張 媛 ，賀桂芳 ，?，卞美璐

（1.北京大學中日友好臨床醫(yī)學院，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100029）

生物標記物對于宮頸癌的診治和研究進展

張 媛1，賀桂芳1，2?，卞美璐2

（1.北京大學中日友好臨床醫(yī)學院，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100029）

宮頸癌發(fā)病率在全球女性腫瘤中位居第3位，在發(fā)展中國家位居第2位[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估算，全球每年約53萬女性發(fā)生宮頸癌，27.5萬女性死于宮頸癌。宮頸癌在多數(shù)發(fā)展中國家，占女性腫瘤死因的第一位[2]。我國宮頸癌每年新發(fā)病例為13萬例，占世界宮頸癌每年新發(fā)病例的28%。HPV的持續(xù)感染是其發(fā)生的必要條件。宮頸癌上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasias，CIN）Ⅰ～Ⅲ是重要的宮頸癌前病變，臨床上迫切需要更為簡便、有效的檢測手段，協(xié)助醫(yī)生更早發(fā)現(xiàn)病變；在避免過度治療的同時減少漏診，及時給予恰當?shù)呐R床干預。運用生物標志物輔助細胞形態(tài)學篩查，有利于更準確地發(fā)現(xiàn)高級別宮頸病變，從而及時采取干預措施，達到一級預防的目的。細胞腫瘤抑制蛋白P16以及Ki67已經(jīng)確定為分子標記物來檢測病變嚴重程度進展及預后[3]，因此P16和Ki67的表達對于宮頸癌的發(fā)展有重要的臨床意義[4]。

1 生物標記物檢測

1.1 P16與CIN的關(guān)系

P16基因是一個多腫瘤抑制基因，主要作用在于能夠直接參與細胞周期的調(diào)節(jié)，抑制細胞周期素依賴性蛋白激酶CDK4／CDK6的活性，阻止細胞從G1期進入s期。P16基因的失活將導致細胞周期失控，細胞異常增殖而癌變。該基因產(chǎn)物對CDK4的活性具有抑制作用，因而也稱為P16 INK4（INK4，inhibitor of CDK4）。 細胞周期依賴蛋白激酶抑制劑P16和細胞增殖相關(guān)核抗原Ki67與細胞周期調(diào)控相關(guān)。兩者在子宮頸癌中表達的升高可能與HPVE7蛋白的過度表達引起的Rb失活從而導致細胞內(nèi)的E2F基因表達增高有關(guān)。

P16的高表達與宮頸癌有一定的相關(guān)性，在組織病理學中這一結(jié)論已經(jīng)得到證實[5]。 Tsoumpou在61例研究中，通過META分析得出結(jié)論，P16免疫染色在病變的細胞學和病理學中的相關(guān)性。報道指出，P16在細胞學顯示為異常的時候表達率明顯增高。組織學顯示，在正常組織中表達為2%，在CIN1中表達為38%，在CIN2中表達為68%，在 CIN3中表達為 82%[6]。 Roelens等[7]對 P16 INK4a免疫細胞化學染色與人乳頭瘤病毒基因檢測HC-Ⅱ?qū)SCUS和LSIL的分流能力做了薈萃分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P16 INK4a預測ASCUS和LSIL進展為高級別子宮頸病變的敏感度分別為83.2%、83.8%，特異度分別為71.0%、65.7%，與HC-Ⅱ相比，兩者的敏感度相近，但前者的特異度較高。

研究發(fā)現(xiàn)，在基線為CINⅠ的患者，p16 INK4a陽性與陰性婦女相比，2年后進展為高級別子宮頸病變的風險前者是后者8.25倍，表明p16 INK4a的過度表達與子宮頸病變程度相關(guān)，低級別子宮頸病變組織中P16 INK4a過度表達能對其以后進展為高級別子宮頸病變具有預測能力[8]。進而可以大膽預測，在CIN2級別病變中，P16陽性與陰性婦女對比，未來進展為更高級別子宮頸癌的風險會明顯增加，因而P16蛋白可以作為有效的指標指導CIN2級別病變的臨床治療。

1.2 Ki67與CIN的關(guān)系

Ki67的表達與細胞增殖活動性密切相關(guān)，既往研究中發(fā)現(xiàn)，Ki67在正常宮頸組織、CIN及宮頸癌組織中隨病情嚴重程度加重，進而表達水平逐步升高。而且在CIN1、CIN2及CIN3之間Ki67的陽性表達也存在著統(tǒng)計學差異。這提示Ki67可以視為一種反應(yīng)宮頸上皮內(nèi)細胞異型性的比較靈敏的標志物。Kruse等通過免疫定量法研究進一步證實了Ki67有較強的預測宮頸病變發(fā)展趨勢的價值，其可靠性甚至超過了CIN分級[9]。Alameda等研究結(jié)果顯示，Ki67在低級別CIN、高級別CIN和浸潤癌組織標本中的陽性表達分別為25%、68%和85.5%，表明宮頸病變嚴重程度和Ki67的表達水平呈正相關(guān)[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，52個CIN宮頸錐切的標本中，Ki67的表達在CINⅢ中較CINⅠ、CINⅡ高。用Ki67的免疫定量法及傳統(tǒng)的CIN分級及人乳頭瘤病毒 （human papillomavirs，HPV）感染狀態(tài)在預測CINⅠ、Ⅱ是否發(fā)展為CINⅢ方面進行比較，Ki67具有更強的預測性[12]。

Ki67表達的陽性率隨著宮頸癌臨床分期的升高而增加，低分化腫瘤組織中的表達水平高于高分化腫瘤組織，提示Ki67的高表達在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起到一定作用，其表達水平可以判斷疾病預后。也有研究學者提出Ki67可以作為宮頸癌轉(zhuǎn)移的一種預測指標。Silva的研究中，觀察組作為宮頸癌患者治性術(shù)后的標本，對照組為子宮因良性腫瘤而切除的標本。Ki67的表達在觀察組組織學陽性標本中均比在對照組中的陽性表達顯著增高。Kimura等認為從CINⅠ中 Ki67的標記指數(shù)在累及腺體部位的腫瘤逐漸增加，表明Ki67的免疫染色對累及腺體部位的CIN是一種有用的病理診斷指標。Kamer認為Ki67能夠作為一個反應(yīng)細胞增殖的慚怍在宮頸癌中被使用，在腫瘤早期，Ki67的變化能預測腫瘤轉(zhuǎn)移的可能性[13]。1.3 P16+Ki67聯(lián)合檢測及意義

P16和Ki67的雙染色在宮頸癌患者中應(yīng)用廣泛。Wentzensen等對CINtes Plus技術(shù)預測子宮頸癌前病變進行了評估，研究納入了625例轉(zhuǎn)型陰道鏡檢查的婦女，結(jié)果顯示，在正常子宮頸中、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ組織中 P16和 Ki67的陽性率分別為26.8%、46.5%、82.8%、92.8%，陽性率隨著病理級別升高呈增高趨勢[14]。在776里患者中P16跟Ki67的雙染色的敏感性分別為92.2%在ASCUS和在低級別SIL中94.2%特異性分別為80.6%和68%。因此雙染色對比單獨P16單染色在HPV感染患者中具有更高的特異性。雙染色具有更高的臨床應(yīng)用價值。在歐洲，通過27456為患者通過細胞學雙染色與HPV（HCⅡ）檢測，顯示細胞學雙染色對于CINⅡ或者更高級別病變中有更高的診斷價值。

2 其他生物標記物

2.1 微小染色體維持蛋白2（MCM2）

最近研究表明，微小染色體維持蛋白和拓撲異構(gòu)酶ⅡA蛋白共同表達在HPV感染的細胞的不正常的細胞周期S期，并且增加HPV E6/E7蛋白的表達，因此很有可能成為宮頸癌的生物預測指標[15，16]。微小染色體維持蛋白2是真核細胞DNA復制啟動的許可因子[17]。其在增殖細胞中表達水平高，在靜止細胞和分化的細胞中不表達或者表達水平很低。這使得其可作為不典型增生和腫瘤的生物學標記物。在病變細胞中的表達及分布逐漸從基底層向表皮推移，直至上皮全層。通過檢測MCM2蛋白在不典型增生細胞中的水平，可預測腫瘤進展情況。Rosamilia等[18]研究發(fā)現(xiàn)，從正常宮頸上皮到CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ，MCMⅡ蛋白陽性表達逐漸增加。研究發(fā)現(xiàn)78例宮頸癌Ⅱ期患者放療后手術(shù)切除標本的MCM2在38例放射抵抗組中有31例（81．5%）陽性，而40例放射敏感組中只有28例陽性，認為MCM2可作為評估腫瘤放療療效的指標。MCM2直接調(diào)控真核細胞復制的啟始。其異常表達反映了具有癌變潛能的細胞被鎖定在細胞周期中不斷地進行異常復制、增殖，并與一些腫瘤的臨床生物學特征及預后密切相關(guān)。檢測MCMⅡ的表達有助于宮頸病變的診斷和預后評價，而關(guān)閉MCMⅡ的表達則可能成為宮頸病變治療的新靶點。

2.2 MiRNAs

miRNAa是一段小的沒有編碼的RNA調(diào)節(jié)基因，它的高表達跟人類的很多腫瘤有關(guān)，包括宮頸癌[19]。一些miRNA， 例如 miR-9、miR-127、miR-145、miR-146a、miR-199a、miR-200a和miR-424，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在宮頸癌細胞中失控[20，21]。Hou等[22]用RT-PCR檢測宮頸癌細胞株和癌組織，發(fā)現(xiàn)miR-196a顯著高表達，用克隆形成試驗、熒光素酶報告試驗等方法進一步研究，發(fā)現(xiàn)FOXO1及p27Kip1為其靶基因，而后兩者為PI3K/Akt信號通路的關(guān)鍵因子。通過上調(diào)miR-196a可以促進宮頸癌細胞的增殖，推測miR-196a在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中具有抑癌基因的作用。Kogo等[23]對79例宮頸癌組織標本進行miRNA表達譜分析，發(fā)現(xiàn)miR-218在宮頸癌患者中表達水平顯著下調(diào)，miR-218低水平預示著更低的生存率及更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，miR-218過表達可以抑制宮頸癌細胞的遷移和侵襲。研究證實人乳頭瘤病毒（HPV），尤其高危型HPV16及HPV18的感染與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Yu等[24]報道HPV16可以上調(diào)miR-92的表達，后者通過下調(diào)PTEN促進SiHa的增殖性和侵襲性，PTEN是一種腫瘤抑制因子，通過阻止細胞生長、分裂的速度過快或者分裂不受控制的方式，進而調(diào)控細胞分裂周期。Zhang等[25]報道外源性miR-129-5p可以抑制HeLa細胞HPV18的增殖，并促進細胞凋亡。因此HPV感染中MiRNA的差異表達對宮頸癌診治方法、探索具有治療意義的生物靶點具有重要的臨床意義。2.3 其他生物標記物

除上述生物標記物外，還有一些與HPV感染或細胞增殖相關(guān)的標志物可能會成為子宮頸癌篩查的新指標。Brn-3a是POU家族細胞轉(zhuǎn)錄因子的一員，主要在神經(jīng)和子宮頸細胞中表達，在HPV上游調(diào)節(jié)區(qū)和子宮頸癌細胞的增殖中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，Brn-3a表達與子宮頸病變級別的增高相關(guān)，提示其可以作為細胞學篩查的輔助診斷工具。禽急性成髓細胞白血病病毒致癌基因同源基因2是編碼DNA結(jié)合蛋白的MYB原癌基因家族的一員，與細胞增殖和分化相關(guān)，在子宮頸癌、子宮頸腺癌、CIN組織中過度表達，其能否作為子宮頸癌篩查的指標還需進一步證實。生存素屬于凋亡蛋白抑制家族成員，參與細胞的分裂和凋亡，在子宮頸癌中呈過度表達狀態(tài)，并隨子宮頸病變級別的升高而升高，還與HPV感染相關(guān)，目前還需要更大范圍的研究評價其能否用于子宮頸癌篩查。

3 臨床意義和展望

目前我國對于宮頸病變存在過度診治的現(xiàn)象，尤其是對CINⅡ的患者；P16及Ki67對于CIN的診斷有極好的指導作用；單純的病理診斷取決于閱片者的水平和主觀性；缺少足夠的靈敏度和特異度；而結(jié)合免疫組化可以增加宮頸病變診斷的準確性，P16聯(lián)合Ki67在宮頸組織的表達有助于確診宮頸病變的分級，可以減少宮頸病變的過度診治，如CINⅡ的患者會進行宮頸錐切手術(shù)。對有生育要求的患者，縮短女性宮頸的長度并降低患者宮頸承托力，該手術(shù)影響女性妊娠期間宮頸功能而容易導致早產(chǎn)。宮頸錐切術(shù)切除了女性宮頸部分分泌黏液的組織，明顯影響宮頸黏液分泌，而含有抑菌物質(zhì)的宮頸黏液分泌減少，明顯增加了病原微生物進入女性生殖系統(tǒng)的概率，進而增加患者流產(chǎn)、胎膜早盤和早產(chǎn)的風險。如結(jié)合免疫組化P16及Ki67表達為陰性，可以采取觀察,從而減少宮頸病變給患者帶來的經(jīng)濟及心理壓力。因此，P16和Ki67的聯(lián)合檢測，對于預測CINⅡ患者病情進展，以及減少不必要的宮頸錐切術(shù)并避免漏診，具有一定的臨床價值。

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R711.74

A

1001-0025（2017）05-0307-03

10.3969/j.issn.1001-0025.2017.05.013

1，2* 本文通訊作者。

張 媛（1990-），女，碩士研究生。

2017-04-17

2017-06-05