黃江鵬， 陳忠華， 宮念樵△， 時(shí) 軍△

1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外一科，南昌 3300062華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所，武漢 430030

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間充質(zhì)干細(xì)胞對移植物的保護(hù)作用*

黃江鵬1， 陳忠華2， 宮念樵2△， 時(shí) 軍1△

1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外一科，南昌 3300062華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所，武漢 430030

間充質(zhì)干細(xì)胞； 移植物； 免疫調(diào)節(jié)； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

器官移植是治療終末期臟器功能衰竭的有效方法，但移植過程中可能出現(xiàn)缺血再灌注損傷、免疫排斥反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等多種損傷，嚴(yán)重影響移植物的功能和存活。例如，胰島移植后3 d內(nèi)可能發(fā)生瞬時(shí)血液介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)(instant blood-mediated inflammatory reaction，IBMIR)，并可導(dǎo)致超過50%胰島細(xì)胞凋亡或者失活[1]。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)又稱為基質(zhì)細(xì)胞或間充質(zhì)祖細(xì)胞，在人類和嚙齒類動(dòng)物中，可以從外周血、胎盤組織、臍帶血、脂肪組織、骨髓腔組織、關(guān)節(jié)液、腱、牙髓、肺、胎兒肝臟等多種組織和器官中獲得。其中，MSCs從骨髓中獲取相對容易，也是許多研究人員分離、培養(yǎng)MSCs時(shí)的首選。在設(shè)定的分化環(huán)境中，MSCs可以成脂、成骨、成軟骨化[2-3]。MSCs能抑制免疫排斥，旁分泌多種營養(yǎng)因子，減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并且向移植區(qū)域遷徙，改善移植區(qū)微環(huán)境，有效提高移植物的存活，改善移植物功能。自Bartholomew等發(fā)現(xiàn)MSCs能顯著延長非人類靈長類動(dòng)物皮膚移植物存活后，在一系列嚙齒類動(dòng)物的胰島、腎臟、肝臟、心臟移植的實(shí)驗(yàn)中，這種保護(hù)作用也得到驗(yàn)證[4-9]。其中涉及到3個(gè)主要的機(jī)制。

1 調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答作用

炎癥和排斥反應(yīng)可嚴(yán)重?fù)p害移植物各種功能。MSCs能有效減弱相關(guān)損害，提高移植物的存活率和改善移植物功能。MSCs與多種免疫細(xì)胞通過細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸或旁分泌細(xì)胞因子及趨化因子的方式，直接或間接調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的增殖和功能狀態(tài)，抑制排斥反應(yīng)。MSCs的保護(hù)機(jī)制尚未在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得到完全闡釋，然而在體外實(shí)驗(yàn)中已有進(jìn)展。MSCs通常被認(rèn)為具有低免疫原性，這和它限制性表達(dá)MHC-Ⅱ、協(xié)同刺激分子并且不刺激T細(xì)胞的增殖有關(guān)。盡管低濃度干擾素可刺激MSCs上調(diào)MHC-Ⅱ的表達(dá)并可能發(fā)揮非專職抗原提呈作用，然而，稍高濃度干擾素即可扭轉(zhuǎn)MSCs這一功能，并發(fā)揮強(qiáng)大免疫抑制作用[10]。

1.1 MSCs與T淋巴細(xì)胞的相互作用

T淋巴細(xì)胞是在移植后參與急性免疫排斥反應(yīng)的主要細(xì)胞群。MSCs在和T淋巴細(xì)胞的相互作用中，一方面可以通過細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸抑制T細(xì)胞的增殖，如抑制分子程序性死亡1(programmed cell death 1，PD-1)及其配體PD-L1。在體外實(shí)驗(yàn)，MSCs經(jīng)干擾素的刺激可上調(diào)表面分子PD-L1的表達(dá)并抑制T細(xì)胞的增殖[11-12]。在體內(nèi)，前期糖尿病NOD鼠的胰腺中MSCs能高表達(dá)PD-L1并且抑制T細(xì)胞增殖從而延緩1型糖尿病的發(fā)展[13]。另外，粘附分子ICAM1和VCAM1，共刺激分子B7-H4均可在MSCs表達(dá)上調(diào)，通過細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸作用，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖[14-15]。這些表明，MSCs可以通過細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸作用抑制T細(xì)胞的增殖而參與免疫調(diào)節(jié)。

另一方面，MSCs還能夠旁分泌多種可溶性分子如轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、IL-10、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)、半乳糖凝集素家族、吲哚胺2，3雙加氧酶(indoleamine 2，3，dioxygenase，IDO)等，抑制T細(xì)胞的激活或者增殖。體外被γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)刺激后，MSCs能分泌TGF-β，抑制T細(xì)胞增殖；靜脈內(nèi)注射MSCs后，血清中的TGF-β和IL-10也可升高，并抑制T細(xì)胞增殖[16-18]。MSCs介導(dǎo)的PGE2的免疫抑制效果雖具有爭議性，然而越來越多研究表明，PGE2在MSCs抑制T細(xì)胞的增殖方面具有重要作用[19-20]。例如，移植肺間充質(zhì)干細(xì)胞(LR-MSCs)經(jīng)過IL-1β刺激可以大幅提高PGE2的分泌，并抑制T細(xì)胞的激活和增殖[21]。MMP-2、MMP-9裂解T細(xì)胞表面分子CD25，使得T細(xì)胞對IL-2的刺激無反應(yīng)，抑制T細(xì)胞的激活[22]；半乳糖凝集素家族通過多種方式引起T細(xì)胞的凋亡，并影響T細(xì)胞的激活、功能、細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫作用[23-26]。由此可見，MSCs可以通過旁分泌的方式分泌多種可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞增殖和分化的分子，調(diào)節(jié)免疫耐受。

1.2 MSCs和樹突狀細(xì)胞的相互作用

MSCs可以抑制樹突狀細(xì)胞(DCs)成熟，減弱其抗原提呈功能，誘生調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。其機(jī)制包括：①抑制單核細(xì)胞分化為未成熟DCs[27-28]；②通過IL-6的分泌抑制炎性DCs的產(chǎn)生[29]；③MSCs分泌IL-6，下調(diào)DCs表面共刺激分子CD80、CD86及MHC-Ⅱ類分子表達(dá)，進(jìn)而抑制DCs成熟、阻斷DCs抗原提呈功能[30]。最近發(fā)現(xiàn)，MSCs分泌IL-6并上調(diào)細(xì)胞因子信號抑制物1(suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1)的表達(dá)，阻斷DCs中的TLR4信號通路，從而抑制DCs成熟分化[31]?？梢?，IL-6在MSCs調(diào)節(jié)DCs的作用中至關(guān)重要。此外，MSCs調(diào)節(jié)DCs的作用也可能和IL-10密切相關(guān)。MSCs能夠激活JAK/STAT通路，從而活化SOCS3，增加產(chǎn)生依賴IL-10的調(diào)節(jié)性DCs，繼而發(fā)揮抗炎效應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)作用[32-33]。另有研究表明，在和MSCs共培養(yǎng)的DCs體系中，IL-10的分泌上調(diào)，TNF-α、INF-γ、IL-12等炎性因子的分泌則會下調(diào)[28，34-35]。而這些炎性因子的改變可能在炎癥介導(dǎo)的移植物免疫微環(huán)境中起重要調(diào)節(jié)作用。

DCs遷移至淋巴結(jié)區(qū)域，將抗原呈遞給T細(xì)胞，這一過程與趨化因子受體CCR7密切關(guān)聯(lián)。MSCs通過下調(diào)DCs的CCR7的表達(dá)，減弱DCs的遷移作用[36]。因此，MSCs可能通過減弱DCs的遷移作用減弱免疫排斥，保護(hù)移植物的功能和存活。

1.3 MSCs和巨噬細(xì)胞的相互作用

在移植腎中可以活檢出活化的M2型巨噬細(xì)胞，但激活方式與經(jīng)典的M1型巨噬細(xì)胞不同。在移植腎微環(huán)境中，M2型巨噬細(xì)胞可通過Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如IL-13、IL-14激活[37]，而不是通過經(jīng)典的Th1細(xì)胞分泌的干擾素等細(xì)胞因子激活。MSCs被IFN-γ和TNF-α刺激后，可上調(diào)IDO的分泌，激活M2型巨噬細(xì)胞，從而抑制T細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[38-39]。

1.4 MSCs和自然殺傷細(xì)胞的相互作用

MSCs還可以調(diào)節(jié)自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的功能。NK細(xì)胞可選擇性殺傷未成熟DCs，忽視成熟DCs并增強(qiáng)免疫殺傷力；另外還可以分泌多種毒性細(xì)胞因子和趨化因子。MSCs抑制NK細(xì)胞功能的機(jī)制復(fù)雜，可能通過分泌PGE2和TGF-β來發(fā)揮作用[40]。另外MSCs還可下調(diào)NK細(xì)胞表面激動(dòng)性受體如NKp44、NKG2D和NKp30的表達(dá)，抑制NK細(xì)胞的增殖、細(xì)胞毒性及因子的分泌[41]。

1.5 MSCs和B淋巴細(xì)胞的相互作用

MSCs可以抑制B細(xì)胞表面相關(guān)趨化因子的受體CXCR4、CXCR5、CXCR7及其配體CXCL12、CXCL13的表達(dá)，進(jìn)而影響B(tài)細(xì)胞的趨化能力。MSCs還可使B細(xì)胞停滯于G0/G1期，抑制B細(xì)胞的增殖[42]。

1.6 MSCs和調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞群的相互作用

調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞群在誘導(dǎo)免疫耐受和減弱免疫排斥方面具有重要作用。MSCs能夠誘導(dǎo)和擴(kuò)增調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞群。MSCs治療實(shí)體器官移植(mesenchymal stem cells in solid organ transplantation，MISOT)的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs調(diào)節(jié)移植后排斥反應(yīng)的主要機(jī)制包括擴(kuò)增調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[43-44]和抑制效應(yīng)T細(xì)胞及記憶性T細(xì)胞的增殖[45]。MSCs高效誘生Treg細(xì)胞可能和部分細(xì)胞因子密切相關(guān)[46]。然而，通過細(xì)胞接觸方式上調(diào)IL-10、TGF-β和PGE2的分泌，是人MSCs誘導(dǎo)產(chǎn)生CD4+CD25hiFOXP3+Treg細(xì)胞的關(guān)鍵[47]。在體內(nèi)，F(xiàn)OXP3+Treg細(xì)胞的產(chǎn)生與IDO表達(dá)有關(guān)，這個(gè)因子由IFN-γ刺激MSCs產(chǎn)生[48]。此外，MSCs還可促進(jìn)生成其它調(diào)節(jié)性細(xì)胞如調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞(Mreg)、調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Breg)、Tr1 IL-10+和Th3 TGF-β+等，參與移植免疫調(diào)節(jié)[49-55]。

2 修復(fù)受損組織

MSCs具有多向分化、修復(fù)及再生受損組織的潛能。它可遷移至受損區(qū)域，分泌多種細(xì)胞因子，甚至可分化為具有功能的細(xì)胞，保護(hù)或者替代受損的細(xì)胞，以維持甚至改善組織的功能。研究表明，MSCs經(jīng)靜脈輸注治療，雖然大量滯留于肺毛細(xì)血管床，但在各種疾病模型如心肌梗死、腦外傷、肝纖維化、肺化學(xué)損傷、各類腫瘤和移植中，仍有部分細(xì)胞趨向于受損組織區(qū)域并發(fā)揮修復(fù)作用[56-57]。然而，MSCs主要通過分化替代還是旁分泌效應(yīng)發(fā)揮修復(fù)作用一直存在爭議。

一方面，MSCs可以分化成有功能的細(xì)胞或者實(shí)質(zhì)細(xì)胞替代受損細(xì)胞。將雄性小鼠MSCs經(jīng)外周血注入雌性小鼠體內(nèi)，能夠得到具有胰島素分泌功能的胰腺β細(xì)胞[58]。鏈脲菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠接受BMC移植后，在其體內(nèi)檢測到供者來源的胰島素陽性細(xì)胞[59]。將MSCs經(jīng)肝細(xì)胞生長培養(yǎng)液處理后可出現(xiàn)肝細(xì)胞的形態(tài)和功能，再將預(yù)處理的MSCs給予肝移植術(shù)后免疫抑制或者缺陷的受體，這種肝細(xì)胞樣細(xì)胞仍有肝細(xì)胞的相關(guān)功能，如糖原儲存、尿素合成、表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PCK1)、合成白蛋白等[60]。在肝移植中，MSCs可分化為有功能的肝細(xì)胞樣細(xì)胞，這在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外均可證明[61-62]。因此，MSCs可能通過直接分化來替代受損細(xì)胞并改善受體移植物的功能。

另一方面，有學(xué)者認(rèn)為MSCs的旁分泌效應(yīng)或許才是修復(fù)的主要原因。MSCs可分泌許多種可溶性營養(yǎng)細(xì)胞因子和生長因子、含mRNA和miRNA的微泡和招募受損區(qū)域的祖細(xì)胞而發(fā)揮修復(fù)作用[63-66]。MSCs在很多疾病模型中幾乎僅在急性期才有明顯療效，直接分化的證據(jù)也十分有限，這表明MSCs的治療效果在很大程度上可能依賴于本身改善受損組織微環(huán)境的能力[10]。在減體積大鼠肝移植實(shí)驗(yàn)中，MSCs保護(hù)肝臟功能可能是通過分泌VGEF等許多營養(yǎng)因子實(shí)現(xiàn)，而非直接分化[67]。胰島移植中，MSCs共移植后的移植物功能改善與周圍血管再生率升高有關(guān)，而與MSCs可能分化為極少量的胰島β細(xì)胞無關(guān)[68]。

MSCs的旁分泌效應(yīng)可保護(hù)移植物，除了上述免疫調(diào)節(jié)作用外，還主要表現(xiàn)在促血管生成、抗凋亡、抗炎、內(nèi)生修復(fù)、抗纖維化等方面[69]。①M(fèi)SCs促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，改善組織血運(yùn)，提高組織修復(fù)能力。MSCs能分泌VEGF，是最重要的營養(yǎng)性因子之一，能促進(jìn)血管再生、內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和存活以及血運(yùn)重建，提高胰島移植物的生存[70-73]。除了VEGF，MSCs還可分泌TGF-β、MMP-2、MMP-14作用于內(nèi)皮細(xì)胞，增加周圍組織血管密度，改善血供[74-75]。②MSCs分泌營養(yǎng)因子，調(diào)節(jié)炎癥分子，增加抗凋亡蛋白，促進(jìn)細(xì)胞增殖保護(hù)移植物。在小體積肝移植中，MSCs上調(diào)HGF、IL-10、Bcl-2，并增加c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal Kinase，JNK/c-Jun)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1，CyD1)和NF-κB的表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖[76]。③MSCs在各種器官移植中具有抗纖維化的作用，如心、肺、肝、腎移植[77-80]，而這可能與多種旁分泌細(xì)胞因子有關(guān)，如：BMP-7，肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)和TGF-β[81-83]。MSCs通過旁分泌效應(yīng)改變微環(huán)境，修復(fù)損傷的作用已被廣泛接受。

3 調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可以嚴(yán)重影響各種移植物的存活和功能。胰島移植物早期大量凋亡、功能失活僅僅用免疫排斥的原因來解釋是不夠的[84-85]。移植物遭受受體高血糖毒性和移植后的“非正常環(huán)境”也是非常重要的因素[86]。在移植后早期，移植物處于缺血、缺氧、缺血再灌等“非正常環(huán)境”中，這會引起嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[85]。而持久或嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是引起早期移植物凋亡、功能失活的重要原因[87]。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能影響移植肝術(shù)后移植物的質(zhì)量，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激阻滯劑腹腔注射后，大鼠肝移植術(shù)成功率明顯提高，術(shù)后肝損害有所減輕[88-89]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在胰島移植、心臟移植、腎臟移植和其他實(shí)體器官移植中同樣影響著術(shù)后移植物的存活率和存活時(shí)間[90-93]。而MSCs可減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，改善移植物的存活和功能[94-95]。

MSCs減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的機(jī)制尚未完全闡明。在嚴(yán)重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中，PI3K/Akt可調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK-eIF2α/CHOP通路[96]，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡；而MSCs可調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路[97-98]。因此PI3K/Akt可能是MSCs調(diào)節(jié)ERS保護(hù)移植物的橋梁。

MSCs減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的效應(yīng)可能與MSCs直接接觸作用有關(guān)[94]。經(jīng)毒胡蘿卜素(thapsigargin)處理的腎小管細(xì)胞處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子CHOP和Caspase-3明顯高表達(dá)；而與MSCs共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組腎小管細(xì)胞的CHOP和Caspase-3表達(dá)相對低，腎小管細(xì)胞的凋亡也顯著減少；使用插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿(transwell)隔絕MSCs和腎小管細(xì)胞的接觸，盡管培養(yǎng)液共用，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)指標(biāo)無明顯減少。也有研究表明MSCs減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用可能和MSCs的旁分泌有關(guān)[95]。對經(jīng)高濃度衣霉素(Tunicamycin)誘導(dǎo)后處于強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系(RGC-5)，再使用臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)條件培養(yǎng)液可對其有一定的保護(hù)作用。相比使用普通培養(yǎng)液的RGC-5，細(xì)胞內(nèi)CHOP和PERK的表達(dá)明顯下降，而生長速度、細(xì)胞的粘附能力以及存活情況等都有提高。

4 問題與展望

本文將目前關(guān)于MSCs對移植物的保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行了綜述，并歸納于圖1。雖然針對此機(jī)制已有許多研究，但仍有許多亟需解決的問題。目前關(guān)于免疫調(diào)節(jié)的研究集中在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)上，體內(nèi)的調(diào)節(jié)效果仍不穩(wěn)定。MSCs在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中的主要問題包括：①M(fèi)SCs的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)和機(jī)制在各種動(dòng)物模型中并不一致。②MSCs與微環(huán)境的關(guān)系不詳。MSCs可調(diào)節(jié)微環(huán)境，微環(huán)境也可以影響MSCs的功能發(fā)揮，因此需要進(jìn)一步確定和掌控MSCs在適當(dāng)范圍內(nèi)調(diào)節(jié)宿主排斥反應(yīng)[44]。③MSCs輸液輸注可能引起的急性移植物相關(guān)功能障礙(植入綜合征)。④臨床器官移植術(shù)后，如何確定MSCs的輸注時(shí)機(jī)、劑量以及途徑[99]。⑤MSCs與免疫抑制劑如何聯(lián)用，以減少免疫抑制劑的副作用。MSCs在器官移植中的應(yīng)用，今后仍是重要的研究方向。

a：輸注在血管內(nèi)的MSCs遷徙至移植區(qū)域；b：MSCs通過細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸或者旁分泌抑制各種免疫細(xì)胞的增殖和激活等；c：MSCs擴(kuò)增或激活調(diào)節(jié)性細(xì)胞群的活動(dòng)；d：MSCs通過旁分泌各種細(xì)胞因子、營養(yǎng)因子修復(fù)受損組織，促進(jìn)血管生成，促進(jìn)區(qū)域組織祖細(xì)胞分化替代受損組織，直接分化替代受損組織；e：抑制嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。(注：各細(xì)胞、組織大小比例不代表真實(shí)情況)圖1 間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在移植區(qū)域發(fā)揮保護(hù)作用Fig.1 Mesenchymal stem cells(MSCs)play a protective role in the transplant area

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(2015-12-03 收稿)

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81570678)；國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會公益性行業(yè)科研專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(No.201302009)

R392.4

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.022

黃江鵬，男，1989年生，醫(yī)學(xué)碩士，E-mail：529664106@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：shijundoc@yahoo.com(時(shí)軍)，nqgong@tjh.tjmu.edu.cn(宮念樵)