李宏偉， 李 迪， 黑曉英， 丁婷婷， 候荔桉綜述， 賈孟輝審校

綜述

腦缺血再灌注損傷后Notch通路的激活與神經(jīng)干細(xì)胞增殖機(jī)制的研究進(jìn)展

李宏偉1， 李 迪2， 黑曉英1， 丁婷婷1， 候荔桉1綜述， 賈孟輝3審校

Notch通路是進(jìn)化過程中高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其激活不需要第二信使和蛋白激酶的參與，可直接收鄰近細(xì)胞的信號(hào)并傳導(dǎo)至細(xì)胞核，激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。Notch通路廣泛存在于脊椎和無脊椎動(dòng)物中，參與了一系列重要的生理、病理過程。其中，腦缺血再灌注損傷后Notch通路的激活對(duì)于腦神經(jīng)功能的保護(hù)作用是近年來研究的熱點(diǎn)。本文重點(diǎn)對(duì)腦缺血再灌注損傷后Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活與神經(jīng)干細(xì)胞增殖之間的關(guān)系加以探討研究，同時(shí)探討巢蛋白(Nestin)作為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，用于神經(jīng)干細(xì)胞的分離、鑒定和培養(yǎng)，并作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷最早、快速應(yīng)答敏感指標(biāo)的分子機(jī)制。

1 腦缺血再灌注損傷與Notch通路的激活

1.1 Notch通路概述 Morgan于1917 年在突變的果蠅體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)了Notch基因，并因這一基因的缺失會(huì)導(dǎo)致果蠅翅膀邊緣鋸齒狀缺刻(notches) 而將這一基因命名為“Notch”[1]。Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在進(jìn)化過程中具有高度保守性，其廣泛存在于脊椎和無脊椎動(dòng)物中，不僅對(duì)細(xì)胞的增殖和分化起主要的調(diào)控作用，同時(shí)還參與了一系列重要的生理、病理過程[2]。Notch信號(hào)家族包括Notch受體、配體及其相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，這些相關(guān)分子和體內(nèi)生化過程均參與了 Notch 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控[3]。迄今為止發(fā)現(xiàn)其受體有Notch1～4共四種亞型，而配體主要有Jagged-1/Jagged-2/Delta-like 1/Delta-like 3和Delta-like 4共五種，當(dāng)跨膜受體與配體結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)過γ-secretase分泌酶的剪切作用從而形成Notch信號(hào)的真正激活形式NICD(Notch intracellular domain，120KD)，同時(shí)NICD與DNA結(jié)合蛋白 CBF-1/RBP-J 結(jié)合作用于靶基因 HES-1/HES-5等，最終發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[4]。

1.2 腦缺血再灌注損傷后Notch通路的激活及其作用 Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是進(jìn)化過程中高度保守的通路，與其他信號(hào)通路不同的是其激活不需要第二信使和蛋白激酶的參與，可直接收鄰近細(xì)胞的信號(hào)并傳導(dǎo)至細(xì)胞核，激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，不具有級(jí)聯(lián)放大的特點(diǎn)[5]。這為Notch通路精確調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化提供了理論依據(jù)。在生理情況下，大腦發(fā)育時(shí)Notch通路決定了神經(jīng)細(xì)胞的命運(yùn)，調(diào)節(jié)了神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[6]。在病理情況下，腦缺血再灌注損傷后Notch通路調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化。Wang L等[7]，研究發(fā)現(xiàn)成年鼠在腦缺血、缺氧后，神經(jīng)干細(xì)胞的增殖過程中，NICD 和 HES1 的表達(dá)水平是增高的，阻斷 Notch 通路后，NICD、HES1 的表達(dá)減少，同時(shí)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖也明顯減少。Androutsellis-Theotokis A等[8]，通過滲透泵將Notch 配體 DLL4注入 大鼠 MACO 模型中延遲性激活 Notch 通路的研究發(fā)現(xiàn)，不僅減少了腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元的死亡，而且促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的新生和缺血后神經(jīng)功缺損能的恢復(fù)。Huang等[9]通過研究發(fā)現(xiàn)大豆異黃酮可以使局灶性腦缺血再灌注大鼠的 Notch 信號(hào)通路激活，進(jìn)而抑制大腦皮質(zhì)細(xì)胞凋亡。孫芬等[10]研究發(fā)現(xiàn)老年人腦缺血后較正常人腦內(nèi)Notch1和Jagged1的表達(dá)在SVZ區(qū)明顯減少，認(rèn)為激活 Notch 通路可明顯減少神經(jīng)元的死亡，同時(shí)能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的再生和缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)。袁云等[11]發(fā)現(xiàn)黃芩苷可以明顯減弱體內(nèi)和被激活小膠質(zhì)細(xì)胞的NF-κB、Notch1、NICD、RBP-JK和Hes-1表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮對(duì)缺血后的腦保護(hù)作用。有研究者[12]用電針活化Notch信號(hào)通路，可促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移和分化，來實(shí)現(xiàn)對(duì)腦缺血所致神經(jīng)功能缺損的防治作用。

腦缺血再灌注損傷后，由于腦組織缺血、缺氧使Notch通路被激活，激活的Notch通路不僅通過促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，使缺血后神經(jīng)功能缺損得以恢復(fù)，而且通過激活Notch通路，促進(jìn)了缺血區(qū)側(cè)支循壞的建立，改善了腦組織的缺血、缺氧狀態(tài)，有效地保護(hù)了神經(jīng)功能的恢復(fù)。研究認(rèn)為[13]，腦缺血再灌注后 Notch 信號(hào)通路參與了生理性血管再生，尤其對(duì)靜脈和毛細(xì)血管的再生發(fā)揮著重要作用。對(duì)正常或病變血管，Notch 信號(hào)通路均可調(diào)節(jié)血管的正常發(fā)育，以及側(cè)支循環(huán)的建成。研究表明[14]，運(yùn)用他汀類藥物治療腦缺血再灌注損傷后，發(fā)現(xiàn)NSCs 以血管為支撐向半暗帶遷移，并能上調(diào)缺血半暗帶和腦動(dòng)脈血管的PS1、Notch1 和 NICD 的表達(dá)，從而直接增加動(dòng)脈管徑和動(dòng)脈的密度，來促進(jìn)腦缺血后的血管再生。體外培養(yǎng)研究也發(fā)現(xiàn)[15]，Notch1可通過誘導(dǎo)特定細(xì)胞的選擇性分化而促進(jìn)血管的再生，提示激活的Notch1具有強(qiáng)大的自我更新細(xì)胞的作用。

2 Nestin作為腦損傷后神經(jīng)干細(xì)胞增殖特異性標(biāo)記物的機(jī)制探究

巢蛋白(Nestin)表達(dá)起始于胚胎早期神經(jīng)前體細(xì)胞，在胚胎腦發(fā)育中呈時(shí)空序列性表達(dá)，目前主要作為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，應(yīng)用于神經(jīng)干細(xì)胞的分離、鑒定和培養(yǎng)；Nestin在中樞神經(jīng)損傷后能重新表達(dá)，可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的最早、快速應(yīng)答的敏感指標(biāo)[16]。

2.1 Nestin概述 Nestin是神經(jīng)干細(xì)胞特異的生物學(xué)標(biāo)記物，是最晚被識(shí)別而且是最大的中間絲，其氨基酸殘基數(shù)為1821，相對(duì)分子量為240，000，在一級(jí)結(jié)構(gòu)中含有307 個(gè)氨基酸組成的保守核心區(qū)，其多肽數(shù)為1 條[17]。在1990年Lendahl等[18]發(fā)現(xiàn)及命名了Nestin，他們通過克隆出編碼Rat1401抗原的基因，該基因的結(jié)構(gòu)具有一般中間絲的特征，由該基因編碼的蛋白顯示，其中間段-α螺旋桿結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與已發(fā)現(xiàn)的其它類中間絲蛋16%～29%的同源性。但其基因的內(nèi)含子位置，蛋白的N 端(頭，較短，只有11 個(gè)氨基酸)、C 端(尾，較長，有479個(gè)氨基酸，且含有許多帶電荷的氨基酸重復(fù)序列)以及在組織細(xì)胞的分布等方面均有別于其它五類中間絲蛋白，故被單獨(dú)定為第Ⅵ 類中間絲蛋白，并將其命名Nestin。

2.2 Nestin的生理性表達(dá) Nestin 主要位于未分化的、具有分裂能力細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，其表達(dá)具有嚴(yán)格的時(shí)空順序；隨著細(xì)胞分化成熟，Nestin 逐漸被膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、神經(jīng)絲蛋白(NF) 等中間絲蛋白代替而停止表達(dá)[19]。在神經(jīng)干細(xì)胞分化早期Nestin 表達(dá)仍成陽性，但隨著其分化為神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞逐漸發(fā)育成熟，Nestin 的表達(dá)逐漸減弱[20]。目前已在胚胎期的放射狀膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)前體細(xì)胞、成年神經(jīng)前體細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、海馬神經(jīng)元以及損傷誘導(dǎo)成的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞等中樞神經(jīng)組織中發(fā)現(xiàn)了Nestin的表達(dá)[21]。

2.3 病理情況下Nestin的重新表達(dá) 近年來研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血、缺氧、創(chuàng)傷以及理化等因素均可誘導(dǎo)Nestin 重新表達(dá)：(1)在腦缺血大鼠大腦皮質(zhì)、室管膜下區(qū)、海馬[22]、缺血中心區(qū)以及周邊區(qū)均有Nestin 的表達(dá)并持續(xù)2 w[ 23]。并且有人證實(shí)，局灶性腦缺血誘導(dǎo)Nestin 陽性反應(yīng)以大腦皮質(zhì)缺血區(qū)及尾殼核較顯著，可持續(xù)到腦缺血后6 w，這些區(qū)域尤其是尾殼核[24]，已經(jīng)證實(shí)對(duì)缺血反應(yīng)敏感；②機(jī)械性大腦皮質(zhì)損傷可誘導(dǎo)傷口周圍的皮質(zhì)，扣帶回和胼胝體出現(xiàn)大量的Nestin 陽性細(xì)胞，而且Nestin 在皮質(zhì)的表達(dá)呈現(xiàn)一個(gè)以切口為中心的梯度反應(yīng)模式，可持續(xù)到術(shù)后30 d[25]；(3)一些神經(jīng)毒性藥物如秋水仙素，可誘導(dǎo)成熟膠質(zhì)細(xì)胞重新表達(dá)Nestin；④低蛋白飲食可誘導(dǎo)Nestin 的表達(dá)[26]。

腦缺血、缺氧、創(chuàng)傷以及理化等因素均可誘導(dǎo)Nestin 表達(dá)上調(diào)。有研究表明[27]，大腦中動(dòng)脈梗死(MCAO)腦組織缺血再灌注6 h 即可見少量Nestin在缺血側(cè)室管膜上皮細(xì)胞中表達(dá)，但著色較淡，室管膜下區(qū)陽性細(xì)胞胞核腫脹，突起較短；缺血再灌注12～24 h，Nestin陽性細(xì)胞著色較6 h組加深，胞核腫脹、蘇木素著色淺淡、多居邊，數(shù)目逐漸增多，突起亦明顯增長，多指向缺血梗死區(qū)，可見少量纖維狀陽性細(xì)胞。側(cè)腦室外側(cè)壁下方及紋狀體等處尤為明顯；再灌注72 h，Nestin 陽性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，可見較多沿胼胝體長軸平行排列；至再灌注7 d時(shí)，Nestin陽性細(xì)胞數(shù)目達(dá)到高峰，呈圍繞梗死區(qū)的多層分布，并可見少數(shù)Nestin 陽性細(xì)胞突起伸長、交織，但胼胝體處的Nestin陽性細(xì)胞已明顯減少；再灌注14 d時(shí)Nestin陽性細(xì)胞已明顯回落，纖維狀細(xì)胞比例較前期有所增加，但仍明顯可見突起較粗、染色較深的肥大型陽性細(xì)胞，胼胝體處已幾乎無Nestin陽性膠質(zhì)細(xì)胞存在。觀察在再灌注各時(shí)間段對(duì)照側(cè)室管膜上皮、室管膜下區(qū)( SEZ)、紋狀體、胼胝體等部位亦有Nestin膠質(zhì)細(xì)胞樣表達(dá)，隨再灌注時(shí)間的延長有增多的趨勢(shì)，但數(shù)目較缺血側(cè)明顯為少。

3 神經(jīng)干細(xì)胞增殖對(duì)腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能缺損的修復(fù)

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元細(xì)胞是終級(jí)分化的神經(jīng)細(xì)胞，一旦調(diào)亡或壞死，將不可能再生，其功能喪失而無法代償。但Altman在1962年用氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷酸提供了成年鼠海馬齒狀回產(chǎn)生新神經(jīng)元的放射自顯影證據(jù)，首次發(fā)現(xiàn)腦室下區(qū)域在出生后可產(chǎn)生新的細(xì)胞[28]。1992年，Reynolds等報(bào)道利用Neurosphere法成功地從成年小鼠腦紋狀體內(nèi)分離出具有自我更新及分裂増殖能力、并可在特定條件下誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小突膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞[29～31]。這些發(fā)現(xiàn)打破了成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)不能再生這一傳統(tǒng)觀念。隨著分子生物學(xué)的逐漸發(fā)展，神經(jīng)干細(xì)胞被成功分離，進(jìn)一步證實(shí)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)元細(xì)胞在一定的條件下可以增殖、分化。在成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞，不僅是打破了傳統(tǒng)的細(xì)胞生理學(xué)觀念，更為腦損傷提供了新的治療思路。

目前，在急性缺血性腦損傷的治療中，恢復(fù)缺血腦組織的血供及促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化是臨床治療的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)?；謴?fù)缺血腦組織的血供最有效的方式是溶栓療法。2010版中國急性缺血性腦卒中診治指南明確規(guī)定溶栓的時(shí)間窗為不超過4.5或6 h[32]。4.5 h或6 h的時(shí)間窗對(duì)于腦卒中患者來說是相當(dāng)短的，有許多患者由于各方面的困難錯(cuò)過了溶栓的機(jī)會(huì)。因溶栓的時(shí)間窗很窄，溶栓治療在臨床中應(yīng)用仍然存在很大的局限性，故促進(jìn)缺血性腦損傷后神經(jīng)干細(xì)胞增殖，從而修復(fù)神經(jīng)功能缺損具有重要的臨床價(jià)值。有大量的研究顯示[33～35]，缺血性腦損傷后神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與Notch信號(hào)轉(zhuǎn)到通路的激活有關(guān)，并證明Notch信號(hào)通路在誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞選擇繼續(xù)增殖或向神經(jīng)元分化上起著關(guān)鍵作用。

4 小結(jié)與展望

腦缺血再灌注損傷后，由于腦組織的缺血、缺氧，在進(jìn)化過程中高度保守的Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活。通過Notch通路中相關(guān)蛋白因子過表達(dá)，不僅促進(jìn)了缺血區(qū)側(cè)支循環(huán)的建立、減少了缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞凋亡，還促進(jìn)了神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化。故Notch通路的激活有效的促進(jìn)了腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。目前，通過神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)、分離和鑒定的標(biāo)記物-Nestin分析檢測(cè)腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移、分化。但Nestin在神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移、分化中的作用機(jī)制目前尚不明確；缺血性腦損傷后Notch通路的激活是否是通過作用于Nestin蛋白結(jié)構(gòu)的相應(yīng)部位促進(jìn)Nestin的表達(dá)仍沒有得到證實(shí)。因此，進(jìn)一步探索作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的最早、快速應(yīng)答敏感指標(biāo)的Nestin的功能及作用機(jī)制是十分必要的。通過對(duì)Nestin蛋白促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化分子生物學(xué)機(jī)制的進(jìn)一步研究，必將為將來有可能人為地控制神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的各項(xiàng)因素，并對(duì)其進(jìn)行定向誘導(dǎo)，從而為神經(jīng)干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化及臨床應(yīng)用提供光明的前景。另外，進(jìn)一步探究Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活與Nestin過表達(dá)的關(guān)系具有重要意義。這一關(guān)系的探討，可以為藥物通過激活Notch信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化提供分子生物學(xué)依據(jù)，進(jìn)而促進(jìn)新型藥物的誕生，提高臨床療效，也將拓寬腦損傷的治療思路。

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1003-2754(2017)11-1033-03

R743

2017-09-05；

2017-10-15

國家自然科學(xué)基金(No. 81560816)

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；2.武威市人民醫(yī)院，甘肅 武威 733000；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，寧夏 銀川 750001)

賈孟輝，E-mail：jjj94330@163.com