閔生萍， 劉 安， 洪 磊， 王效靜

安徽呼吸系病臨床基礎(chǔ)省級(jí)實(shí)驗(yàn)室，蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，蚌埠 233000

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應(yīng)用ARMS-PNA技術(shù)檢測(cè)晚期肺腺癌患者血漿中EGFR基因突變*

閔生萍， 劉 安， 洪 磊， 王效靜△

安徽呼吸系病臨床基礎(chǔ)省級(jí)實(shí)驗(yàn)室，蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，蚌埠 233000

目的 檢測(cè)肺腺癌患者的血漿和組織/惡性胸腔積液樣本中表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因突變情況，探討血漿樣本在EGFR基因檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。方法 收集200例Ⅲ/Ⅳ期肺腺癌患者的組織/惡性胸腔積液及其相對(duì)應(yīng)的血漿樣本，利用擴(kuò)增受阻突變體系聯(lián)合肽核酸(amplification refractory mutation system-peptide nucleic acids，ARMS-PNA)技術(shù)檢測(cè)EGFR基因突變情況。結(jié)果 組織/惡性胸腔積液樣本中EGFR基因的陽(yáng)性率(46.00%)明顯高于血漿樣本(33.00%)，兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與組織/惡性胸腔積液樣本相比，血漿EGFR基因突變檢測(cè)的靈敏度為71.73%，特異度為100.00%，總符合率為87.00%；Ⅳ期肺腺癌患者的血漿EGFR基因突變檢測(cè)靈敏度(76.92%)明顯高于Ⅲ期(65.00 %)。結(jié)論 與晚期肺腺癌組織/惡性胸腔積液相比，血漿EGFR突變檢測(cè)具有高度的特異度，但靈敏度相對(duì)較低。當(dāng)腫瘤組織/惡性胸腔積液難以獲取時(shí)，血漿可以作為EGFR基因突變檢測(cè)的合適樣本。

表皮生長(zhǎng)因子受體； 肺腺癌； 血漿； ARMS-PNA技術(shù)

由于缺乏行之有效的肺癌早期診斷/篩查體系，大部分非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung carcinoma，NSCLC)患者在首診時(shí)已經(jīng)處于中、晚期，錯(cuò)過(guò)了手術(shù)治療的最佳時(shí)期，僅可進(jìn)行姑息性放、化療[1]。盡管放、化療在一定程度上可以延長(zhǎng)患者生存期，但其療效有限，加之其比較嚴(yán)重的毒副作用，導(dǎo)致NSCLC患者治療效果不理想[2]。隨著藥物基因組學(xué)的發(fā)展和對(duì)肺癌發(fā)病分子機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)，針對(duì)特定腫瘤細(xì)胞或分子的靶向藥物的研發(fā)為NSCLC患者帶來(lái)了曙光。

臨床研究已經(jīng)證實(shí)，以吉非替尼等為代表的表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑類(EGFR-TKIs)藥物可顯著延長(zhǎng)NSCLC患者的無(wú)疾病進(jìn)展生存期和總生存期[3-4]。但其療效與表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)基因突變狀態(tài)密切相關(guān)，因此，EGFR基因突變檢測(cè)成為EGFR-TKIs藥物臨床應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)[5-6]。肺癌組織或脫落肺癌細(xì)胞是檢測(cè)EGFR基因突變的最理想樣本，但由于各種原因，尤其對(duì)于大多復(fù)發(fā)患者，往往無(wú)法獲取上述樣本?；谕庵苎蓸拥奈?chuàng)和便利，探討外周血進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)無(wú)疑有助于篩選出更多的肺癌患者接受EGFR-TKIs治療。

本研究利用擴(kuò)增受阻突變體系(amplification refractory mutation system，ARMS)聯(lián)合肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)技術(shù)對(duì)晚期肺腺癌患者腫瘤組織/惡性胸腔積液和與其匹配的血漿樣本行EGFR基因的突變檢測(cè)，旨在評(píng)估血漿樣本在臨床EGFR基因檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值，為指導(dǎo)臨床靶向治療提供參考和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例與樣本

1.1.1 病例一般情況 取得患者及家屬知情同意后，收集2016年1月至2016年8月期間蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院200例肺腺癌患者的石蠟包埋腫瘤組織/惡性胸腔積液樣本和其相對(duì)應(yīng)的新鮮全血樣本?；颊吣挲g在42～80歲之間；其中女性患者108例，男性患者92例；根據(jù)ICC 2009年新的第7版修訂標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期，Ⅲ期患者95例，Ⅳ期患者105例；經(jīng)組織或細(xì)胞病理學(xué)確診，200例患者均為腺癌。

1.1.2 組織樣本采集 石蠟包埋組織樣本共146例(其中手術(shù)切除標(biāo)本98例，纖維支氣管鏡活檢樣本42例，經(jīng)皮肺穿刺樣本6例)，惡性胸腔積液54例，所有樣本均經(jīng)組織或細(xì)胞病理學(xué)確診為腺癌。

1.1.3 血漿標(biāo)本采集 抽取肺腺癌患者全血5 mL，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，3 h內(nèi)進(jìn)行血漿初次分離(800 g離心10 min)，將分離得到的血漿1 600 g再次離心10 min，吸取上層血漿，-80℃保存。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 石蠟包埋組織DNA的提取 采用石蠟包埋組織DNA提取試劑盒(武漢海吉力生物科技有限公司，HGN-tq0850)，參照說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行石蠟切片或惡性胸腔積液脫落癌細(xì)胞的DNA提取。采用Thermo Fisher公司的NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)對(duì)提取后的DNA濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，其中A260/A280要求在1.8～2.0之間。

1.2.2 血漿游離DNA(cell-free DNA,cfDNA)的提取 采用血清/血漿游離DNA提取試劑盒(武漢海吉力生物科技有限公司，HGN-tq1150)，參照說(shuō)明書操作步驟進(jìn)行血漿樣本中cfDNA的提取。采用Thermo公司的NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)對(duì)提取后的cfDNA濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，其中A260/A280要求在1.7～2.1之間。

1.2.3 ARMS-PNA法檢測(cè)EGFR突變 分別取40 μL組織/胸腔積液來(lái)源(3～5 ng/μL)和血漿來(lái)源的DNA(25～35 ng/μL)，按照人類EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(武漢海吉力生物科技有限公司，HGN-er01)說(shuō)明書的操作步驟，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LightCycler 480Ⅱ，瑞士)檢測(cè)樣本中EGFR的突變情況。PCR擴(kuò)增過(guò)程包括3個(gè)階段，第1階段包含1個(gè)循環(huán)(95℃，5 min)，第2階段包含15個(gè)循環(huán)(95℃，20 s；62℃，20 s)，第3階段包含31個(gè)循環(huán)(95℃，20 s；60℃，40 s)。檢測(cè)結(jié)果按照海吉力EGFR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書的判讀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。按照雙盲實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)原則，石蠟包埋組織和血漿樣本的實(shí)驗(yàn)結(jié)果由不同的實(shí)驗(yàn)人員獨(dú)立進(jìn)行記錄，匯總后再進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，不同樣本之間檢測(cè)結(jié)果的差異比較采用卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用Kappa系數(shù)對(duì)2種樣本檢測(cè)結(jié)果的一致性進(jìn)行分析，Kappa≥0.75為兩者一致性較好；0.75>Kappa≥0.4為兩者一致性一般；Kappa<4為兩者一致性較差。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者中EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果

在200例肺腺癌患者的組織/惡性胸腔積液樣本中，共檢測(cè)出EGFR基因突變陽(yáng)性患者92例(46.00%)，陰性患者108例(54.00%)；血漿樣本檢測(cè)中，EGFR基因突變陽(yáng)性患者66例(33.00%)，陰性患者134例(67.00%)，兩種樣本之間的檢測(cè)結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

在本研究中，EGFR的基因突變類型以19和21外顯子為主。在組織/惡性胸腔積液樣本中，19外顯子突變檢測(cè)到50例(25.00%)，21外顯子突變檢測(cè)到42例(21.00%)；在血漿樣本中，19外顯子突變檢測(cè)到42例(21.00%)，21外顯子突變檢測(cè)到24例(12.00%)，兩種樣本中EGFR基因的突變位點(diǎn)情況也具有顯著性差異(P<0.01)。

對(duì)不同樣本的EGFR基因突變情況和患者的臨床信息進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)結(jié)果與患者的年齡、性別和臨床分期均沒(méi)有相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 患者的臨床特征與不同樣本中EGFR基因突變
的相關(guān)性[例(%)]
Table 1 Correlation of clinical characteristics and EGFR gene mutation in different samples [(n)%]

臨床特征組織/惡性胸腔積液陽(yáng)性樣本血漿陽(yáng)性樣本P值年齡≤60歲34(17.00)28(14.00)>60歲58(29.00)38(19.00)0.298性別女性58(29.00)46(23.00)男性34(17.00)20(10.00)0.243臨床分期Ⅲ期40(20.00)26(13.00)Ⅳ期52(26.00)40(20.00)0.364

2.2 不同類型樣本EGFR檢測(cè)結(jié)果的一致性

在200例肺腺癌患者的EGFR基因檢測(cè)結(jié)果中，組織/惡性胸腔積液和血漿樣本檢測(cè)結(jié)果完全符合的樣本共有174例，其中陽(yáng)性結(jié)果一致的樣本數(shù)為66，陰性結(jié)果一致的樣本數(shù)為108。其中有26例患者的組織/惡性胸腔積液樣本檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，血漿樣本檢測(cè)為陰性。與組織/惡性胸腔積液樣本相比，血漿EGFR基因檢測(cè)的靈敏度為71.73%，特異度為100.00%，總符合率為87.00%，一致性系數(shù)(Kappa)為0.733，2種樣本EGFR檢測(cè)結(jié)果之間的一致性處于一般水平(表2)。

表2 不同樣本中EGFR基因檢測(cè)結(jié)果的一致性分析
Table 2 Consistency analysis of EGFR gene mutation from different samples

血漿組織/惡性胸腔積液樣本+-合計(jì)Kappa系數(shù)+66066-26108134合計(jì)921082000.733

2.3 Ⅲ/Ⅳ期患者不同類型樣本EGFR檢測(cè)結(jié)果的一致性

在95例Ⅲ期肺腺癌患者的EGFR基因檢測(cè)結(jié)果中，組織/惡性胸腔積液和血漿樣本檢測(cè)結(jié)果一致的樣本共有81例，其中陽(yáng)性結(jié)果一致的樣本數(shù)為26，陰性結(jié)果一致的樣本數(shù)為55。其中有14例患者的組織/惡性胸腔積液樣本檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，血漿樣本檢測(cè)為陰性。與組織/惡性胸腔積液樣本相比，Ⅲ期肺腺癌患者的血漿EGFR基因檢測(cè)的靈敏度為65.00%，特異度為100.00%，總符合率為85.26%，一致性系數(shù)(Kappa)為0.683，2種樣本EGFR檢測(cè)結(jié)果之間的一致性處于一般水平(表3)。

表3 Ⅲ期NSCLC患者不同樣本中EGFR基因
檢測(cè)結(jié)果的一致性分析
Table 3 Consistency analysis of EGFR gene mutation from different samples of stage Ⅲ NSCLC patients

血漿組織/惡性胸腔積液樣本+-合計(jì)Kappa系數(shù)+26026-145569合計(jì)4055950.683

在105例Ⅳ期肺腺癌患者的EGFR基因檢測(cè)結(jié)果中，組織/惡性胸腔積液和血漿樣本檢測(cè)結(jié)果一致的樣本共有93例，其中陽(yáng)性結(jié)果一致的樣本數(shù)為40，陰性結(jié)果一致的樣本數(shù)為53。其中有12例患者的組織/惡性胸腔積液樣本檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，血漿樣本檢測(cè)為陰性。與組織/惡性胸腔積液樣本相比，Ⅳ期NSCLC患者血漿EGFR基因檢測(cè)的靈敏度為76.92%，特異度為100.00%，總符合率為88.57%，一致性系數(shù)(Kappa)為0.771，2種樣本EGFR檢測(cè)結(jié)果之間的一致性處于較好水平(表4)。

表4 Ⅳ期NSCLC患者不同樣本中EGFR基因
檢測(cè)結(jié)果的一致性分析
Table 4 Consistency analysis of EGFR gene mutation from different samples of stage Ⅳ NSCLC patients

血漿組織/惡性胸腔積液樣本+-合計(jì)Kappa系數(shù)+40040-125365合計(jì)52531050.771

3 討論

2015年國(guó)家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)肺癌患病率是130.2/10萬(wàn)。其中男性84.6/10萬(wàn)，居惡性腫瘤第2位，女性45.6/10萬(wàn)，居惡性腫瘤第4位[7]，其中，85%左右的肺癌患者屬于NSCLC。由于既往缺乏有效的治療手段，肺癌的死亡率居高不下。以EGFR-TKIs為代表的靶向治療為肺癌治療帶來(lái)了新的希望，同時(shí)也拉開(kāi)了肺癌精準(zhǔn)治療的序幕。基于EGFR-TKIs藥物療效與EGFR基因突變狀態(tài)密切相關(guān)，EGFR基因突變檢測(cè)成為行肺癌EGFR-TKIs靶向治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

目前臨床上進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)的樣本主要有手術(shù)切除的腫瘤組織、穿刺樣本及惡性胸腔積液等。部分患者在首診時(shí)已經(jīng)錯(cuò)過(guò)手術(shù)治療的最佳時(shí)期，或因患者年齡、身體狀況等因素而放棄手術(shù)治療，無(wú)法獲得手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本。臨床上亦可通過(guò)支氣管鏡活檢、CT定位下肺穿刺、胸腔鏡下活檢等手段獲取穿刺標(biāo)本，但該方式獲取的腫瘤組織量有限，所含遺傳學(xué)信息不全，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，同時(shí)還存在由于穿刺導(dǎo)致的各種并發(fā)癥[8-9]。惡性胸腔積液是腫瘤晚期常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，但并非所有的晚期腫瘤患者都會(huì)出現(xiàn)惡性胸腔積液[10]。因而，臨床上迫切需要一種微創(chuàng)、取樣方便、不受患者身體狀況和臨床分期影響的標(biāo)本類型來(lái)實(shí)現(xiàn)EGFR基因檢測(cè)。

外周血中存在許多DNA片段，被稱之為游離DNA(cfDNA)，主要來(lái)源于人體細(xì)胞的凋亡、壞死和分泌。除正常細(xì)胞外，腫瘤細(xì)胞也可以從病灶上脫落進(jìn)入外周血或凋亡后DNA釋放進(jìn)入外周血循環(huán)中，這部分DNA稱之為循環(huán)腫瘤DNA(cell free circulating tumor DNA，ctDNA)，ctDNA在cfDNA的總量中只占很小一部分[11-12]。研究表明，腫瘤組織來(lái)源的ctDNA中的基因突變狀況與腫瘤細(xì)胞中DNA保持一致，且腫瘤患者外周血游離DNA含量比正常健康人增高10倍[13-14]，因此利用外周血中的ctDNA檢測(cè)癌癥患者的相關(guān)基因突變是切實(shí)可行的，還可以實(shí)現(xiàn)腫瘤基因的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和TKIs耐藥隨檢。

本研究中，采用ARMS-PNA技術(shù)分別檢測(cè)組織/惡性胸腔積液和匹配血漿中EGFR基因突變狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組織/惡性胸腔積液的EGFR突變率明顯高于血漿，存在顯著性差異，提示在臨床應(yīng)用中，血漿EGFR基因突變檢測(cè)并不能完全取代組織/惡性胸腔積液。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變狀態(tài)與患者的年齡、性別、臨床分期等均無(wú)顯著相關(guān)性。

影響ctDNA檢測(cè)靈敏度的因素主要有腫瘤患者的臨床分期、血漿樣本的處理方法、ctDNA的提取質(zhì)量、檢測(cè)方法的靈敏度等因素[15]。在既往的IPASS、IGNITE和IFUM等3項(xiàng)研究[16-18]中，通過(guò)血漿ctDNA檢測(cè)EGFR基因突變具有較高的特異度(100.0%、97.2%和99.8%)，但靈敏度相對(duì)較低(43.1%、49.6%和65.7%)。在本研究中，比較組織/惡性胸腔積液和血漿樣本的EGFR檢測(cè)結(jié)果，血漿樣本檢測(cè)EGFR基因突變的特異度高達(dá)100.00%，靈敏度為71.73%，其中Ⅲ期患者樣本的檢測(cè)靈敏度為65.00%，Ⅳ期患者的檢測(cè)靈敏度提高到76.92%。由于不同分期的腫瘤患者血液中ctDNA的含量有所不同，晚期患者血液中ctDNA的含量遠(yuǎn)高于早、中期患者，呈正相關(guān)性[19]。本研究中，Ⅳ期患者血漿的EGFR基因檢測(cè)靈敏度明顯高于Ⅲ期患者，說(shuō)明隨著癌癥的進(jìn)展，血漿樣本在晚期肺腺癌患者中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)更加明顯。

目前，ARMS技術(shù)已經(jīng)是臨床上認(rèn)可度較高的基因檢測(cè)方法[10-21]，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1%的水平。ARMS-PNA是一種EGFR基因突變檢測(cè)專利技術(shù)。PNA是具有類多肽骨架的DNA類似物，可以特異性地與DNA或RNA雜交，形成穩(wěn)定的復(fù)合體，通過(guò)PNA技術(shù)可以有效抑制野生型模板的擴(kuò)增。ARMS技術(shù)針對(duì)引物3′端進(jìn)行等位基因特異性的區(qū)分，利用ARMS引物3′端的高度特異性來(lái)識(shí)別突變位點(diǎn)，提高檢測(cè)靈敏度，可以檢測(cè)到10 ng基因組背景下1%～1‰的基因突變情況。本研究表明，ARMS-PNA技術(shù)在血漿ctDNA檢測(cè)EGFR基因上的應(yīng)用具有一定優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，與晚期肺腺癌組織/惡性胸腔積液相比，血漿EGFR突變檢測(cè)具有高度的特異性，但靈敏度相對(duì)較低。當(dāng)腫瘤組織/惡性胸腔積液難以獲取時(shí)，血漿可以作為EGFR基因突變檢測(cè)的合適樣本，從而可更大程度地讓更多的肺癌患者有機(jī)會(huì)接受EGFR-TKIs治療。

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(2016-09-01 收稿)

Detection of EGFR Gene Mutations in Plasma from Advanced Lung Adenocarcinoma Patients by ARMS-PNA Method

Min Shengping,Liu An,Hong Leietal

AnhuiClinicalandPreclinicalKeyLaboratoryofRespiratoryDisease;DepartmentofRespiratoryandCriticalMedicine,FirstAffiliatedHospital,BengbuMedicalCollege,Bengbu233000

Objective To detect epithelial growth factor receptor (EGFR) gene mutations in tissue/malignant pleural effusion and its matched plasma from advanced lung adenocarcinoma patients,and then to evaluate the application value of detection of EGFR mutations in plasma.Methods Tissue/malignant pleural effusion and its matched plasma were collected from 200 lung adenocarcinoma patients at stage Ⅲ/Ⅳ,and the mutations of EGFR gene were detected by using amplification refractory mutation system-peptide nucleic acids (ARMS-PNA) method.Results The positive rate of EGFR mutations in tissue/malignant pleural effusion was 46.00%,significantly higher than that in plasma (33.00%).Compared with tissue/malignant pleural effusion,the sensitivity of detection of EGFR mutations in plasma was 71.73%,the specificity was 100.00%,and the total corresponding rate was 87.00%.Notably,the sensitivity of detection of EGFR mutations in plasma from lung carcinoma patients at stage Ⅳ (76.92%) was higher than that at stage Ⅲ (65.00%).Conclusion Compared with tissue/malignant pleural effusion from advanced lung adenocarcinoma,plasma sample used for detection of EGFR mutations has high specificity,but low sensitivity.If it is hard to get tissue/malignant pleural effusion,plasma could serve as an adaptable sample for detection of EGFR mutations in advanced lung adenocarcinoma.

epithelial growth factor receptor; lung adenocarcinoma; plasma; ARMS-PNA method

*安徽省科技攻關(guān)計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.12010402127)；高校優(yōu)秀青年人才支持計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(No.gxyqZD2016168)；安徽省科技計(jì)劃項(xiàng)目(重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室類)(No.1506c085014)

R734.2

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.014

閔生萍，女，1980生，醫(yī)學(xué)學(xué)士，技師，E-mail：minshengping@126.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：wangxiaojing8888@163.com