王坤楊，張 偉，張雙喜，劉宏偉，王 軻，杜麗璞，林志珊，葉興國

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學(xué)工程，北京 100081；2寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所，銀川 750105）

化學(xué)殺雄劑SQ-1和阿拉伯葡聚糖蛋白對(duì)小麥品種間雜交及遠(yuǎn)緣雜交成胚率的影響

王坤楊1，張 偉1，張雙喜2，劉宏偉1，王 軻1，杜麗璞1，林志珊1，葉興國1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學(xué)工程，北京 100081；2寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所，銀川 750105）

【目的】探究化學(xué)殺雄劑SQ-1對(duì)小麥品種間、小麥與近緣植物間、小麥與遠(yuǎn)緣植物間雜交成胚率的影響，以及阿拉伯葡聚糖蛋白對(duì)小麥與玉米雜交成胚率和得苗率的影響。研究結(jié)果對(duì)于合理選用小麥雜交方式，提高小麥雜交結(jié)實(shí)率和利用玉米誘導(dǎo)小麥單倍體植株的效率具有重要意義?！痉椒ā客ㄟ^在小麥拔節(jié)期噴施化學(xué)殺雄劑SQ-1，開花期分別授以小麥花粉和遠(yuǎn)緣植物（黑麥、玉米）花粉，并在小麥?zhǔn)谟衩谆ǚ酆蟮奶幚硪褐屑尤氩煌瑵舛鹊陌⒗暇厶堑鞍祝╝rabinogalactan proteins，AGP），對(duì)小麥與玉米雜交后產(chǎn)生的幼胚進(jìn)行離體拯救培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)授粉小花數(shù)、接種幼胚數(shù)、膨大穎果數(shù)、結(jié)實(shí)粒數(shù)、萌發(fā)單倍體幼胚數(shù)和單倍體植株數(shù)，計(jì)算結(jié)實(shí)率、穎果膨大率、成胚率、萌發(fā)率和成苗率并對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)合細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果，研究SQ-1對(duì)小麥品種間雜交及遠(yuǎn)緣雜交結(jié)實(shí)性的影響，以及AGP對(duì)小麥單倍體胚誘導(dǎo)率的影響?！窘Y(jié)果】在不同小麥品種間雜交中SQ-1處理結(jié)實(shí)率19.8%—83.3%，人工去雄的結(jié)實(shí)率為69.4%—93.0%，SQ-1對(duì)不同品種的影響不同，F(xiàn)ielder對(duì)SQ-1的反應(yīng)比較敏感；在中國春與蘭州黑麥雜交中，SQ-1處理的結(jié)實(shí)率為65.5%，人工去雄處理的結(jié)實(shí)率為78.8%，兩種處理方式產(chǎn)生的F1雜種的染色體數(shù)均為28條；在不同小麥品種與玉米品種鄭單 58雜交中，SQ-1處理小麥單倍體胚的成胚率為 1.11%—1.41%，人工去雄小麥單倍體胚的成胚率為2.38%—14.29%；在小麥與玉米雜交后的處理液中添加 0.5—2.0 g·L-1AGP一定程度地提高了小麥單倍體胚獲得率和成苗率。另外，在玉米花粉誘導(dǎo)的單倍體胚離體培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)13.07%的胚發(fā)育出了2—6株苗；顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，玉米花粉誘導(dǎo)后18 d左右小麥單倍體胚上出現(xiàn)了多個(gè)突起，這些突起在離體培養(yǎng)條件下進(jìn)一步發(fā)育為形態(tài)健全的小植株，其染色體數(shù)目均為21條?！窘Y(jié)論】化學(xué)殺雄劑SQ-1減低了小麥品種間雜交及小麥與黑麥、玉米間雜交的成胚率，AGP提高了小麥與玉米間雜交單倍體成胚率和成苗率。

普通小麥；化學(xué)殺雄劑SQ-1；阿拉伯葡聚糖蛋白；小麥品種間雜交；遠(yuǎn)緣雜交；單倍體胚

0 引言

【研究意義】小麥（Tritium aestivum L.）是世界上分布范圍較廣、種植面積較大、單產(chǎn)和總產(chǎn)量較高的糧食作物之一，作為重要的人類食品、動(dòng)物飼料和加工原料，其產(chǎn)量和品質(zhì)對(duì)國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的改善至關(guān)重要[1]。其中，培育優(yōu)良品種是提高小麥產(chǎn)量、改進(jìn)小麥品質(zhì)的主要措施[2]。在眾多小麥育種方法中，常規(guī)雜交育種是最為有效的途徑。利用玉米花粉誘導(dǎo)小麥單倍體的加倍單倍體途徑是正在興起的育種技術(shù)[3-5]，并利用該技術(shù)培育了小麥新品種[5-6]，具有潛在發(fā)展空間?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】去雄是小麥雜交育種、遠(yuǎn)緣雜交育種和基于染色體消除加倍單倍體育種中一項(xiàng)繁瑣的工作，常常需要花費(fèi)較長時(shí)間和較多人力，化學(xué)殺雄劑（chemical hybridization agent，CHA）可以有效解決這一問題[7]。在長期的育種實(shí)踐中，人們嘗試了多種化學(xué)殺雄劑[8-10]，但效果都不盡理想，存在藥效不穩(wěn)定、殺雄不徹底、環(huán)境不友好等缺點(diǎn)[11]，沒有充分發(fā)揮化學(xué)殺雄在育種中的作用?；瘜W(xué)殺雄劑 SQ-1很好地克服了上述缺點(diǎn)，效果持續(xù)時(shí)間長、殺雄徹底、無環(huán)境污染，在適宜條件下殺雄率達(dá)95%—100%，異交結(jié)實(shí)率超過85%，在中國很多小麥育種單位得到了普遍應(yīng)用[10-12]。在殺雄機(jī)理方面，SQ-1可抑制花藥中的糖酵解、三羧酸循環(huán)及電子傳遞鏈過程，使不育株花藥的有氧代謝過程受阻，能量供應(yīng)不足，導(dǎo)致花粉細(xì)胞大量敗育。因此，在不育花藥中花藥細(xì)胞內(nèi)積累了過量活性氧，為消除過量的活性氧，抗氧脅迫相關(guān)基因大量表達(dá)。另外，化學(xué)殺雄劑 SQ-1誘導(dǎo)小麥敗育花粉細(xì)胞的異常變化與RAFTIN1的表達(dá)相對(duì)應(yīng)[13]。但有關(guān)化學(xué)殺雄劑 SQ-1對(duì)小麥品種間雜交及小麥與玉米雜交結(jié)實(shí)性的影響還缺乏研究。在玉米花粉誘導(dǎo)小麥單倍體方面，雜交后的成胚率較低[14]，限制了該技術(shù)在育種實(shí)踐中的有效應(yīng)用，需要提高小麥與玉米雜交的成胚率。研究表明，阿拉伯半乳聚糖蛋白（arabinogalactan proteins，AGP）作為高等植物細(xì)胞組成的主要糖蛋白[15]，在植物胚胎發(fā)生過程中起重要作用[16-17]。從云杉（Piceaabies）種子中提取的 AGP能夠促進(jìn)其懸浮細(xì)胞體細(xì)胞胚的發(fā)育[18]，從胡蘿卜種子中提取得到的AGP可以促進(jìn)其胚性細(xì)胞的增加。培養(yǎng)基中添加 AGP結(jié)合劑β-Glc Yariv，再生性能較好的菊苣品系其葉片再生性能完全受到抑制，β-Glc Yariv移除后，菊苣葉片又恢復(fù)再生能力，且AGP在胚性細(xì)胞形成過程中的表達(dá)上調(diào)[19]。培養(yǎng)基中添加10 mg·L-1AGP對(duì)油菜[20]、大白菜[21]小孢子胚胎發(fā)生及胚性細(xì)胞分化過程有促進(jìn)作用，降低了胚狀體褐化和死亡現(xiàn)象，顯著提高了成苗率。培養(yǎng)基中添加10 mg·L-1AGP對(duì)小麥小孢子胚狀體發(fā)生同樣具有促進(jìn)作用，降低了小孢子死亡率和白化苗發(fā)生率[22]。培養(yǎng)基中添加50—100 mg·L-1AGP顯著促進(jìn)了不同小麥品種幼胚培養(yǎng)胚狀體的發(fā)生，提高了植株再生率[23]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，有關(guān)SQ-1對(duì)小麥品種間雜交及小麥遠(yuǎn)緣雜交結(jié)實(shí)性的影響還缺乏研究，AGP是否可以提高玉米花粉誘導(dǎo)后的小麥單倍體成胚率還未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究在小麥拔節(jié)期噴施SQ-1，開花期分別授以小麥花粉和玉米花粉，研究 SQ-1對(duì)小麥品種間雜交以及小麥與黑麥、玉米雜交成胚率的影響。同時(shí)，通過在小麥與玉米雜交后的處理液中加入不同濃度 AGP，研究AGP對(duì)小麥單倍體胚誘導(dǎo)率的影響。另外，在離體培養(yǎng)條件下發(fā)現(xiàn)玉米花粉誘導(dǎo)小麥單倍體胚多苗現(xiàn)象，并進(jìn)行組織細(xì)胞學(xué)觀察，對(duì)于在小麥雜交育種和單倍體育種合理利用SQ-1及AGP，提高玉米花粉誘導(dǎo)小麥單倍體成胚率等，具有一定參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 植物材料

冬小麥品種濟(jì)麥22、揚(yáng)麥16和科農(nóng)199，春小麥品系Fielder、CB037和中國春（CS）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所小麥分子遺傳課題組收集、保存，蘭州黑麥由北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院任賢教授提供?？拱追鄄「叽盒←溒废礘W38由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所小麥分子遺傳課題組利用寧春4號(hào)與CB037雜交，然后用寧春4號(hào)回交5次，自交4次，分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)合白粉病抗性鑒定選育而成。2014—2016年，用于試驗(yàn)的冬小麥材料秋播于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所試驗(yàn)農(nóng)場，春小麥材料和蘭州黑麥分別冬播或春播于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所溫室和試驗(yàn)農(nóng)場。玉米雜交品種鄭單58花粉取自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所溫室。

1.2 化學(xué)殺雄和人工去雄及授粉

化學(xué)殺雄方法：小麥拔節(jié)末期（旗葉一半露出倒二葉葉鞘，雄蕊發(fā)育處于藥隔期）用小型壓力噴壺噴施化學(xué)殺雄劑SQ-1（全國小麥雜種優(yōu)勢利用攻關(guān)協(xié)作組提供，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所矮敗小麥課題組保存），濃度為原藥液的12%（添加1% Tween），噴灑時(shí)間為下午17：00，抽穗2 d及時(shí)整穗（去除上、下部小穗和每個(gè)小穗中間小花）、套袋，整穗3 d（穎殼已蓬松、柱頭羽毛狀已張開）授小麥花粉或遠(yuǎn)緣植物（黑麥、玉米）花粉。人工去雄：小麥抽穗1—2 d及時(shí)整穗（花粉尚未成熟，去除上、下部小穗和每個(gè)小穗中間小花）、去除花藥和套袋，去雄3 d授小麥花粉或遠(yuǎn)緣植物（黑麥、玉米）花粉。收集玉米新鮮花粉的方法為上午8：00抖去雄穗上的舊花粉，上午10：00用A4打印紙收集花藥中的新鮮花粉。每個(gè)雜交組合至少設(shè)置3次重復(fù)。品種間雜交每個(gè)重復(fù)2穗以上，遠(yuǎn)緣雜交每個(gè)重復(fù)10穗以上，每穗22—26朵小花?；瘜W(xué)殺雄劑 SQ-1處理后小麥發(fā)育時(shí)期比對(duì)照推遲2—3 d，授粉時(shí)期相應(yīng)比人工去雄推遲2—3 d。

1.3 玉米花粉誘導(dǎo)后的處理和阿拉伯葡聚糖蛋白濃度設(shè)置

化學(xué)殺雄和人工去雄的小麥穗授玉米花粉后，分別于第 2天和第 3天用小型壓力噴壺噴施含 2,4-D（Sigma公司產(chǎn)品，貨號(hào)為D7299）100 mg·L-1的處理液。為了研究阿拉伯葡聚糖蛋白對(duì)玉米花粉誘導(dǎo)后小麥單倍體成胚率的影響，在處理液中添加了0、0.5、1.0和2.0 g·L-1阿拉伯葡聚糖蛋白（Sigma公司產(chǎn)品，貨號(hào)為G9752）。

1.4 小麥遠(yuǎn)緣雜交幼胚離體拯救培養(yǎng)

小麥與黑麥、玉米雜交后18—20 d，從田間或溫室中采集授以玉米花粉的全部小麥雜交穗和授以黑麥花粉的部分小麥雜交穗，剝?nèi)‰s交籽粒（授玉米花粉的小麥穎果空癟、膨大，沒有胚乳；授黑麥花粉的穎果發(fā)育正常，包括胚和胚乳），依次用70%酒精表面消毒1 min，15 %次氯酸鈉滅菌20 min，無菌水沖洗5次，在解剖鏡下取出雜交幼胚，胚軸朝上接種至1/2MS培養(yǎng)基（1/2MS大量元素、1/2MS微量元素、1/2MS鐵鹽、VB1 1.0 mg·L-1、谷氨酰胺150 mg·L-1、蔗糖20 g·L-1和植物凝膠2.4 g·L-1，pH6.0）上，每個(gè)培養(yǎng)管接種3—4個(gè)雜交胚，25℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d，然后在25℃、光照條件下培養(yǎng)20—25 d。

1.5 組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)觀察

小麥與玉米雜交誘導(dǎo)的小麥單倍體胚接種后2 d，在體式顯微鏡下觀察單倍體胚的組織結(jié)構(gòu)。小麥與黑麥雜交產(chǎn)生的二倍體胚和小麥與玉米雜交產(chǎn)生的小麥單倍體胚培養(yǎng)15—20 d時(shí)，從試管中培養(yǎng)的小麥植株上取1—2 cm長度的根尖，冰水處理24 h，浸泡在3∶1的酒精與乙酸溶液中固定24 h，然后放入95%酒精中保存。將經(jīng)固定液處理的根尖用1N HCl在60℃下水解14 min，然后用醋酸洋紅進(jìn)行染色，在相差顯微鏡下觀察染色體數(shù)目。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析

小麥與玉米雜交后20 d統(tǒng)計(jì)授粉小花數(shù)和發(fā)育籽粒數(shù)，接種后統(tǒng)計(jì)接種胚數(shù)，培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)胚數(shù)，培養(yǎng)15—20 d統(tǒng)計(jì)單倍體苗數(shù)，計(jì)算籽粒發(fā)育率（幼嫩籽粒數(shù)/授粉小花數(shù)×100%）、得胚率（接種胚數(shù)/授粉小花數(shù)×100%）、萌發(fā)率（萌發(fā)胚數(shù)/授粉小花數(shù)×100%）和成苗率（單倍體苗數(shù)/授粉小花數(shù)×100%）。小麥品種間及小麥與黑麥雜交后30—35 d直接收獲成熟雜交穗，統(tǒng)計(jì)授粉小花數(shù)和結(jié)實(shí)粒數(shù)，計(jì)算雜交結(jié)實(shí)率（結(jié)實(shí)粒數(shù)/授粉小花數(shù)×100%）。用t測驗(yàn)分析人工去雄和化學(xué)殺雄間主要指標(biāo)的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)殺雄劑 SQ-1對(duì)小麥品種間雜交結(jié)實(shí)率的影響

對(duì)3個(gè)小麥品種Fielder、科農(nóng)199和濟(jì)麥22先后在拔節(jié)末期和抽穗期進(jìn)行化學(xué)殺雄和人工去雄，分別授以CB037或Fielder花粉，統(tǒng)計(jì)授粉小花數(shù)和結(jié)實(shí)粒數(shù)，計(jì)算雜交結(jié)實(shí)率（表1）。結(jié)果顯示，F(xiàn)ielder、科農(nóng)199和濟(jì)麥22人工去雄的結(jié)實(shí)率分別為69.4%、82.8%和 93.0%，化學(xué)殺雄的結(jié)實(shí)率分別為 19.8%、73.3%和83.3%，人工去雄比化學(xué)殺雄的結(jié)實(shí)率高9.5%—49.6%。不同小麥品種內(nèi) 2個(gè)處理間的差異均達(dá)到極顯著水平。結(jié)果表明，相比人工去雄，化學(xué)殺雄劑SQ-1處理顯著降低了小麥品種間雜交結(jié)實(shí)率，對(duì)不同品種的影響不同，對(duì)Fielder的影響最大，對(duì)科農(nóng)199和濟(jì)麥22的影響相似。

2.2 化學(xué)殺雄劑 SQ-1對(duì)小麥與黑麥雜交結(jié)實(shí)率的影響

利用小麥品種CS作為母本，蘭州黑麥作為父本，研究了化學(xué)殺雄和人工去雄對(duì)小麥與黑麥遠(yuǎn)緣雜交結(jié)實(shí)率的影響。結(jié)果顯示，人工去雄方式中CS與蘭州黑麥的結(jié)實(shí)率為78.8%，SQ-1殺雄方式中CS與蘭州黑麥的結(jié)實(shí)率為64.5%（表2）。與人工去雄方式相比，使用化學(xué)殺雄劑SQ-1降低了小麥與黑麥間雜交的結(jié)實(shí)率，差異達(dá)到顯著水平（表 2）。CS與蘭州黑麥 F1雜種根尖細(xì)胞有絲分裂中期染色體觀察發(fā)現(xiàn)，人工去雄方式和化學(xué)殺雄劑SQ-1處理方式產(chǎn)生的F1雜種染色體數(shù)目均為28條（圖1），表明SQ-1處理對(duì)小麥與黑麥遠(yuǎn)緣雜交后的染色體構(gòu)成沒有影響。

表1 人工去雄與化學(xué)殺雄對(duì)小麥品種間雜交效果的影響Table 1 Effect of artificial emasculation and chemical hybridization agent on seed setting between wheat varieties

表2 人工去雄與化學(xué)殺雄對(duì)中國春與蘭州黑麥雜交效果的影響Table 2 Effect of artificial emasculation and chemical hybridization agent on seed setting in a wild cross between a wheat line Chinese Spring and a rye line Lanzhou Heimai

圖1 不同去雄方式獲得中國春與蘭州黑麥F1雜種的染色體構(gòu)成鑒定Fig. 1 Identification of chromosome constitution of the F1hybrid between a wheat line Chinese Spring and a rye line Lanzhou Heimai by different emasculation treatment methods

2.3 化學(xué)殺雄劑 SQ-1對(duì)小麥與玉米雜交成胚率的影響

冬小麥品種科農(nóng)199、春小麥高代小麥品系JW38在拔節(jié)末期進(jìn)行化學(xué)殺雄和人工去雄處理，分別授以玉米雜交品種鄭單58花粉，統(tǒng)計(jì)授粉小花數(shù)、膨大籽粒數(shù)和形成幼胚數(shù)，計(jì)算籽粒膨大率和得胚率（表3）。對(duì)科農(nóng)199而言，人工去雄情況下籽粒膨大率和成胚率分別為66.45%和14.29%，SQ-1化學(xué)殺雄情況下籽粒膨大率和成胚率分別為66.53%和1.41%；對(duì)JW38來說，人工去雄情況下籽粒膨大率和成胚率分別為54.69%和2.38%，化學(xué)殺雄情況下籽粒膨大率和成胚率分別為59.28%和1.11%。對(duì)科農(nóng)199、JW38化學(xué)殺雄和人工去雄處理的穎果率和得胚率進(jìn)行的t測驗(yàn)結(jié)果表明，SQ-1處理對(duì)穎果率沒有影響，但對(duì)成胚率有顯著影響，與人工去雄處理的差異達(dá)到了顯著或極顯著水平（表3）。認(rèn)為化學(xué)殺雄劑SQ-1在阻礙了小麥雄配子發(fā)育的同時(shí)，也一定程度影響了小麥雌配子的發(fā)育，但對(duì)小麥種皮的發(fā)育沒有影響。

表3 人工去雄與化學(xué)殺雄對(duì)小麥與玉米物種間雜交效果的影響Table 3 Effect of artificial emasculation and chemical hybridization agent on haploid wheat embryo induction between wheat and maize

2.4 阿拉伯葡聚糖蛋白對(duì)小麥與玉米雜交成胚率和得苗率的影響

小麥品種揚(yáng)麥16用玉米品種鄭單58授粉后，分別用含阿拉伯葡聚糖蛋白0.5、1.0和2.0 g·L-1的2,4-D（100 mg·L-1）處理液處理，以不含AGP的2,4-D處理液作為對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著2,4-D處理液中AGP濃度的增加，小麥單倍體胚的得胚率從 11.5%逐漸提高到17.0%、萌發(fā)率從8.0%提高到12.0%、成苗率則從9.3%提高到14.5%（圖2），表明2,4-D處理液中加入0.5—2.0 g·L-1AGP一定程度提高了小麥與玉米雜交后小麥單倍體胚的獲得率，相應(yīng)提高了小麥單倍體成苗率（圖2），認(rèn)為AGP一定程度促進(jìn)了小麥與玉米雜交后小麥單倍體胚的生長和發(fā)育。

2.5 玉米花粉誘導(dǎo)小麥單倍體胚的多苗現(xiàn)象

對(duì)小麥品種揚(yáng)麥16與玉米品種鄭單58雜交后產(chǎn)生的部分小麥單倍體胚在離體培養(yǎng)條件下進(jìn)行了組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)一些單倍體胚表面有 2—6個(gè)突起（圖3-A）。培養(yǎng)15—20 d，每個(gè)突起發(fā)育為獨(dú)立的幼苗，即出現(xiàn)了一胚多苗現(xiàn)象（圖 3-B），部分單倍體胚出現(xiàn)了4—6棵苗，在13.07%的單倍體胚上觀察到了一胚多苗現(xiàn)象。這些一胚多苗植株只有 1個(gè)根系（圖3-B），染色體檢查結(jié)果表明，其染色體數(shù)目為21條（圖3-C），為沒有加倍的單倍體植株。

圖2 不同濃度AGP對(duì)小麥與玉米雜交產(chǎn)生小麥單倍體的影響Fig. 2 Impact of different AGPs concentrations on haploid wheat embryos and plants induction in the wild cross between wheat and maize

圖3 玉米花粉誘導(dǎo)小麥單倍體胚的組織學(xué)和染色體觀察Fig. 3 Histological and cytological observation of haploid wheat embryos and plants derived from the wild cross between wheat and maize

3 討論

目前，在小麥雜交育種和單倍體育種中，配制雜交組合主要采用人工去雄、化學(xué)殺雄和雄性不育系利用等方式，這3種配制方式各有優(yōu)劣。人工去雄授粉的配組自由度比較大，靈活性較好，其缺陷是耗費(fèi)較多人工和時(shí)間，而且易受不良天氣條件的影響。化學(xué)殺雄簡便快速，成本較低，可以配制大量雜交組合，但很多化學(xué)殺雄劑的殺雄效果不夠穩(wěn)定，一經(jīng)噴藥就不能收獲自交種子，對(duì)環(huán)境有一定影響。雄性不育系尤其是矮敗小麥的利用[24-25]，不但極大節(jié)約了人力和時(shí)間，可以大規(guī)模配制雜交組合并進(jìn)行輪回選擇[26-27]，而且不受天氣和環(huán)境條件的影響，不育系種子和可育系種子同時(shí)獲得[25]，但配制雜交之前需要把常用小麥親本轉(zhuǎn)育為矮敗小麥，前期準(zhǔn)備工作耗時(shí)較長。近幾年，利用矮敗小麥與玉米雜交，成功獲得了2種類型的小麥單倍體植株，證明了矮敗小麥用于小麥單倍體育種的可行性[28]，另外發(fā)現(xiàn)，不同雜交技術(shù)對(duì)小麥與玉米種間雜交產(chǎn)生單倍體有一定影響，利用改良垂直剪穎剪藥雜交技術(shù)不僅操作方便，而且功效高速度快[29]。育種工作中根據(jù)選用的雜交親本和人員等具體情況，靈活運(yùn)用各種雜交組合配制方式。

迄今為止，化學(xué)殺雄劑SQ-1在小麥[9-11]、糜子[30]、谷子[31]等作物雜交育種中得到了較為廣泛的應(yīng)用，同時(shí)，對(duì)化學(xué)殺雄劑的作用機(jī)制也進(jìn)行了一定研究。SONG等[32]的研究結(jié)果表明，化學(xué)殺雄劑SQ-1處理小麥植株后，小麥旗葉發(fā)生了氧化脅迫，葉片中的氧自由基、H2O2和丙二醛水平顯著增加，相反，超氧化物歧化酶、過氧化物酶和愈創(chuàng)木酚過氧物酶等主要抗氧化酶的活性顯著降低。BA等[33]利用cDNA擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（cDNA-AFLP）和甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（MSAP）對(duì)1 376株化學(xué)殺雄劑誘導(dǎo)的雄性不育株DNA甲基化水平進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)6.66%的DNA序列在基因表達(dá)上發(fā)生了變化，3.42%的DNA序列出現(xiàn)了甲基化現(xiàn)象，噴施 SQ-1后小麥植株中基因表達(dá)水平和DNA甲基化水平顯著變化。ZHU等[34]運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)比較分析了 SQ-1處理的小麥植株和對(duì)照植株花藥部位的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)1 088個(gè)基因在SQ-1處理和未處理的小麥花藥中的表達(dá)水平有明顯差異，其中的643個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，445個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，這些基因主要涉及到光合作用、呼吸作用、嘌呤和嘧啶代謝、氨基酸代謝、谷胱甘肽代謝、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程。WANG等[35]運(yùn)用光學(xué)顯微鏡鏡檢、末端標(biāo)記法和藍(lán)色熒光染色等方法觀察了SQ-1處理后小麥花藥的顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)絨氈層細(xì)胞大量程序性死亡，進(jìn)而導(dǎo)致花藥敗育。李莉等[36]通過利用 2-DE凝膠電泳技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)比較了小麥遺傳性雄性不育系和SQ-1誘導(dǎo)的生理型雄性不育系，發(fā)現(xiàn)6個(gè)差異蛋白可能與雄性不育相關(guān)。

但是，化學(xué)殺雄劑 SQ-1對(duì)小麥品種間雜交，以及小麥與玉米雜交后誘導(dǎo)小麥單倍體等的影響還鮮有報(bào)道。本研究探討了 SQ-1對(duì)小麥品種間雜交結(jié)實(shí)率的影響，以及小麥與玉米雜交后誘導(dǎo)小麥單倍體植株等的影響，結(jié)果表明，SQ-1處理后小麥品種間雜交的結(jié)實(shí)率以及小麥與玉米雜交后小麥單倍體胚和單倍體植株誘導(dǎo)率均有降低，認(rèn)為 SQ-1處理不但致使小麥小孢子敗育，也一定程度影響了小麥大孢子的育性，具體原因有待進(jìn)一步研究。

以往有關(guān) AGP促進(jìn)植物胚胎發(fā)生的作用多側(cè)重于培養(yǎng)基添加[21-23]，AGP直接處理植株的研究則不多。研究發(fā)現(xiàn)，在適宜濃度 2-嗎啉基乙磺酸（3 mmol·L-1）和pH（6.4）條件下，噴施10 mg·L-1的AGP能夠顯著提高甘藍(lán)花藥培養(yǎng)胚胎發(fā)生率[37]。另外，LETARTE等[22]對(duì)2個(gè)春小麥品種噴施阿拉伯半乳聚糖（arabinogalactan，AG）和AGP，發(fā)現(xiàn)小麥花藥培養(yǎng)的胚胎發(fā)生率和植株再生率顯著增加。然而，有關(guān)AGP在小麥與玉米雜交中誘導(dǎo)小麥單倍體植株的影響還未曾研究。本研究發(fā)現(xiàn)，在小麥與玉米雜交后的2,4-D處理液中添加0.5—2.0 mg·L-1AGP一定程度提高了小麥單倍體胚獲得率、萌發(fā)率和成苗率，并且經(jīng)AGP處理產(chǎn)生的單倍體胚出現(xiàn)了頻率較高的一胚多苗的現(xiàn)象。陳新民等[38]用 3個(gè)小麥品種與玉米雜交后，發(fā)現(xiàn)7.8%的胚表現(xiàn)為多苗現(xiàn)象（一個(gè)胚萌發(fā)出2—3個(gè)苗），認(rèn)為這種現(xiàn)象可能是由胚的多極化造成的。本研究中觀察到玉米花粉誘導(dǎo)的部分單倍體胚表面有4—6個(gè)突起結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步發(fā)育出4—6個(gè)苗，認(rèn)為這些突起可能是發(fā)育形成多苗的胚性組織，一胚多苗現(xiàn)象可能在小麥與玉米雜交中廣泛存在，有關(guān)其產(chǎn)生機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

化學(xué)殺雄劑 SQ-1處理情況下，不同小麥品種間雜交結(jié)實(shí)率為19.8%—83.3%，中國春與蘭州黑麥雜交結(jié)實(shí)率為65.5%，不同小麥品種與玉米雜交誘導(dǎo)小麥單倍體胚成胚率為1.11%—1.41%；而在人工去雄情況下，不同小麥品種間雜交結(jié)實(shí)率為 69.4%—93.0%，中國春與蘭州黑麥雜交結(jié)實(shí)率為78.8%，不同小麥品種與玉米雜交誘導(dǎo)小麥單倍體胚成胚率為 2.38%—14.29%；2種處理方式的差異達(dá)到顯著或極顯著水平，表明SQ-1顯著降低了小麥品種間雜交及小麥與黑麥、玉米間雜交的結(jié)實(shí)性。在小麥與玉米雜交后的處理液中添加0.5—2.0 g·L-1AGP一定程度上提高了小麥單倍體胚獲得率和成苗率，13.07%的胚發(fā)育出了2—6株苗，這種一胚多苗現(xiàn)象出現(xiàn)在單倍體胚離體培養(yǎng)之前。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Effect of Chemical Hybridization Agent SQ-1 and Arabinogalactan Proteins on the Embryos Obtaining in Wheat Intervarietal and Wild Crosses

WANG Kun-yang1, ZHANG Wei1, ZHANG Shuang-xi2, LIU Hong-wei1, WANG Ke1, DU Li-pu1, LIN Zhi-shan1, YE Xing-guo1
（1Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility for Gene Resources and Genetic Improvement, Beijing 100081;2Crop Research Institute, Ningxia Academy of Agricultural-Forestry Sciences, Yinchuan 750105）

【Objective】The aims of this study are to clarify the effect of SQ-1 on the embryo formation in the hybridization among wheat varieties and between wheat and its relative or wild species as well as the effect of AGP on haploid embryo production and haploid plant production in the cross of wheat and maize. The findings in this study will be potentially useful to the efficientlyconduction of wheat hybridization breeding and haploid breeding.【Method】In this study, the effectiveness of SQ-1 on the seed-setting after wheat varieties are crossed with other wheat varieties, rye, and maize, and AGP on haploid wheat induction in the cross between wheat and maize were investigated by spraying wheat plants with SQ-1 at booting stage, pollinating the sterile spikes with wheat, rye or maize pollens at flowering period, and treating the wheat spikes pollinated maize pollens with an AGP containing solution, respectively. In addition, in vitro culture was used to rescue the haploid wheat embryos from wheat and maize crossing. Florets pollinated, caryopses formed, grains obtained, embryos cultured, embryos germinated, and plantlets obtained were counted to calculate, caryopses formation rate, setting rate, haploid embryos induction rate, haploid embryos induction rate, and haploid production rate. All the data were analyzed for significant difference evaluation. 【Result】It was found that seed setting rate for the crossing among wheat varieties was 19.8%-83.3% from SQ-1 treatment, and 69.4%-93.0% from artificial emasculation treatment. But, different wheat varieties as female parent showed different responses to SQ-1, and Fielder displayed the most sensitivity to SQ-1. For the wild crossing between a wheat line Chinese Spring (CS) and a rye line Lanzhou Heimai, the seed setting rate was 65.5% from SQ-1 treatment, and 78.8% from artificial emasculation method. All the F1hybrids from the two treatments had 28 chromosomes. For the wild crossing between wheat and maize, wheat haploid embryo induction rate was 1.11%-1.41% from SQ-1 treatment, and 2.38%-14.29% from artificial emasculation method. Compared with the control treatment, application of 0.5-2.0 g·L-1AGP in the treating solution assisted the wheat haploid embryo production rate to be improved to 17.0% from 11.5%. Besides, in the wheat haploid embryos induced by maize pollen, it was found that 13.07% of the embryos developed 2-6 seedlings. Under a microscope, more than one original embryonic axis were observed on the haploid wheat embryos induced by maize pollen when they were rescued by in vitro culture on medium. Cytological examination revealed that the in vitro culture wheat plants had 21 chromosomes. 【Conclusion】The above results indicated that SQ-1 application reduced not only seed setting in the cross among different wheat varieties and between wheat and rye, but also haploid wheat embryo induction rate in the cross between wheat and maize. AGP application improved haploid wheat embryo induction, germination, and plantlets obtaining rates between the hybridization of wheat and maize.

common wheat; chemical hybridization agent (CHA)SQ-1; arabinogalactan proteins (AGP); hybridization among wheat varieties; wide crosses; haploid embryos

2016-06-23；接受日期：2016-08-24

國家自然科學(xué)基金（31371621）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程、寧夏農(nóng)林科學(xué)院先導(dǎo)基金

聯(lián)系方式：王坤楊，Tel：010-82105173；E-mail：857996802@qq.com。通信作者葉興國，Tel：010-82105173；E-mail：yexingguo@caas.cn