王文東 周 鑫 綜述 付 衛(wèi) 審校

(北京大學(xué)第三醫(yī)院普外科,北京 100191)

·文獻(xiàn)綜述·

類器官在結(jié)直腸癌研究中的應(yīng)用進(jìn)展*

王文東 周 鑫 綜述 付 衛(wèi)**審校

(北京大學(xué)第三醫(yī)院普外科,北京 100191)

腫瘤局部進(jìn)展和轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌的主要死因，以個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療為基礎(chǔ)的多學(xué)科聯(lián)合治療是進(jìn)展期結(jié)直腸癌的主流治療模式[1]。隨著腫瘤分子生物學(xué)機(jī)制研究的深入，多個(gè)腫瘤演進(jìn)過程中的關(guān)鍵基因突變被發(fā)現(xiàn)，并逐漸成為個(gè)體化治療模式中的藥物靶點(diǎn)[2]。Guinney等[3]在大規(guī)模測(cè)序基礎(chǔ)上提出的結(jié)直腸癌分子分型對(duì)結(jié)直腸癌的個(gè)體化治療產(chǎn)生了巨大而深遠(yuǎn)的影響，讓我們可以針對(duì)不同的分型采取相應(yīng)的治療措施。盡管如此，以遺傳學(xué)為基礎(chǔ)的腫瘤生物學(xué)行為研究卻仍停留在傳統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞系和動(dòng)物成瘤模型層面，成為阻礙日益完善的高通量組學(xué)研究應(yīng)用于臨床的絆腳石。

近年來，隨著對(duì)干細(xì)胞研究的深入，類器官(organoids)培養(yǎng)技術(shù)逐漸興起。類器官來源于干細(xì)胞，經(jīng)過體外3D(three-dimensional)培養(yǎng)后含有多種細(xì)胞類型，并能以與體內(nèi)相似的方式經(jīng)增殖和分化實(shí)現(xiàn)自我組建，形成類似體內(nèi)正常器官上皮腺體的結(jié)構(gòu)[4]。類器官主要在上皮結(jié)構(gòu)豐富的器官中培養(yǎng)成功，如胃[5]、小腸[6]、結(jié)直腸[7]、胰腺[8]和前列腺[9]等。腫瘤類器官可用來研究腫瘤的演變過程，評(píng)估藥物的療效和毒性[10]，探究腫瘤干細(xì)胞的作用以及腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制[11]，更準(zhǔn)確地研究腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性。本文主要綜述類器官在結(jié)直腸癌研究中的應(yīng)用進(jìn)展。

1 腸道類器官起源

1.1 腸道上皮干細(xì)胞

腸道黏膜層由腸絨毛覆蓋，絨毛的基底部有稱為隱窩(crypts)的龕狀結(jié)構(gòu)，這里有負(fù)責(zé)腸上皮持續(xù)更新的干細(xì)胞。腸黏膜上皮干細(xì)胞定居在隱窩的底部，通過快速分裂產(chǎn)生過渡(transit-amplifying，TA)細(xì)胞，逐漸占據(jù)隱窩上部，進(jìn)而生長到絨毛的兩側(cè)，接著進(jìn)行細(xì)胞分化，生成其他類型的腸細(xì)胞，其中包括具有吸收功能的腸絨毛細(xì)胞，以及具有分泌功能的細(xì)胞，如潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞和M細(xì)胞。2007年，荷蘭Barker等[12]發(fā)現(xiàn)腸道干細(xì)胞具有富含亮氨酸重復(fù)單位的G蛋白偶聯(lián)受體(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5，Lgr5)標(biāo)記，Lgr5位于干細(xì)胞表面，由Wnt靶基因編碼，是Wnt信號(hào)激動(dòng)劑R-spondins的受體。在隱窩底部，Lgr5+干細(xì)胞和潘氏細(xì)胞交錯(cuò)排列，潘氏細(xì)胞表面表達(dá)Notch配體Dll1和Dll4，可以使干細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)，如果Notch信號(hào)關(guān)閉，干細(xì)胞就會(huì)分化而失去干細(xì)胞特性。潘氏細(xì)胞可以分泌表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和Wnt激動(dòng)劑(Wnt3)，這些因素有利于干細(xì)胞的生存[13]。

1.2 類器官的體外培養(yǎng)

2009年，荷蘭Sato等[6]利用小鼠腸道上皮隱窩底部Lgr5+柱狀細(xì)胞，在基質(zhì)膠(Matrigel)中培養(yǎng)出類器官；2011年Jung等[14]用此方法將人結(jié)直腸黏膜中EphB2高表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)成結(jié)直腸類器官，同年Sato等[7]培養(yǎng)人結(jié)直腸腫瘤類器官。腸上皮中的干細(xì)胞，經(jīng)過流式細(xì)胞術(shù)富集后加入基質(zhì)膠中培養(yǎng)，可在1～2天后長出透亮球形結(jié)構(gòu)，隨后進(jìn)行分化出芽，形成類器官結(jié)構(gòu)。類器官傳代后仍保存穩(wěn)定的遺傳特性和生物學(xué)行為，并且可以凍存和復(fù)蘇[15]。類器官主要在基質(zhì)膠中生長，培養(yǎng)液主要成分有Wnt通路激活劑、EGF、骨形成蛋白抑制劑Noggin等。培養(yǎng)液模擬體內(nèi)干細(xì)胞所處的微環(huán)境，其中Wnt信號(hào)通路激活劑R-spondin-1和EGF是Lgr5+干細(xì)胞進(jìn)行增殖的重要因素；Noggin可以使類器官中隱窩數(shù)目增多；富含層粘連蛋白的Matrigel提供支持類器官生長的環(huán)境[16]。在人腸道類器官培養(yǎng)中添加一些小分子物質(zhì)，如胃泌素(gastrin)和尼克酰胺(nicotinamide)，可以延長類器官的存活時(shí)間；小分子抑制劑A83-01(Alk4/5/7的抑制劑)、SB202190(p38抑制劑)可以有效提高類器官形成率[7]。腸道類器官經(jīng)過傳代培養(yǎng)，可存活6個(gè)月以上，并且細(xì)胞的基因型和表型不會(huì)發(fā)生改變[15]。同時(shí)，人類結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞中存在的基因突變使其能在不含R-spondin-1、Noggin和EGF的培養(yǎng)基中形成類器官，原因是這些突變能異常激活自身信號(hào)通路來促進(jìn)類器官生長[17]。

2 類器官成為結(jié)直腸癌研究的重要工具

腫瘤細(xì)胞系和動(dòng)物模型通常作為結(jié)直腸癌研究的重要手段。腫瘤細(xì)胞系在培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)很多額外的突變，不能忠實(shí)地表現(xiàn)出腫瘤原有特性；也不能模擬體內(nèi)腫瘤細(xì)胞和其他基質(zhì)細(xì)胞之間的相互作用；培養(yǎng)細(xì)胞單一，缺乏不同細(xì)胞類型的層次性。動(dòng)物模型有很廣泛的應(yīng)用，但不能完全反映出人類腫瘤的基因特征和異質(zhì)性；也不能用于研究腫瘤的發(fā)生過程；并且腫瘤異種移植費(fèi)時(shí)費(fèi)力，培養(yǎng)周期長，效率不高，且很難進(jìn)行高通量藥物篩選工作[18]。而類器官培養(yǎng)能保持腫瘤原有的基因型和生物學(xué)特性，可以穩(wěn)定傳代，操作相對(duì)簡單，培養(yǎng)周期短，van de Wetering等[19]從20名結(jié)直腸癌患者的腫瘤中取材得到20處正常黏膜和27處腫瘤樣本，經(jīng)過培養(yǎng)得到19個(gè)正常類器官和22個(gè)腫瘤類器官，成功率超過90%，而且培養(yǎng)過程中存在腫瘤干細(xì)胞增殖并分化為腫瘤細(xì)胞的過程，符合腫瘤研究更深層次的要求。同樣，最近研究揭示結(jié)直腸癌發(fā)生過程中遺傳學(xué)的改變：持續(xù)的基因突變，基因拷貝數(shù)改變，染色體改變，甲基化改變[20]，類器官培養(yǎng)技術(shù)在研究腫瘤干細(xì)胞分化為不同類型腫瘤細(xì)胞的過程、揭示影響腫瘤異質(zhì)性、演化和轉(zhuǎn)移的原因、評(píng)價(jià)藥物療效方面提供了很大幫助。

2.1 腫瘤類器官基因編輯和腫瘤動(dòng)物模型建立

Roper等[21]利用動(dòng)物腸鏡將CRISPR-Cas9基因編輯后具有APC、P53和Kras突變的小鼠結(jié)腸類器官注射到小鼠腸黏膜下，建立大腸黏膜原位移植模型，6周后該模型中10只小鼠共長出15個(gè)腫瘤，12周后3只出現(xiàn)腫瘤肝轉(zhuǎn)移，之后又將人結(jié)直腸癌類器官注射到小鼠腸黏膜下，26只小鼠中有8只發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，并且得到的腫瘤高度保持原發(fā)腫瘤的形態(tài)和分化特征，而腫瘤細(xì)胞系注射后雖然也能成瘤，但形成的腫瘤缺乏轉(zhuǎn)移性，無法反映原發(fā)腫瘤的組織學(xué)特征；與之相似，O’Rourke等[22]在誘導(dǎo)小鼠腸炎形成利于腫瘤定植的微環(huán)境后，將基因編輯后的類器官懸液通過灌腸的方式注入小鼠腸管內(nèi)，成功建立原位成瘤模型，該模型在4～9周內(nèi)成瘤，21周時(shí)有肝轉(zhuǎn)移出現(xiàn)。基于基因編輯技術(shù)的類器官原位移植動(dòng)物模型的出現(xiàn)，在保持原發(fā)腫瘤組織學(xué)特征和腫瘤微環(huán)境的同時(shí)，大大節(jié)省了建立模型所需要的時(shí)間，勢(shì)必會(huì)成為今后腫瘤體內(nèi)研究的主流模型。

2.2 研究結(jié)直腸癌的演進(jìn)和藥物篩選

Schütte等[23]研究以EGF受體(EGFR)為靶點(diǎn)的結(jié)直腸癌治療藥物的敏感性和生物分子標(biāo)記物之間的相關(guān)性，對(duì)比19對(duì)結(jié)直腸癌類器官模型與傳統(tǒng)的體外成瘤模型，觀察到其中有9對(duì)模型對(duì)阿法替尼的敏感性一致，12對(duì)模型對(duì)Sapitinib敏感性一致，這為類器官模型在藥物篩選中的應(yīng)用提供了依據(jù)。Fumagalli等[24]利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)人結(jié)腸類器官進(jìn)行基因編輯，得到APC、KRAS、SMAD4和P53中三者突變組合或者4種基因都突變的類器官，隨后將這些類器官移植到小鼠盲腸壁上，觀察到4種基因都突變的類器官使9只小鼠中的4只小鼠發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，共有81個(gè)病灶。SMAD4野生型的組合中，7只小鼠中只有1只肝臟上出現(xiàn)1個(gè)轉(zhuǎn)移灶，而剩下3種組合中都沒有發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，這為研究腫瘤進(jìn)展提供了新方法。Pauli等[25]根據(jù)Ⅳ期結(jié)腸癌病人腫瘤全基因組測(cè)序得到的基因突變數(shù)據(jù)，結(jié)合類器官培養(yǎng)技術(shù)選擇相應(yīng)靶向藥物，探討藥物聯(lián)合應(yīng)用的有效性，結(jié)果顯示在含有APC突變病人的腫瘤類器官移植小鼠中，阿法替尼和伏立諾他(Vorinostat)組合明顯抑制腫瘤生長，腫瘤大小僅為FOLFOX化療方案處理后的10%(P=0.0232)。van de Wetering等[19]成功構(gòu)建具有22例結(jié)腸癌類器官的樣本庫，結(jié)合藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，觀察到O-酰基轉(zhuǎn)移酶Porcupine的一種小分子抑制劑IWP-2對(duì)含有RNF43(ring finger protein 43)突變的類器官生長有很強(qiáng)的抑制作用,而沒有RNF43突變的類器官生長卻不受其影響，這為結(jié)腸癌的治療提供了新的靶點(diǎn)。

2.3 研究結(jié)直腸腫瘤干細(xì)胞

Cortina等[26]用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)將綠色熒光蛋白標(biāo)簽標(biāo)記到Lgr5基因上，結(jié)合細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)，研究結(jié)腸癌類器官中腫瘤干細(xì)胞的演變。他們將結(jié)腸癌類器官移植到小鼠體內(nèi)，2周后觀察到Lgr5+干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)分化成具有黏液分泌和吸收功能的細(xì)胞，數(shù)量是移植前的3倍，類器官中還有部分Lgr5+干細(xì)胞位于休眠狀態(tài)，可能提示腫瘤中Lgr5+干細(xì)胞的分化受到微環(huán)境的調(diào)控。此方法可用來進(jìn)一步研究腫瘤中Lgr5+干細(xì)胞的功能，探索不同類型細(xì)胞在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、耐藥性中的作用。de Sousa e Melo等[27]利用結(jié)直腸癌類器官進(jìn)行小鼠成瘤后，用藥物殺傷腫瘤中的Lgr5+干細(xì)胞，觀察到腫瘤生長雖然停滯但是不能消退，停藥1周后腫瘤中Lgr5+干細(xì)胞從0迅速恢復(fù)到20%，腫瘤繼續(xù)生長，可能存在某種機(jī)制可以使Lgr5-大量增殖并在停藥后轉(zhuǎn)變?yōu)長gr5+干細(xì)胞；利用腫瘤類器官培養(yǎng)技術(shù)，尋找阻止腫瘤干細(xì)胞Lgr5可塑性轉(zhuǎn)化的方法，有利于腫瘤的根治。

2.4 研究結(jié)直腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的機(jī)制

Weeber等[28]利用穿刺活檢得到8例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的轉(zhuǎn)移癌組織，一部分直接進(jìn)行DNA測(cè)序，另一部分培養(yǎng)成類器官后測(cè)序，觀察到兩者90%的體細(xì)胞突變相同，腫瘤驅(qū)動(dòng)基因突變完全一致，DNA拷貝數(shù)平均相關(guān)性達(dá)到0.89，說明結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移類器官很好地保持了肝轉(zhuǎn)移病灶的遺傳學(xué)特征，為腫瘤的個(gè)體化治療提供了有力依據(jù)。Fujii等[17]利用結(jié)直腸腺瘤和息肉、不同腫瘤分期的結(jié)直腸腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌和轉(zhuǎn)移癌構(gòu)建出共55種類器官模型，觀察到這些類器官模型表現(xiàn)出與來源組織相同的組織學(xué)分型和分化程度。隨后研究者比較不同類器官對(duì)培養(yǎng)基中小生境因子(niche factor)的依賴性，觀察到結(jié)直腸腺癌分期增加，類器官對(duì)小生境因子依賴性逐漸降低，其中1例肝轉(zhuǎn)移癌類器官及其原發(fā)癌類器官幾乎不依賴小生境因子，其余4例只依賴EGF和P38抑制劑，推測(cè)結(jié)直腸癌類器官的侵襲和轉(zhuǎn)移行為可能與小生境因子無關(guān)，而與腫瘤轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)基因激活有關(guān)。Usui等[29]觀察到結(jié)直腸癌類器官含有分泌TGF-β的成纖維母細(xì)胞，TGF-β可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[30]，并且可以使成纖維母細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞，促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。

2.5 其他腫瘤類器官模型為結(jié)直腸癌的治療提供參考

目前已有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建出胰腺癌類器官模型[31]。Huang等[32]用甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2的抑制劑UNC1999處理5例病人的胰腺癌類器官，觀察到含有甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2作用位點(diǎn)的3例胰腺癌類器官生長受到抑制；使用UNC1999聯(lián)合吉西他濱處理后，又有1例類器官的生長受到抑制，這種針對(duì)腫瘤表觀遺傳學(xué)的治療方法，為結(jié)直腸癌治療提供了新思路。前列腺腫瘤類器官模型不僅來源于前列腺癌穿刺活檢組織，也可由血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)獲得，在更深層面上促進(jìn)了“液體活檢”的臨床應(yīng)用[33]。

3 展望

類器官雖然具有廣闊的應(yīng)用前景，但是缺乏間葉細(xì)胞支持、神經(jīng)支配和血管支持，因此類器官與真正的器官之間還有很大距離。新的類器官培養(yǎng)模式的出現(xiàn)允許上皮類器官和間質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)，可以進(jìn)一步利用類器官研究腫瘤與間質(zhì)組織細(xì)胞的相互作用[34]，而腫瘤類器官與神經(jīng)、血管組織共培養(yǎng)研究的進(jìn)展也正在彌合類器官培養(yǎng)的這一差距；隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，我們可以更加靈活和準(zhǔn)確地在基因?qū)用娌僮黝惼鞴?，使通過生物學(xué)行為驗(yàn)證的基因組學(xué)“批量”研究成為可能；類器官作為研究結(jié)直腸癌的模型，結(jié)合多層面多組學(xué)研究技術(shù)，可以全面揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中不同組學(xué)信息的變化，深入理解腫瘤的發(fā)生過程，并發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的驅(qū)動(dòng)因素，探索新的治療模式；類器官培養(yǎng)技術(shù)可以用來高通量篩選抗腫瘤藥物，同時(shí)類器官培養(yǎng)能保持腫瘤原有的基因型和生物學(xué)特性，這使以病人為中心的超精準(zhǔn)個(gè)體化治療成為現(xiàn)實(shí)。

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1009-6604(2017)12-1126-04

10.3969/j.issn.1009-6604.2017.12.020

國家自然科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)：81672361)

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2017-07-03)

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王惠群)