陳路遙， 馬 鑫， 雷振偉， 黃慶波， 張 勇， 林 峰， 郝 鵬， 楊明剛， 趙雪濤， 陳 軍， 劉功學， 鄭 濤△

1中國人民解放軍總醫(yī)院泌尿外科，北京 1008532武漢市普愛醫(yī)院泌尿外科，武漢 430033

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FGFR4基因rs351855單核苷酸多態(tài)性與中國漢族人群前列腺癌術(shù)后生化復發(fā)的關(guān)聯(lián)性*

陳路遙1， 馬 鑫1， 雷振偉1， 黃慶波1， 張 勇2， 林 峰2， 郝 鵬2，
楊明剛2， 趙雪濤2， 陳 軍2， 劉功學2， 鄭 濤2△

1中國人民解放軍總醫(yī)院泌尿外科，北京 100853
2武漢市普愛醫(yī)院泌尿外科，武漢 430033

目的 探討FGFR4基因rs351855單核苷酸多態(tài)性與中國漢族人群前列腺癌術(shù)后生化復發(fā)的相關(guān)性。方法提取346例前列腺癌患者外周血DNA，采用Sequenom MassARRAY法檢測rs351855位點基因型；收集患者臨床信息并隨訪，分析比較生化復發(fā)組與未生化復發(fā)組之間數(shù)據(jù)；采用Kaplan-Meier生存曲線和COX回歸分析基因型對術(shù)后無生化復發(fā)生存的影響。結(jié)果 346例患者中有124例(35.8%)發(fā)生術(shù)后生化復發(fā)。兩組間術(shù)前前列腺特異抗原(PSA)水平、Gleason評分、TNM分期、切緣情況及rs351855基因型分布具有顯著差異。生存分析顯示不同基因型之間無生化復發(fā)生存差異具有統(tǒng)計學意義，攜帶AA/AG基因型個體較GG基因型具有更差的預后；多因素分析顯示rs351855基因型是獨立的預測術(shù)后無生化復發(fā)生存的因子(HR=1.873，95%CI：1.209～2.901，P=0.005)。結(jié)論 FGFR4基因rs351855多態(tài)性位點與中國漢族人群前列腺癌術(shù)后生化復發(fā)有聯(lián)系，可以作為預測術(shù)后生化復發(fā)的分子標記物，指導臨床評估和隨訪。

前列腺癌基因； FGFR4基因； 基因多態(tài)性； 生化復發(fā)

前列腺癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，隨著人口老齡化和早期篩查的普及，其發(fā)病率逐年增加，資料顯示僅在美國每年就有約23萬例新診斷的前列腺癌患者以及3萬例的疾病相關(guān)致死數(shù)[1]。目前對于被診斷為臨床局限的腫瘤，根治性前列腺切除術(shù)仍是首選治療方法，然而術(shù)后約有30%的患者會出現(xiàn)生化復發(fā)，預后不佳[2]。傳統(tǒng)的臨床病理預后因子包括術(shù)前前列腺特異性抗原(PSA)水平、Gleason評分、病理分級等，它們被用于評估術(shù)后復發(fā)的風險。近年來大量研究致力于尋找新的分子標志物以評估術(shù)后疾病復發(fā)的危險性，從而指導臨床隨訪和治療。全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，部分遺傳突變位點與前列腺癌發(fā)病風險及預后相關(guān)聯(lián)，然而大多數(shù)研究對象是歐美人群[3-5]，針對亞洲尤其是中國漢族人群的研究尚少，需要進一步深入研究驗證。

FGFR4是成纖維細胞生長因子受體家族成員之一，參與到細胞分化、發(fā)育、激素信號通路和增殖通路等生理過程[6]；此外，其介導的信號通路在腫瘤生長和進展中也發(fā)揮重要的作用[7]。近年來FGFR4基因的多態(tài)性位點被發(fā)現(xiàn)與許多腫瘤包括肺癌、胃腸道腫瘤和卵巢癌等發(fā)病風險和預后相關(guān)[8-10]。最近的1篇系統(tǒng)評價顯示其rs351855位點(Gly388Arg)與前列腺癌發(fā)病風險相關(guān)，與Gly388相比，Arg388增加了17%的風險[11]。此外FitzGerald等[12]回顧性分析1 458例美國前列腺癌患者，發(fā)現(xiàn)該位點與腫瘤特異性致死率相關(guān)；日本學者研究也顯示rs351855影響了前列腺癌的進展[13]。目前尚未見該位點與中國漢族人群前列腺癌的相關(guān)報道，rs351855是否與中國漢族人群前列腺癌預后相關(guān)尚需要進一步驗證。本研究回顧性分析346例前列腺癌患者資料，并檢測其FGFR4基因rs351855多態(tài)性位點，探討其與中國漢族人群前列腺癌術(shù)后預后的相關(guān)性及其是否能夠作為潛在的分子標志物。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本組346例患者外周靜脈血來自解放軍總醫(yī)院泌尿外科2010年1月至2013年12月住院的前列腺癌患者，均為漢族男性，術(shù)前診斷為臨床局限性腫瘤，行腹腔鏡或機器人前列腺根治性切除術(shù)，術(shù)后病理組織學證實為前列腺腺癌。腫瘤分期采用2010年TNM分期標準，并根據(jù)WHO標準進行組織學Gleason評分?；颊咄庵苎獦吮静杉蟊４嬖?80℃冰箱中。本研究通過了解放軍總醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 基因多態(tài)性分型

采用Qiagen Blood Mini血液基因組提取試劑盒，按試劑說明書抽提外周血的基因DNA，并經(jīng)NanoDrop 1000分光光度計測定其純度和濃度，質(zhì)控吸光度A260/A280比值在1.8～2.0后保存于-20℃冰箱中。

FGFR4 rs351855多態(tài)性位點分型采用Sequenom MassARRAY進行檢測。經(jīng)過多重PCR擴增，將產(chǎn)物經(jīng)堿性磷酸化處理，然后進行單堿基延伸反應，樹脂純化后進行芯片點樣和質(zhì)譜檢測。針對rs351855位點設計的引物由北京金唯智生物公司合成，所用的引物序列分別如下：1st Primer：5′-AAGCGGGAGAGCTTCTGCAC-3′；2nd primer：5′-CTTGGCTGTGCTCCTGCTG-3′；Extend primer：5′-TCCCGCCCTCGATACAGCC-3′。同時隨機挑選5%的樣品進行DNA測序驗證可靠性。

1.3 收集資料與隨訪

收集患者的術(shù)前臨床數(shù)據(jù)(年齡、BMI、術(shù)前PSA水平、術(shù)前影像學檢查資料等)和術(shù)后病理相關(guān)數(shù)據(jù)(Gleason評分、病理分期、手術(shù)切緣情況等)。術(shù)后常規(guī)進行門診或電話隨訪患者情況?；颊咝g(shù)后常規(guī)每3個月進行血PSA檢測。根據(jù)CUA2014指南，生化復發(fā)定義為根治術(shù)后間隔3個月的連續(xù)2次血PSA水平監(jiān)測大于0.2 ng/mL；對于未出現(xiàn)復發(fā)患者，以最后一次隨訪時間作為截點進行統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計方法

連續(xù)變量結(jié)果以均數(shù)±標準差表示。根據(jù)連續(xù)或分類資料分別采用t檢驗或卡方檢驗分析兩組間差異?；蛐蛯ι瘡桶l(fā)時間的影響采用Kaplan-Meier生存曲線進行檢測；同時將臨床病理數(shù)據(jù)與rs351855基因多態(tài)性納入單因素COX回歸風險分析模型，進而將P<0.1的項目納入多因素模型檢測其獨立性，以HR和95%CI表示其風險。所有統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件，以雙側(cè)P<0.05為差異具有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

本組346例前列腺癌患者平均年齡(65.9±7.0)歲，均得到完全隨訪，中位隨訪時間為37.8個月。截止到最后一次隨訪時，共有124名患者出現(xiàn)前列腺癌復發(fā)，占總病例的35.8%。根據(jù)是否生化復發(fā)將346例患者分為兩組：生化復發(fā)組和未生化復發(fā)組。表1為兩組臨床病理資料對比，可見兩組在年齡與BMI方面無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)；復發(fā)組較未復發(fā)組術(shù)前PSA水平更高(P<0.001)，Gleason評分≥8比例更高(38.7%vs.22.5%，P=0.001)；此外復發(fā)組的病理分期和切緣陽性率顯著高于未復發(fā)組(P=0.004和0.045)。

2.2 基因型分布

346例前列腺癌患者rs351855多態(tài)性位點均被成功分型，隨機送檢5%的樣品測序顯示準確性為100%，基因型分布為112例GG、186例AG和48例AA。在生化復發(fā)組中基因型分布為30例GG、68例AG和26例AA，而在未復發(fā)組中分布為82例GG、118例AG和22例AA；兩組間基因型分布差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.004，表1)。

表1 前列腺癌術(shù)后生化復發(fā)組與無生化復發(fā)組臨床病理參數(shù)比較
Table 1 Clinicopathological characteristics of prostate cancer patients in biochemical recurrence group and biochemical recurrence-free group after radical prostatectomy

變量總體生化復發(fā)組無生化復發(fā)組P值病例數(shù)346124222年齡(歲,x±s)65.9±7.065.3±7.266.2±6.90.253BMI[例(%)]0.277 <24kg/m2136(39.3)43(34.7)93(41.9) ≥24kg/m2210(60.7)81(65.3)129(58.1)術(shù)前PSA[例(%)]<0.001 ≤20ng/mL211(61.0)56(45.2)155(69.8) >20ng/mL135(39.0)68(54.8)67(30.2)Gleason評分[例(%)]0.001 ≤7分248(71.7)76(61.3)172(77.5) ≥8分98(28.3)48(38.7)50(22.5)TNM分期[例(%)]0.004 T1/2N0M0250(72.3)78(62.9)172(77.5) T3/4N1M096(27.7)46(37.1)50(22.5)切緣情況[例(%)]0.045 陽性132(38.2)56(45.2)76(34.2) 陰性214(61.8)68(54.8)146(65.8)rs351855基因型[例(%)]0.004 GG112(32.4)30(24.2)82(36.9) AG186(53.7)68(54.8)118(53.2) AA48(13.9)26(21.0)22(9.9)

BMI：體質(zhì)指數(shù)；PSA：前列腺特異性抗原；TNM分期T1/2N0M0：局限性，T3/4N1M0：局部進展

2.3 生存分析

將rs351855位點的基因型與術(shù)后生化復發(fā)時間相關(guān)聯(lián)，采用Kaplan-Meier生存曲線分析，發(fā)現(xiàn)3種基因型在前列腺癌無復發(fā)生存上有顯著差異(P=0.001，圖1A)，GG基因型攜帶者有相對較好的無復發(fā)生存，而AA基因型攜帶者有相對較差的無復發(fā)生存。進一步根據(jù)遺傳模型分為隱性模型(AA/AGvs.GG)和顯性模型(GG/AGvs.AA)進行分析，結(jié)果顯示在兩種模型下無復發(fā)生存同樣具有顯著性差異(P=0.002和0.004，圖1B和1C)。

A：3種基因型；B：隱性模型；C：顯性模型圖1 FGFR4基因rs351855不同基因型無生化復發(fā)生存曲線比較Fig.1 Kaplan-Meier survival analysis for BCR-free survival after radical prostatectomy according to FGFR4 rs351855 genotypes

將臨床病理資料轉(zhuǎn)為分類變量后，納入COX風險模型分析(表2)，單因素分析顯示年齡與BMI對前列腺癌術(shù)后無生化復發(fā)生存無明顯影響，術(shù)前PSA(P<0.001)、Gleason評分(P=0.001)和TNM分期(P=0.005)對無生化復發(fā)生存有顯著性影響，切緣陽性情況僅有臨界性統(tǒng)計學意義(P=0.067)。對于rs351855位點，AA/AG與GG對比有明顯較差的生存情況(HR=1.883，95%CI：1.244～2.850，P=0.003)。進一步進行多因素分析，將單因素分析P<0.1變量納入模型，結(jié)果顯示術(shù)前PSA、Gleason評分、TNM分期和rs351855基因型與無生化復發(fā)生存仍具有統(tǒng)計學相關(guān)性，其中AA/AG與GG相比具有明顯較差的預后(HR=1.873，95%CI：1.209～2.901，P=0.005)，顯示rs351855基因型與其他3項變量均是獨立的預測前列腺癌術(shù)后無生化復發(fā)生存的影響因子。

表2 FGFR4 rs351855基因多態(tài)性與前列腺癌術(shù)后無生化復發(fā)生存的危險相關(guān)性分析
Table 2 Cox proportional hazards analysis of rs351855 gene polymorphism in FGFR4 associated with PSA recurrence after radical prostatectomy

變量單因素COX分析HR(95%CI)P值多因素COX分析HR(95%CI)P值年齡 ≤65歲1.00 >65歲0.974(0.921～1.124)0.863BMI <24kg/m21.00 ≥24kg/m21.160(0.803～1.676)0.430術(shù)前PSA ≤20ng/mL1.001.00 >20ng/mL2.340(1.642～3.335)<0.0011.938(1.331～2.822)0.001Gleason評分 ≤7分1.001.00 ≥8分1.858(1.291～2.673)0.0011.609(1.107～2.339)0.013TNM分期 T1/2N0M01.001.00 T3/4N1M01.680(1.166～2.420)0.0051.757(1.182～2.612)0.005切緣情況 陰性1.001.00 陽性1.394(0.977～1.989)0.0671.181(0.786～1.773)0.423rs351855 GG1.001.00 AA/AG1.883(1.244～2.850)0.0031.873(1.209～2.901)0.005

3 討論

基因多態(tài)性與疾病相關(guān)性的研究近些年成為熱點，腫瘤等多基因疾病臨床表型多樣化，闡明基因型與表型直接的聯(lián)系對于發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)病機制和預測其預后有著重要作用[14-15]。前列腺癌的發(fā)病機制目前尚不清楚，近年來有許多研究關(guān)注基因多態(tài)性與前列腺癌發(fā)病風險和預后的相關(guān)性，其中FGFR4基因rs351855位點是熱點之一。盡管在歐美人群中已經(jīng)被證明與發(fā)病風險和疾病特異性死亡率有關(guān)聯(lián)，在亞洲人群尤其是中國漢族人群尚未見報道。前列腺癌的發(fā)病具有顯著的種族差異，有著明顯的遺傳異質(zhì)性，因此該位點單核苷酸多態(tài)性與中國漢族人群前列腺癌是否有相關(guān)性是本文的研究目標。

本研究收集解放軍總醫(yī)院泌尿外科346例前列腺癌患者信息，分析其FGFR4基因rs351855基因型與術(shù)后無生化復發(fā)生存的相關(guān)性，結(jié)果顯示該位點不同基因型與生化復發(fā)相關(guān)，其中AA/AG攜帶者與GG攜帶者相比，無生化復發(fā)生存情況較差，同時多因素COX回歸也顯示rs351855是獨立的預后危險因子。

關(guān)于FGFR4基因多態(tài)性與前列腺癌的潛在分子機制已經(jīng)有學者提出了幾種可能性。Wang等[16]建立2株分別表達FGFR4 Arg388和Gly388的前列腺上皮細胞系，通過功能實驗檢測發(fā)現(xiàn)表達Arg388的細胞系其細胞遷移和侵襲能力較Gly388明顯增強，進一步機制研究顯示Arg388能夠上調(diào)尿激酶型纖溶酶原激活物受體表達，后者是尿激酶纖溶酶激活系統(tǒng)關(guān)鍵因子，且已經(jīng)被證明參與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。另一項研究通過對2種細胞系進行基因表達芯片的檢測，發(fā)現(xiàn)Arg388可以激活ERK信號通路從而與前列腺癌惡性潛能相關(guān)聯(lián)[17]。最近Ulaganathan等[18]發(fā)現(xiàn)由Gly388突變?yōu)锳rg388會改變跨膜段從而暴露出近膜質(zhì)的STAT3，繼而募集STAT3蛋白至內(nèi)層細胞膜，加強STAT3的酪氨酸磷酸化。以上這些基礎研究能夠解釋我們的發(fā)現(xiàn)，即攜帶A等位基因的患者有更差的預后。

本次研究首次評估FGFR4基因單核苷酸多態(tài)性對中國漢族人群前列腺癌患者術(shù)后無生化復發(fā)生存的影響，并發(fā)現(xiàn)rs351855位點可以應用于臨床檢測其復發(fā)危險性。但是仍有一些不足之處，首先我們的研究是回顧性分析，與歐美類似研究相比樣本量偏小，可能出現(xiàn)一定的偏移；其次我們選取的研究終點是生化復發(fā)時間，而非疾病特異性死亡時間，這與我們隨訪時間相對較短有關(guān)；最后FGFR4基因的其他多態(tài)性位點有可能也會影響結(jié)果，但未在本研究中檢測，因此還需要更大樣本更多位點檢測來驗證我們的初步發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，本次研究初步發(fā)現(xiàn)FGFR4基因rs351855多態(tài)性位點不同基因型對中國漢族人群前列腺癌術(shù)后生化復發(fā)有影響；rs351855位點可以作為獨立的無生化復發(fā)生存預后因子指導臨床評估和隨訪。

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(2016-09-26 收稿)

Association between rs351855 Single Nucleotide Polymorphism of FGFR4 Gene and Biochemical Recurrence after Radical Prostatectomy in a Chinese Population

Chen Luyao，Ma Xin，Lei Zhengweietal

DepartmentofUrology，ChinesePLAGeneralHospital，Beijing100853，China

Objective To evaluate the association between rs351855 single nucleotide polymorphism of FGFR4 gene and the biochemical recurrence(BCR)of prostate cancer in Chinese men after radical prostatectomy.Methods Peripheral blood DNA was extracted from 346 prostate cancer patients and the polymorphism rs351855 was genotyped by using Sequenom Mass ARRAY system.Clinical data and follow-up information were collected and compared between recurrence group and non-recurrence group.Kaplan-Meier curves and Cox proportional hazard models were used for survival analysis.Results During the follow-up period，124(35.8%)patients experienced PSA recurrence.Patients with recurrence possessed higher PSA levels at diagnosis，higher Gleason score，and higher proportions of advanced stage and positive surgical margin than the patients without recurrence.Survival analysis showed that BCR free survival was significantly affected by the genotypes of rs351855.After adjusting for other variables in multivariable analysis，patients with rs351855 AA/AG genotypes showed significantly worse BCR-free survival than those with the GG genotype(HR=1.873，95%CI：1.209-2.901，P=0.005).Conclusion FGFR4 rs351855 could be a novel independent prognostic factor of BCR after radical prostatectomy in the Chinese population.This functional polymorphism may also provide a basis for clinical evaluation and surveillance programs.

prostate cancer； FGFR4 gene； polymorphism； biochemical recurrence

*湖北省自然科學基金資助項目(No.2015CFB289)；武漢市科技計劃資助項目(No.2013072304010833)

R737.25

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.003

陳路遙，男，1991年生，醫(yī)學博士，E-mail：chenluyao301@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：tonyzt9007@163.com