng)條件下，1,2-甘油二酯得率可達88%。粗產(chǎn)物經(jīng)兩步結(jié)晶法提純后，可獲得純度為100%的1,2-甘油二酯。

1,2-甘油二酯；醇解；酶法合成；Lipozyme 435

甘油二酯(DAG)是一種乳化劑和表面活性劑，在食品、醫(yī)藥、化妝品、化工等行業(yè)有著廣泛的用途[1]。甘油二酯是一類甘油三酯(TAG)中1個脂肪酸被羥基取代所形成的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，主要存在1,3-DAG和1,2-DAG兩種異構(gòu)體。與1,3-DAG不同的是，1,2-DAG可以作為趨化因子刺激白細胞向感染部位遷移，促進傷口的愈合[2]，也可以幫助改善患有糖尿病大鼠的心肌功能紊亂[3]。此外，純的1,2-DAG還可用于合成大量酶受體的興奮劑和拮抗劑，以及作為合成磷脂、糖脂、藥物前體和結(jié)構(gòu)甘油三酯的中間體[4]。

由于1,2-DAG的熱穩(wěn)定性較差，不易于保存，目前國內(nèi)對其合成工藝研究較少，僅有文獻[5]報道了化學(xué)法的合成工藝，即以D-甘露醇為原料，經(jīng)丙叉基保護、氧化還原、芐基保護、脫丙叉保護、醇的酰化、芐基的脫保護，合成產(chǎn)率49.3%的1,2-DAG。該反應(yīng)耗時超過60 h，且反應(yīng)過程中引入了溴化芐、四丁基硫酸氫銨、氯仿等大量有毒試劑，不是一種高效綠色的合成途徑，此外這種合成工藝經(jīng)過多步保護和脫保護過程，十分復(fù)雜。為改進化學(xué)法合成工藝，本研究以固定化脂肪酶Lipozyme 435為催化劑，通過醇解TAG合成1,2-DAG。本研究原料來源廣泛，反應(yīng)迅速，不引入有毒試劑，為合成1,2-DAG提供了一種新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

高油酸葵花籽油：上海良友海獅油脂實業(yè)有限公司；固定化脂肪酶Lipozyme RM IM(標(biāo)稱活力275 IUN/g，數(shù)據(jù)來源于諾維信公司，下同)、Lipozyme 435(8 000 PLU/g)、Lipozyme TL IM(250 IUN/g)、Novozym 435(10 000 PLU/g)：諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；1,2-二油酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma 公司；正己烷、異丙醇：色譜純；甲醇、無水乙醇、正丙醇、正丁醇、叔丁醇、冰乙酸：分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

夾層酶反應(yīng)器：上?；茖嶒炂鞑挠邢薰?；有機針孔過濾器(直徑13 mm，孔徑0.22 μm)；SHZ-3循環(huán)水多用真空泵；HH-601超級恒溫水浴；Re-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；TGL-16B離心機；AR2140電子精密天平；Waters 1525高效液相色譜儀，WatersAlltech 3300蒸發(fā)光散射檢測器：美國Waters公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 1,2-DAG的合成

稱取一定質(zhì)量的高油酸葵花籽油于酶反應(yīng)器，加入一定體積的醇，放入攪拌子，在一定溫度下恒溫水浴中預(yù)熱，打開磁力攪拌器，以500 r/min攪拌乳化15 min后，加入占一定底物總質(zhì)量百分比的脂肪酶，開始反應(yīng)，一段時間后停止反應(yīng)，取出產(chǎn)物，4 000 r/min離心10 min去除脂肪酶，35℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30 min去除有機溶劑，得到1，2-DAG粗產(chǎn)物。

1.2.2 1,2-DAG的純化

采用兩步結(jié)晶法對1,2-DAG粗產(chǎn)物進行純化。將1,2-DAG粗產(chǎn)物與正己烷以1∶10比例混合，常溫下?lián)u勻溶解，在-40℃下放置24 h，抽濾分離固液兩相，獲得的固相即為第一步結(jié)晶的粗提物。將第一步結(jié)晶的粗提物與甲醇以1∶15比例混合，常溫下?lián)u勻溶解，在-20℃下放置6 h，抽濾分離固液兩相，獲得的固相即為純度達100%的1,2-DAG。

1.2.3 HPLC-ELSD分析1，2-DAG粗產(chǎn)物

取一定質(zhì)量1，2-DAG粗產(chǎn)物于燒杯，加入一定體積的正己烷溶解樣品，配制成質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL的溶液，經(jīng)有機針筒過濾器過濾后注入樣品瓶中，進HPLC-ELSD分析。

配制質(zhì)量濃度在0.007 5～0.200 0 mg/mL之間的1,2-DAG標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用HPLC-ELSD分析，外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，粗產(chǎn)物中1,2-DAG的含量除以理論生成量即為得率。

HPLC-ELSD分析條件：Sepax HP-Silica色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流速1 mL/min；柱溫35℃；漂移管溫度 75℃；增益1；進樣量5 μL；流動相 A相(正己烷與異丙醇體積比99∶1)，B相(正己烷、異丙醇、冰乙酸體積比1∶1∶0.01)；梯度洗脫條件為0～10 min，A由100%降至80%；10～14 min，A由80%降至70%；14～15 min，A 由70%升至100%；15～20 min，A保持100%不變。在此色譜條件下，1,2-DAG粗產(chǎn)物的HPLC-ELSD圖見圖1。

圖1 1,2-DAG粗產(chǎn)物的HPLC-ELSD圖

2 結(jié)果與討論

2.1 脂肪酶種類對反應(yīng)的影響

選取脂肪酶Lipozyme RM IM、Lipozyme 435、Lipozyme TL IM、Novozym 435進行試驗，反應(yīng)條件為：將高油酸葵花籽油與無水乙醇以摩爾比1∶50混合，加入占底物總質(zhì)量6%的一種脂肪酶，在50℃下催化反應(yīng)1 h。結(jié)果如圖2所示。

圖2 脂肪酶種類對得率的影響

由圖2可知，Lipozyme RM IM在反應(yīng)中沒有表現(xiàn)出活性，這是因為反應(yīng)物無水乙醇的極性較大，奪取了酶表面維持活性所必需的水分子[6]。采用Lipozyme TL IM催化反應(yīng)雖然可以獲得1,2-DAG，但Lipozyme TL IM的載體為硅膠，容易與極性反應(yīng)副產(chǎn)物吸附，降低得率[7]。除Lipozyme RM IM之外，其余3種脂肪酶都表現(xiàn)出了較高的選擇性，這是因為反應(yīng)體系的極性較高，提高了脂肪酶的選擇性[8]。采用脂肪酶Lipozyme 435和脂肪酶Novozym 435催化反應(yīng)可以獲得較高的得率，而與Novozym 435相比，Lipozyme 435是一種食品級脂肪酶，價格更為低廉，在極性溶劑中也具有更高的活性和穩(wěn)定性[9]。因此，選取Lipozyme 435作為反應(yīng)用脂肪酶。

2.2 醇種類對反應(yīng)的影響

選取甲醇、無水乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、叔丁醇進行試驗，反應(yīng)條件為：將高油酸葵花籽油與醇以摩爾比1∶50混合，加入占底物總質(zhì)量6%的脂肪酶Lipozyme 435，在50℃下催化反應(yīng)1 h。結(jié)果如圖3所示。

圖3 醇種類對得率的影響

由圖3可知，采用無水乙醇作為反應(yīng)物時，可以獲得較高的1,2-DAG得率。甲醇與高油酸葵花籽油反應(yīng)沒有生成1,2-DAG，這是因為過量的甲醇會剝除固定化酶表面的水層，降低酶活性和穩(wěn)定性，而脂肪酶本身為蛋白質(zhì)，過量的甲醇也可導(dǎo)致脂肪酶的變性[10]。試驗發(fā)現(xiàn)采用無水乙醇與高油酸葵花籽油反應(yīng)，可以獲得高純度的1,2-DAG，并且沒有生成副產(chǎn)物1,3-DAG。這可能是因為反應(yīng)體系的極性較高，提高了脂肪酶的選擇性[8]。此外，反應(yīng)體系傾向于生成與溶劑logp值相近的產(chǎn)物[11]，1,2-DAG的極性比1,3-DAG大，故反應(yīng)體系更傾向于生成1,2-DAG。因此，選取無水乙醇作為反應(yīng)物進行后續(xù)試驗。

2.3 底物摩爾比對反應(yīng)的影響

將高油酸葵花籽油與無水乙醇以不同摩爾比混合，加入占底物總質(zhì)量6%的脂肪酶Lipozyme 435在50℃下催化反應(yīng)1 h。結(jié)果如圖4所示。

圖4 底物摩爾比對得率的影響

由圖4可知，隨著底物摩爾比增加，1,2-DAG得率呈現(xiàn)先增后減的趨勢。試驗發(fā)現(xiàn)，采用過量的無水乙醇與高油酸葵花籽油反應(yīng)，可以提高1,2-DAG的得率。這可能是因為過量的醇有利于提高脂肪酶的sn-1,3位特異性。Zhang等[12]報道，當(dāng)乙醇過量時，Novozyme 435催化醇解反應(yīng)可以表現(xiàn)出較好的sn-1,3位特異性。Kuo等[6]的研究表明，采用過量乙醇與三辛酸甘油酯反應(yīng)時，Lipozyme RM IM具有較高的sn-1,3位特異性。此外，Poppe等[11]的研究也表明采用過量的乙醇醇解棕櫚油時，會促進反應(yīng)平衡向正反應(yīng)方向移動。然而，隨著無水乙醇用量繼續(xù)增加，脂肪酶與底物接觸受到限制，得率反而降低。因此，最適底物摩爾比為1∶50。

2.4 加酶量對反應(yīng)的影響

將高油酸葵花籽油與無水乙醇以摩爾比1∶50混合，加入占底物總質(zhì)量不同比例的脂肪酶Lipozyme 435在50℃下催化反應(yīng)1 h。結(jié)果如圖5所示。

圖5 加酶量對得率的影響

由圖5可知，加酶量為6%時，1,2-DAG的得率達到最高。加酶量過低時，不足以與全部的底物反應(yīng)。隨著加酶量的增加，酶分子與底物的接觸機會增加，1,2-DAG得率隨之提高。但若繼續(xù)增加加酶量，過量的酶會催化副反應(yīng)發(fā)生，降低1,2-DAG的得率，同時也會增加反應(yīng)成本[13]。因此，選擇最適加酶量為6%。

2.5 反應(yīng)溫度對得率的影響

將高油酸葵花籽油與無水乙醇以摩爾比1∶50混合，加入占底物總質(zhì)量6%的脂肪酶Lipozyme 435在不同溫度下催化反應(yīng)1 h。結(jié)果如圖6所示。

圖6 反應(yīng)溫度對得率的影響

由圖6可知，隨著反應(yīng)溫度升高，1,2-DAG得率呈現(xiàn)先增后減的趨勢。較高的反應(yīng)溫度可以降低體系黏度，促進傳質(zhì)效應(yīng)，有利于產(chǎn)物的生成[8]。但是1,2-DAG為非對稱結(jié)構(gòu)，在熱力學(xué)性質(zhì)上不如對稱的1,3-DAG穩(wěn)定，溫度過高時，1,2-DAG容易發(fā)生酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，轉(zhuǎn)變?yōu)?,3-DAG，降低得率[14]。因此，選取50℃作為最適反應(yīng)溫度。

2.6 反應(yīng)時間對得率的影響

將高油酸葵花籽油與無水乙醇以摩爾比1∶50混合，加入占底物總質(zhì)量6%的脂肪酶Lipozyme 435在50℃下催化反應(yīng)不同的時間。結(jié)果如圖7所示。

圖7 反應(yīng)時間對得率的影響

由圖7可知，反應(yīng)時間對得率有著顯著影響。在TAG的醇解反應(yīng)中，1,2-DAG為中間產(chǎn)物，繼續(xù)反應(yīng)則會轉(zhuǎn)變?yōu)?-MAG，進而被醇解為甘油，1,2-DAG和2-MAG又會發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，分別生成1,3-DAG和1-MAG[15]。在反應(yīng)低于1 h時，1,2-DAG沒有完全被合成，超過1 h后，1,2-DAG又會被繼續(xù)醇解為2-MAG。Xu等[15]采用菜籽油和癸酸進行酶促酯交換反應(yīng)合成結(jié)構(gòu)甘三酯時，發(fā)現(xiàn)1,2-DAG含量在反應(yīng)的1 h內(nèi)處于增加階段，超過1 h之后反而降低。Zhang等[12]采用乙醇醇解單細胞油脂合成2-MAG時，也得到了同樣的結(jié)論。因此，將1 h作為最適反應(yīng)時間。

3 結(jié) 論

相比化學(xué)法合成1,2-DAG，采用酶法合成可以獲得更高的得率，同時顯著縮短了反應(yīng)時間，且不引入有毒試劑，是一種高效綠色的合成途徑。通過單因素試驗，獲得酶法合成1,2-DAG的最優(yōu)反應(yīng)條件為：將高油酸葵花籽油與無水乙醇以摩爾比 1∶50混合，加入占底物總質(zhì)量6%的脂肪酶Lipozyme 435在50℃下催化反應(yīng)1 h。在最優(yōu)反應(yīng)條件下，1,2-DAG的得率可達88%。1,2-DAG粗產(chǎn)物經(jīng)兩步結(jié)晶法提純后，可獲得純度為100%的1,2-DAG。

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Enzymatic synthesis of 1,2-diacylglyceride

ZHU Yuxiao，WANG Yingying，JIN Qingzhe，WANG Xingguo，WANG Xiaosan

(Collaborative Innovation Center of Food Safety and Quality Control in Jiangsu Province, School ofFood Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)

The immobilized lipase Lipozyme 435 was used as catalyst to catalyze the alcoholysis of high oleic sunflower seed oil(HOSO) and absolute ethanol in a non-solvent system to synthesize 1,2-diacylglyceride(DAG). The optimal reaction conditions were obtained by single factor experiment as follows: molar ratio of HOSO to absolute ethanol 1∶50, dosage of enzyme 6%(based on the total mass of substrates), reaction temperature 50℃, reaction time 1 h. Under the optimal conditions, the yield of 1,2-DAG reached 88%.The purity of 1,2-DAG reached 100% after two-step solvent crystallization of crude product.

1,2-diacylglyceride; alcoholysis; enzymatic synthesis; Lipozyme 435

2016-05-26；

2016-10-19

江蘇省自然科學(xué)基金青年基金項目(BK20150137)；江蘇省政策引導(dǎo)類計劃(產(chǎn)學(xué)研合作)-前瞻性聯(lián)合研究項目(BY2016022-33)

祝雨筱(1993)，女，在讀碩士，研究方向為油脂合成(E-mail)1512953503@qq.com。

王小三，副教授，碩士生導(dǎo)師(E-mail)958273690@qq.com。

TS225.1;TS202.3

A

1003-7969(2017)01-0056-04