梁華，王燕，李奇瑋，隋雨桐，閆起，劉麗瑋

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

方劑研究

四君子湯補脾益氣的主要有效成分與系統(tǒng)生物學(xué)芻議

梁華，王燕，李奇瑋，隋雨桐，閆起，劉麗瑋

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

四君子湯是經(jīng)典補氣方，臨床多用于脾胃氣虛證的治療。隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的迅速發(fā)展，對于方證相關(guān)的生物學(xué)信息研究日益增多。本文從四君子湯發(fā)揮補脾益氣作用的主要有效成分及現(xiàn)代藥理學(xué)研究入手，結(jié)合基因組學(xué)、蛋白組學(xué)及代謝組學(xué)等方面探討四君子湯補脾益氣的作用及其對應(yīng)證候的屬性，為方證相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)。

四君子湯；脾氣虛證；方證相關(guān)；系統(tǒng)生物學(xué)

四君子湯由人參、白術(shù)、茯苓及甘草組成。方中君藥人參大補元氣、溫養(yǎng)中焦，白術(shù)補脾益氣為臣，佐以甘淡之茯苓，使參、術(shù)補而不滯，伍用炙甘草，甘溫益氣、補脾和中，共奏補益脾氣之功效[1]。該方始載于《太平惠民和劑局方》卷三：“榮衛(wèi)氣虛、臟腑怯弱。心腹脹滿，全不思食，腸鳴泄瀉，嘔噦吐逆，大宜服之?！笨梢娝木訙钤缰饕糜谄⑽笟馓摗⑦\化失調(diào)所致脾胃氣虛諸證，脾胃虛弱則氣血生化乏源，可見氣短乏力、語聲低微，不思飲食，大便溏薄等癥狀，脾虛還易引起健忘、注意力不集中，反應(yīng)遲鈍，后世眾多補脾益氣方劑多從此方衍化而來。

1 四君子湯主要有效成分及藥理作用研究

四君子湯作為經(jīng)典的補脾益氣方劑，現(xiàn)代藥理學(xué)研究多著重于其增強機體免疫功能，調(diào)節(jié)胃腸活動、胃腸激素，修復(fù)胃腸黏膜損傷，促進消化吸收等方面[2]。因具有抗腫瘤、抗突變及抗疲勞作用，常用于癌癥放化療的輔助治療，此外四君子湯有促進內(nèi)分泌腺功能、耐氧、修復(fù)肝臟和延緩衰老等作用[3]。中藥活性成分是其發(fā)揮療效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，Wang等[4]采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方四君子湯的主要有效成分為多糖、皂苷、黃酮及揮發(fā)油類物質(zhì)。

1.1 多糖類

多糖是重要的免疫調(diào)節(jié)劑，唐華羽等[5]通過脾虛造模探討四君子湯多糖對小鼠腸道菌群及免疫功能的影響，結(jié)果顯示其可糾正腸道菌群失調(diào)，恢復(fù)脾虛小鼠的免疫功能。四君子湯中的多糖成分多來源于人參，其次是白術(shù)和茯苓。人參多糖對免疫抑制模型及刀豆蛋白A誘導(dǎo)的炎癥模型小鼠都具免疫調(diào)節(jié)作用，其負相調(diào)節(jié)效應(yīng)說明多糖有助于免疫穩(wěn)態(tài)的維持[6]。白術(shù)多糖對體液免疫及細胞免疫均有調(diào)節(jié)作用，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖能夠顯著提高Kupffer細胞吞噬功能，增加Kupffer細胞釋放NO和TNF-α等免疫因子[7]。而茯苓多糖能夠活化環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫抑制小鼠腸相關(guān)組織B細胞水平、促進淋巴細胞遷移，對腸道黏膜免疫系統(tǒng)的作用強于對外周免疫系統(tǒng)的作用[8]。

1.2 皂苷類

人參和甘草均含有皂苷類化合物。人參中的皂苷也是其主要的有效活性成分，其大部分是三萜苷元苷[9]。研究表明人參總皂苷能夠升高機體細胞因子水平，還可通過上調(diào)腸道熒光假單胞菌和丁酸梭菌的數(shù)量，促進優(yōu)勢菌的增殖，抑制腸道病原菌的定植生長，從而調(diào)節(jié)胃腸功能[10-11]。甘草皂苷又稱甘草酸，其對免疫活性細胞、細胞因子、補體等均有免疫調(diào)節(jié)作用，采用流式細胞術(shù)分析甘草酸對小鼠脾樹突狀細胞成熟及功能的影響，結(jié)果顯示甘草酸可上調(diào)CD40、CD86和MHC-II的表達，從而促進細胞因子IL-12、IL-10及IFN-c的生成，減少IL-4生成[12-13]。

1.3 黃酮類

四物湯中的黃酮類化合物主要來源于甘草，甘草黃酮提取物可促進小腸隱窩上皮細胞IEC-6遷移，影響細胞內(nèi)多胺調(diào)控信號通路，有助于胃腸黏膜損傷的修復(fù)[14]。劉冬羽[15]探究甘草總黃酮(LFs)治療潰瘍性結(jié)腸炎的機制，發(fā)現(xiàn)LFs不僅顯著降低結(jié)腸濕重系數(shù)和結(jié)腸大體形態(tài)，還影響結(jié)腸組織MPO活性、減少NO含量的同時增加結(jié)腸組織GSH和SOD含量。幽門螺旋桿菌(Hp)是引起慢性胃炎、胃潰瘍的重要致病因素，Hp感染后可誘導(dǎo)胃黏膜局部的細胞因子表達上調(diào)。楊行堂[16]等發(fā)現(xiàn)100 μg的甘草黃酮對Hp即具有一定的抑殺作用，為中藥活性成分抑菌的運用提供了實驗依據(jù)。

1.4 揮發(fā)油及其他

四君子湯中揮發(fā)類物質(zhì)主要來自白術(shù)，白術(shù)揮發(fā)油中化學(xué)成分復(fù)雜，有蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯、β-桉葉醇等。其中蒼術(shù)酮可以調(diào)節(jié)肥大細胞脫顆粒，抑制炎癥反應(yīng)，β-桉葉醇可通過抑制多巴胺D2受體和5-HT3受體來刺激小鼠胃排空，加速小腸蠕動[17-18]。四君子湯中除以上主要化學(xué)成分外，有學(xué)者還鑒定出沒食子酸、苯甲酸，阿魏酸等有機酸物質(zhì)[19]。

綜上所述，隨著對四君子湯復(fù)方活性成分的鑒定分析逐漸增多，使其更多的成分被人們所認識。復(fù)方中總化學(xué)成分藥理作用的研究多偏重于探討單味藥，對復(fù)方整體的藥效研究偏少。推測這一現(xiàn)狀與藥物組合后各化學(xué)物質(zhì)可能發(fā)生變化，以及隨著復(fù)方煎煮方法、劑型的不同，各化學(xué)成分含量將受到影響，用于藥理學(xué)實驗研究難以準(zhǔn)確得出理想結(jié)果有關(guān)。

2 方證相關(guān)與系統(tǒng)生物學(xué)研究

系統(tǒng)生物學(xué)是從整體水平研究復(fù)雜生物所有基因、蛋白等組分的生命科學(xué)，它包含基因組學(xué)、蛋白組學(xué)及代謝組學(xué)在內(nèi)的一系列組學(xué)技術(shù)，對中醫(yī)證候客觀化分析、復(fù)方分子機理研究有重大意義[20]。中醫(yī)學(xué)中的整體觀念融合了古代唯物論和辨證法思想，認為人體是一個內(nèi)外聯(lián)系、自我調(diào)節(jié)的有機整體[21]。中醫(yī)的“證”既是病機的外在體現(xiàn)，也是辨證論治的前提條件。辨證論治與整體觀念相結(jié)合是中醫(yī)診療疾病的重要手段，而方證關(guān)系是辨證論治的重要組成部分，所蘊涵的重要科學(xué)問題是方與證間的關(guān)聯(lián)性大小及其現(xiàn)代生物學(xué)基礎(chǔ)[22-23]。隨著系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，在與中醫(yī)藥現(xiàn)代研究的有力結(jié)合過程中，對方證關(guān)系的本質(zhì)內(nèi)涵進行了更全面的探究。

2.1 四君子湯方證與基因組學(xué)研究

基因組學(xué)是對生物體所有基因信息和染色體組成進行繪制遺傳圖譜和序列分析，從整體水平研究不同基因的結(jié)構(gòu)與功能[24]?；蚪M學(xué)滲透到中醫(yī)藥研究后，多用于疾病相關(guān)證候基因表達的比較分析，從而揭示中藥或復(fù)方干預(yù)相關(guān)證候的多途徑調(diào)節(jié)作用。復(fù)方的功效主要是針對相對應(yīng)的證候而言，根據(jù)以方測證，測定用藥前和用藥取效后兩種不同狀態(tài)的靶細胞的基因表達差異，來探討證的相關(guān)基因或特異基因，將對中醫(yī)證本質(zhì)的研究有重要意義。

脾氣虛證研究的動物模型常采用多因素聯(lián)合造模，何麗娟等[25]檢測了以飲食不節(jié)加力竭游泳所致脾虛大鼠胃組織中各基因的表達情況，結(jié)果顯示cAMP、CREB、GP、PHK和PKA基因及蛋白表達均減少，而四君子湯能使以上基因表達升高，推測該方是通過激活胃cAMP-PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來促進能量代謝，改善脾虛狀態(tài)。田茸等[26]分別檢測了脾氣虛大鼠海馬、小腸在不同時間段CaM信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵基因CaM/CaMKⅡ及蛋白表達水平，比較不同組的干預(yù)效果，發(fā)現(xiàn)四君子湯通過影響CaM/CaMKⅡ表達對脾氣虛證起到時相性動態(tài)干預(yù)。上述研究說明，信號通路中關(guān)鍵基因表達情況及基因組DNA轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的mRNA的含量變化，可以體現(xiàn)四君子湯對脾氣虛證模型動物的多靶點干預(yù)作用。

2.2 四君子湯方證與蛋白組學(xué)研究

蛋白質(zhì)組學(xué)是指高通量、系統(tǒng)化的研究某一細胞、組織或者體液中全部蛋白質(zhì)組成、功能及其動態(tài)變化規(guī)律的學(xué)科[27]?？梢酝ㄟ^對比相關(guān)證候模型用藥前后，細胞或動物器官組織的蛋白質(zhì)表達譜的差異來了解方劑與其對應(yīng)證候的關(guān)系[28]。

崔永霞[29]采用飲食不節(jié)加勞倦過度法建立脾氣虛證大鼠模型，觀察該模型大鼠回腸組織中的蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)脾氣虛證與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78和胰蛋白酶表達上調(diào)以及白蛋白下調(diào)相關(guān)?；谥嗅t(yī)“心脾相關(guān)”理論，曹彬[30]采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)觀察四君子湯對慢性心衰大鼠的作用，以肝臟組織為樣本，篩選出表達明顯增強的有NADH脫氫酶、甲狀腺激素結(jié)合蛋白和角蛋白等8個蛋白，表達明顯減弱的蛋白有鈣網(wǎng)蛋白前體和HMG-CoA合成酶，這些蛋白參與的生物進程主要與能量代謝、內(nèi)分泌及應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。而方煥松等[31]選用心肌組織為樣本，發(fā)現(xiàn)四君子湯給藥后31種蛋白質(zhì)表達上調(diào)，28種蛋白質(zhì)表達下調(diào)，最終鑒定出4種有顯著差異的蛋白，分別為Suclg2蛋白、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體、肌球蛋白輕鏈2和絲氨酸蛋白酶抑制劑A3N，說明四君子湯可以調(diào)節(jié)肌細胞能量代謝、改善心肌重構(gòu)和提高心肌收縮功能。

2.3 四君子湯方證與代謝組學(xué)研究

代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)中的重要組成部分，主要研究生物體在受到各種刺激后體內(nèi)小分子代謝物功能狀態(tài)的變化。早期分析技術(shù)的局限性使得生物樣品中復(fù)雜代謝物的定性和定量化分析面臨巨大挑戰(zhàn)，隨著先進技術(shù)手段的不斷更新，結(jié)合多元統(tǒng)計分析，使得復(fù)雜樣本的代謝產(chǎn)物鑒定更加精準(zhǔn)，為中醫(yī)藥整體觀下復(fù)方及證候研究提供了更多選擇[32]。

甄畢賢等[33]采用LC-Q/TOF-MS技術(shù)研究脾氣虛證大鼠血清代謝物譜的變化，發(fā)現(xiàn)大鼠血清中肉毒堿、棕櫚酰肉堿、亞油肉堿、β-羥基丁酸、苯丙氨酸、PGA2、膽色素含量顯著下降，而酵母氨酸和胞嘧啶等物質(zhì)升高，四君子湯治療后上述小分子代謝物的含量有不同程度的恢復(fù)。許家珍等[34]通過LC-MS技術(shù)平臺，發(fā)現(xiàn)在脾虛小鼠血清中與激素調(diào)控有關(guān)的花生四烯?；拾彼帷⒒ㄉ南┧峤z氨醇含量大幅下降，與脂肪酸氧化代謝相關(guān)的十四碳酰基肉堿和3-羥基棕櫚?；鈮A明顯降低，而四君子湯復(fù)方多糖能使上述標(biāo)志物含量接近正常組水平。以上研究說明四君子湯補脾益氣的作用與調(diào)節(jié)脂類代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝通路，以及參與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、能量代謝有關(guān)。本課題組前期以自然衰老模型小鼠為研究對象，對比研究了四君子湯對不同月齡雌、雄小鼠的干預(yù)作用，發(fā)現(xiàn)隨著增齡性改變，小鼠血漿樣本中亮氨酸、花生四烯酸和谷胱甘肽顯著降低而血栓素升高，腎臟組織中花生四烯酸、泛酸、輔酶A和焦谷氨酸等標(biāo)記物出現(xiàn)紊亂，提示氣虛證相關(guān)的代謝失調(diào)大多與糖代謝、脂代謝和氨基酸代謝通路異常有關(guān)，四君子湯通過回調(diào)通路中多種差異物發(fā)揮作用[35-36]。

3 小結(jié)與展望

方劑是將各具特色的群藥通過君臣佐使配伍形成的整體，通過調(diào)偏性、制毒性，與特定證候之間彼此作用，在辨證論治指導(dǎo)下方可發(fā)揮良效。所謂有是證則用是方，四君子湯是治療脾氣虛證的常用方劑，用四君子湯對脾氣虛證模型進行干預(yù)來評價方劑效應(yīng)，體現(xiàn)了方證對應(yīng)關(guān)系。而方證對應(yīng)是方證相關(guān)領(lǐng)域的一個方面，因同一證候可出現(xiàn)在不同的疾病中，同一疾病亦能呈現(xiàn)出不同證候，使得方證關(guān)系研究較為復(fù)雜。對于經(jīng)典方劑的探討，人們多致力于其藥理作用及物質(zhì)基礎(chǔ)挖掘，且單味藥的分析較多，復(fù)方中的單味藥藥理作用及主要活性成分研究體現(xiàn)了該方發(fā)揮功效的基礎(chǔ)組成，對臨床應(yīng)用有一定指導(dǎo)意義。然而方劑療效探究與對應(yīng)證候密不可分，拋開證候只言藥效并不完全符合中醫(yī)理論的特點。此外，無論動物實驗還是臨床研究中，各種人為復(fù)制的病證模型難以滿足對中醫(yī)證候的充分體現(xiàn)。

隨著系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)對中醫(yī)藥研究的沖擊，更多學(xué)者通過基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)多學(xué)科交叉融合來進行生物信息整體性研究。遺傳信息可以體現(xiàn)方劑干預(yù)后機體基本生物進程的變化，通過基因網(wǎng)絡(luò)的識別和關(guān)聯(lián)分析，對比方劑效應(yīng)和對應(yīng)的證候在信號通路中相關(guān)基因譜的表達和蛋白質(zhì)水平的異同，經(jīng)統(tǒng)計分析找尋兩者生物信息的契合點。然而生物體在特定條件和時間段中并非所有基因均充分表達或翻譯，藥物進入人體后的各種變化難以度量，使得一定條件下方證研究結(jié)果仍需考量，而代謝組學(xué)研究以更符合中醫(yī)整體觀為特點，對以上問題得以補充，將使方證關(guān)系的評價更加客觀。系統(tǒng)生物學(xué)中多組學(xué)相互滲透互補，更多先進技術(shù)的匯入，在病證結(jié)合基礎(chǔ)上運用以方測證研究模式將方藥與證候緊密聯(lián)系起來，用現(xiàn)代科學(xué)語言揭示方證關(guān)系的內(nèi)在機制，在中醫(yī)藥方劑現(xiàn)代化的深入研究方面將有不可估量的應(yīng)用前景。

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EffectiveIngredientsforInvigoratingSpleen-QiinSijunziDecoctioninTermsofSystemBiology

LIANG Hua,WANG Yan, LI Qi-wei, SUI Yu-tong,YAN Qi, LIU Li-wei

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Sijunzi decoction is a classic formula to supplement qi, which is often used in the treatment of spleen deficiency syndrome. With the rapid development of TCM modernization, relative biological studies were more paid attention to. This research discussed the effect of Sijunzi decoction on invigorating spleen and replenishing Qi and its corresponding syndrome based on genomics, proteomics and metabonomics, in terms of its main effective components and modern pharmacological research, which laid a solid foundation for the relationship between formula and syndrome.

Sijunzi decoction; Syndrome of spleen-Qi deficiency; Relationship between formula and syndrome; System biology

R285

A

1002-2392(2017)06-0096-04

2017-09-13

2017-10-20

國家自然科學(xué)基金項目(81473563)

梁華(1962-)，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事衰老及營養(yǎng)代謝相關(guān)病癥的方劑配伍研究。