馬曉黎，劉雨聲，閻錫蘊，郭銀樹，段華，馬丁

·論著·

黏附分子CD146對Vorinostat誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡作用的影響

馬曉黎#，劉雨聲#，閻錫蘊，郭銀樹，段華，馬丁

目的：探討?zhàn)じ椒肿覥D146對組蛋白去乙?；敢种苿￢orinostat誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡作用的影響。方法：通過實時聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）和蛋白質(zhì)印跡（western blotting）法檢測卵巢癌細胞A2780和SKOV3中CD146在組蛋白去乙酰化酶抑制劑Vorinostat作用下的變化情況。通過流式細胞儀（FACS）及細胞克隆形成實驗檢測CD146單克隆抗體AA98對Vorinostat誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡和抑制克隆形成的影響，金氏公式法分析聯(lián)合用藥效果。通過Western blotting法比較Vorinostat單藥及AA98與Vorinostat聯(lián)用對卵巢癌細胞中蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（AKT/mTOR）信號通路及下游分子的影響。結(jié)果：在卵巢癌細胞中黏附分子CD146在Vorinostat作用下被顯著性誘導(dǎo)表達，高表達的CD146可能與卵巢癌化療敏感性有關(guān)。CD146單克隆抗體AA98與Vorinostat聯(lián)用顯著增加了卵巢癌細胞的凋亡率，降低了細胞克隆形成能力，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。金氏公式計算表明兩藥具有協(xié)同效應(yīng)。AA98可明顯降低Vorinostat引起的AKT/mTOR通路活化作用，降低卵巢癌細胞中磷酸化AKT（p-AKT）、磷酸化真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（p-4E-BP1）及磷酸化核糖體40S小亞基S6蛋白激酶（p-S6K1）的蛋白表達水平（P＜0.05）。結(jié)論：Vorinostat使CD146顯著上調(diào)，從而降低了卵巢癌化療敏感性，CD146單抗可能通過逆轉(zhuǎn)和抑制Vorinostat引起的AKT/mTOR通路活化作用，Vorinostat聯(lián)合CD146單抗對卵巢癌細胞具有明顯的協(xié)同殺傷效力。

卵巢腫瘤；抗原，CD146；抗腫瘤藥；Vorinostat；細胞凋亡；協(xié)同作用

（J Int Obstet Gynecol，2016,43：690-694）

卵巢癌在女性生殖器腫瘤中預(yù)后最差，極易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，這與卵巢癌化療耐藥密切相關(guān)[1-3]。隨著基礎(chǔ)研究的不斷深入、新型化療藥物的問世，卵巢癌的化療效果有了很大改善[4]。Vorinostat是一種新型靶向抗腫瘤藥物，屬于組蛋白去乙?；敢种苿芤种平M蛋白去乙?；傅幕钚?，能在小劑量、低濃度情況下誘導(dǎo)腫瘤細胞分化，對包括卵巢癌在內(nèi)的多種腫瘤具有殺傷作用，并于2006年被美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)用于臨床[5-7]。然而，臨床研究顯示Vorinostat單藥治療卵巢癌效果欠佳，其原因尚不清楚[8-10]。既往研究曾發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細胞在Vorinostat作用下出現(xiàn)黏附分子CD146異常升高，尤其在卵巢癌細胞中最為顯著[11]，本研究旨在進一步探討?zhàn)じ椒肿覥D146對Vorinostat誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡作用的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑人卵巢癌細胞株A2780和SKOV3[美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）]；小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；Trizol試劑和培養(yǎng)基RPMI-1640（美國Gibco BRL公司）；組蛋白去乙?；敢种苿￢orinostat（美國Sigma公司）；CD146單克隆抗體AA98由中國科學(xué)院生物物理研究所閻錫蘊教授提供；蛋白激酶B（AKT）、p-AKT、磷酸化真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1（p-4E-BP1）、磷酸化核糖體40S小亞基S6蛋白激酶（p-S6K1）、β-actin抗體（Santa Cruz公司）；全自動酶標(biāo)讀數(shù)儀（美國Bio-Rad公司Bio-Rad2550型）；流式細胞儀（FACScan Becton Dickinson）為美國BD公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)印跡（western blotting）電泳儀（德國Biometra公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)人卵巢癌細胞株A2780、SKOV3培養(yǎng)于含10%新鮮小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%二氧化碳（CO2）、相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞呈貼壁生長。

1.2.2 實時聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR檢測）CD146基因通過primer 5軟件設(shè)計引物。CD146基因正向引物序列為5′-CAGTCCTCATACCAGAGCCAACAG-3′，反向引物序列為5′-GGACCAGGATGCACACAATCA-3′。18s RNA設(shè)為內(nèi)參，正向引物序列為5′-AGTCCCTGCCCTTTGACACA-3′，反向引物序列為5′-GATCCGAGGGCCTCACTAAAC-3′。在美國ABI 7500型PCR儀上進行分析，按SYBR Green PCR Master Mix（美國Sigma公司）說明書進行。通過Real-time PCR溶解曲線確定擴增產(chǎn)物的純度。在所有檢測樣本中未發(fā)現(xiàn)基因組DNA的污染。每組均設(shè)3個復(fù)孔，基因相對量采用2-ΔCt方法計算。

1.2.3 FACS檢測細胞凋亡將卵巢癌細胞A2780、SKOV3接種于6孔板中，分別用二甲基亞砜（DMSO）、10 μg/mL單克隆抗體（單抗）AA98、2.5 μmol/L Vorinostat和AA98+Vorinostat作用72 h后消化、收集細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2遍，buffer重懸，調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL。取100 μL于5 mL管中，加入5 μL Annexin V及5 mL PI，室溫避光孵育15 min后加入400 μL PBS，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測。以上實驗均重復(fù)3次。

1.2.4 克隆形成實驗取對數(shù)生長期細胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，活細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度至1×103細胞/mL。蒸餾水分別制備出12 g/L和7 g/L兩個質(zhì)量濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持40℃不凝。按1∶1比例使12 g/L的瓊脂糖和2×改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM/F12）培養(yǎng)液[含有2×抗生素和200 mL/L胎牛血清（FBS）]混勻后，取3 mL混合液注入直徑6 cm平皿中，冷卻凝固置CO2溫箱中備用。按1∶1比例將7 g/L的瓊脂糖和2× DMEM培養(yǎng)液在無菌試管中相混以后，再向管中加入細胞懸液，充分混勻，注入鋪有12 g/L瓊脂糖底層平皿中，逐漸形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃、CO2溫箱中培養(yǎng)10～14 d。把平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細胞克隆數(shù)。按公式計算克隆形成率：克隆形成率=克隆數(shù)/接種數(shù)×100%。

1.2.5 聯(lián)合作用評價采用金氏公式[12]評價兩種藥物的聯(lián)合作用。金氏公式表達式：Q=EA+B/（EA+EB-EA×EB）。EA、EB分別表示A和B兩種藥物單獨用藥的效應(yīng)；EA+B表示藥物A和藥物B聯(lián)合用藥的效應(yīng)。通過判讀Q值來評價兩種藥物在聯(lián)合使用后的治療效果是否優(yōu)于單獨給藥。如果Q在0.85～1.15之間為單純相加，Q＞1.15為協(xié)同作用，Q＜0.85為拮抗作用。1.2.6Western blotting檢測蛋白水平收集經(jīng)過藥物處理過的A2780細胞，裂解并提取蛋白，采用考馬斯亮藍G-250染料法進行蛋白定量。100 μg總蛋白進行10%SDS-PAGE凝膠電泳，以蛋白電泳轉(zhuǎn)移儀將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上，脫脂奶室溫封閉2 h，分別用AA98、AKT、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）、p-AKT、p-4E-BP1、p-S6K1單克隆抗體孵育4℃過夜。PBS洗膜，加入1∶500堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗37℃孵育1 h，NBT/ BCIP系統(tǒng)顯色30 min。圖像經(jīng)Uvpgrab-it Image1軟件采集，計算各蛋白與β-actin的比值作為其相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間兩兩比較采用配對t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌細胞在Vorinostat作用下可引起黏附分子CD146顯著性誘導(dǎo)表達Real-time PCR結(jié)果顯示，以DMSO為對照組，卵巢癌細胞A2780和SKOV3在2.5 μmol/L Vorinostat作用12 h后胞內(nèi)黏附分子CD146的mRNA水平顯著升高，在A2780細胞中CD146升高至DMSO的（450.30±26.17）倍，在SKOV3細胞中升高至（165.87±20.32）倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000），見圖1A。western blotting結(jié)果顯示，卵巢癌細胞A2780和SKOV3在2.5 μmol/L Vorinostat作用48 h后CD146蛋白水平亦顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（A2780：P=0.003；SKOV3：P= 0.002），見圖1B。

圖1 卵巢癌細胞在Vorinostat作用下CD146表達變化

2.2 CD146單抗AA98可顯著增強Vorinostat誘導(dǎo)卵巢癌細胞發(fā)生凋亡的作用以DMSO為對照組，卵巢癌細胞A2780和SKOV3分別在2.5 μmol/L Vorinostat單藥、10 μg/mL CD146單抗AA98單藥及兩者聯(lián)合用藥作用72 h后檢測各組細胞凋亡率，F(xiàn)ACS結(jié)果顯示，AA98可明顯增強Vorinostat誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡的效力，在A2780細胞中，Vorinostat單藥和聯(lián)合用藥的細胞凋亡率分別為（16.28±2.94）%和（38.13±3.56）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002）；在SKOV3細胞中，Vorinostat單藥和聯(lián)合用藥的細胞凋亡率分別為（18.75±3.62）%和（49.06±4.31）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001），見圖2。根據(jù)金氏公式計算，在A2780細胞中聯(lián)合用藥組Q值為1.552；在SKOV3細胞中聯(lián)合用藥組Q值為1.825，結(jié)果可見聯(lián)合用藥組的Q值均＞1.15，表明Vorinostat聯(lián)合AA98具有協(xié)同殺傷作用。

2.3 CD146單抗AA98可顯著增強Vorinostat抑制卵巢癌細胞克隆形成的作用以DMSO為對照組，卵巢癌細胞A2780分別在2.5 μmol/L Vorinostat單藥、10 μg/mL CD146單抗AA98單藥及兩者聯(lián)合用藥作用48 h后檢測各組細胞克隆形成率，結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組卵巢癌A2780細胞克隆形成率最低，與Vorinostat單藥組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（19.06±4.92）%vs.（46.53±4.20）%，P=0.002]，見圖3。根據(jù)金氏公式計算，在A2780細胞中聯(lián)合用藥組Q值為1.448（Q值＞1.15），表明Vorinostat聯(lián)合AA98具有協(xié)同抑制細胞克隆形成作用。

圖2 CD146單抗AA98對Vorinostat誘導(dǎo)卵巢癌細胞A2780和DKOV3發(fā)生凋亡作用的影響

圖3 CD146單抗AA98對Vorinostat抑制卵巢癌細胞A2780克隆形成作用的影響

2.4 CD146單抗AA98對卵巢癌細胞中AKT/ mTOR通路的影響以DMSO為對照組，卵巢癌細胞A2780分別在2.5μmol/LVorinostat單藥、10μg/mL CD146單抗AA98單藥及兩者聯(lián)合用藥作用48 h后檢測各組細胞內(nèi)AKT/mTOR通路及其下游分子p-4E-BP1、p-S6K1的蛋白變化情況。Western blotting結(jié)果顯示，細胞中p-AKT、p-4E-BP1以及p-S6K1在Vorinostat作用后被顯著上調(diào)，加用CD146單抗AA98可有效逆轉(zhuǎn)AKT/mTOR通路的活化并減弱該活化效應(yīng)，見圖4。由此可見，CD146單抗AA98可逆轉(zhuǎn)并抑制Vorinostat引起的AKT/mTOR通路活化作用，從而增強Vorinostat對卵巢癌細胞的殺傷效力。

圖4 CD146單抗AA98對卵巢癌細胞A2780中AKT/mTOR通路的影響

3 討論

卵巢癌是婦科惡性腫瘤中病死率最高的腫瘤，由于發(fā)病隱匿，約70%的患者確診時已為晚期，5年生存率僅為30%。化療耐藥是卵巢癌治療達完全緩解后復(fù)發(fā)和導(dǎo)致難治性的主要原因，目前尚無二線化療方案的明確規(guī)范，是卵巢癌治療中亟待解決的問題[13]。隨著腫瘤分子生物學(xué)的深入研究，多種新型化療藥物的出現(xiàn)為攻克卵巢癌帶來了曙光。2006年，Vorinostat作為第1個組蛋白去乙?；敢种苿┍幻绹鳩DA批準(zhǔn)上市用于臨床。其能抑制組蛋白去乙酰化酶，使乙?；潭仍龈撸厮苋旧|(zhì)為轉(zhuǎn)錄活性結(jié)構(gòu)，影響多種基因的表達水平，從而誘導(dǎo)細胞生長阻滯、分化和凋亡。對血液系統(tǒng)腫瘤和包括卵巢癌在內(nèi)的實體瘤均有較強的抑制作用，對正常組織、細胞無毒副作用。然而大量臨床試驗研究發(fā)現(xiàn)Vorinostat單藥對卵巢癌患者治療效果并不理想，常需與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用以增強腫瘤殺傷效力[14-15]。既往研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細胞在Vorinostat作用下出現(xiàn)黏附分子CD146異常升高，尤其在卵巢癌細胞中最為顯著。本研究進一步證實了該現(xiàn)象，CD146 mRNA可被上調(diào)450多倍，蛋白水平亦可被Vorinostat顯著性誘導(dǎo)表達。

CD146是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有跨膜結(jié)構(gòu)的黏附分子，位于細胞膜表面，屬于免疫球蛋白超家族成員。其包括5個Ig樣結(jié)構(gòu)域（V-V-C2-C2-C2）、1個跨膜區(qū)和1個位于細胞質(zhì)內(nèi)、有多個蛋白磷酸化結(jié)合位點的短尾。CD146顯著表達于黑色素瘤細胞、滋養(yǎng)細胞和血管內(nèi)皮細胞。其最初被鑒定為黑色素瘤標(biāo)志分子，通過介導(dǎo)腫瘤細胞間、腫瘤-內(nèi)皮細胞間的同型或異型黏附，促進黑色素瘤生長和血行轉(zhuǎn)移。更深入研究發(fā)現(xiàn)，除黑色素瘤外，CD146還參與了多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，如前列腺癌、乳腺癌等[16-20]。新近研究發(fā)現(xiàn)CD146與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展也密切相關(guān)，其同時表達于正常卵巢組織及卵巢癌組織，表達強度與卵巢癌發(fā)展階段、嚴(yán)重程度、未分化型、轉(zhuǎn)移范圍及P53累積量高度相關(guān)，尤其是CD146的顯著性表達預(yù)示著卵巢癌對一線化療藥物更易產(chǎn)生耐藥性、卵巢癌更早的復(fù)發(fā)以及預(yù)后較差[21]。上述研究提示CD146可能與卵巢癌化療耐藥有關(guān)。本研究運用CD146單抗AA98阻斷其在卵巢癌細胞株A2780、SKOV3中的表達水平可以明顯增強化療藥物Vorinostat的殺傷效應(yīng)，顯著增加細胞凋亡率、降低細胞克隆形成率。析因方差分析結(jié)合金氏公式計算，結(jié)果表明Vorinostat聯(lián)合AA98對卵巢癌細胞具有協(xié)同殺傷作用，聯(lián)合用藥組Q值均＞1.15。深入研究CD146功能時還發(fā)現(xiàn)AA98可以逆轉(zhuǎn)Vorinostat引起的CD146高表達，從而逆轉(zhuǎn)并抑制卵巢癌細胞內(nèi)磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT/mTOR通路及其下游分子4E-BP1、S6K1的活化。

有研究報道，在黑色素瘤細胞中CD146與AKT存在相互作用，一方面補充外源性AKT可以上調(diào)胞內(nèi)CD146的表達，另一方面補充外源性CD146可以激活內(nèi)源性AKT、抑制促凋亡蛋白BAD表達從而引起腫瘤細胞凋亡抵抗、化療敏感性降低[22]。大量實驗證明，AKT介導(dǎo)的存活通路在抵抗細胞凋亡中起重要作用，其中PI3K/AKT/mTOR通路的激活及其下游靶點4E-BP1、S6K1的活化與腫瘤化療耐藥密切相關(guān)。當(dāng)AKT激活后可以直接或間接地激活mTOR，mTOR是一個重要的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，可激活下游靶蛋白對細胞生長和代謝進行調(diào)控。在調(diào)控過程中有2個重要的下游蛋白：4E-BP1和S6K1。S6K1活化后促進核糖體蛋白以及翻譯調(diào)節(jié)蛋白的合成，從而對蛋白合成進行調(diào)節(jié)。4E-BPl通常與mRNA 5′帽狀結(jié)合蛋白eIF24E結(jié)合并抑制其活性，進而抑制了翻譯的開始。該通路中任意一個因子的磷酸化水平升高均與無病生存期降低有關(guān)[23-24]。本研究顯示AA98逆轉(zhuǎn)了Vorinostat引起的CD146高表達，阻斷了其引起的PI3K/AKT/mTOR存活通路的激活，AA98與Vorinostat聯(lián)用使p-AKT、p-4E-BP1、p-S6K1水平顯著降低，減弱了卵巢癌細胞的抗凋亡能力，從而增強了Vorinostat的殺傷效力。

綜上所述，本研究探索了黏附分子CD146對組蛋白去乙?；敢种苿￢orinostat誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡作用的影響，首次發(fā)現(xiàn)了CD146可被Vorinostat顯著性誘導(dǎo)表達，高表達的CD146可能通過激活PI3K/AKT/mTOR存活通路而減弱了Vorinostat的殺傷效力，CD146單抗AA98可有效逆轉(zhuǎn)并抑制該存活通路及下游分子4E-BP1、S6K1的活化，顯著增強了卵巢癌細胞對Vorinostat的敏感度，Vorinostat聯(lián)合CD146單抗具有協(xié)同殺傷作用，為卵巢癌化療耐藥的治療新途徑提供了理論基礎(chǔ)。

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Effect of Adhesion Molecular CD146 on Apoptosis of Ovarian Cancer Cell Induced by Vorinostat

MA Xiao-li,LIU Yusheng,YAN Xi-yun,GUO Yin-shu,DUAN Hua,MA Ding.Department of Gynecology Minimally Invasive Center,Beijng Obstetrics and Gynecology Hospital,Capital Medical University,Beijing 100006，China（MA Xiao-li,LIU Yu-sheng,GUO Yin-shu,DUAN Hua）;Institute of Biophysics,The Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China（YAN Xi－yun）；Department of Obstetrics and Gynecology,Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China（MA Ding）

DUAN Hua,E-mail：duanhua888@163.com

Objective：To investigate the effect of adhesion molecular CD146 expression on apoptosis of ovarian cancer cells induced by Vorinostat.Methods：CD146 expression levels in A2780 and SKOV3 cells were detected after Vorinostat treatment by Real-time PCR and Western blot.The effect of CD146 mAb AA98 on cell apoptosis and colony-forming ability under Vorinostat treatment by FACS and Soft agar colony-forming assay.The synergistic effect of Vorinostat and AA98 was analyzed by gold formula method.Comparison of effect on AKT/mTOR signaling pathway and the downstream molecular between ovarian cancer cells treated by Vorinostat alone or plus with AA98.Results：CD146 was significantly induced by Vorinostat in ovarian cancer cells.Upregulation of CD146 is closely related to chemosensitivity.Combined Vorinostat and AA98 significantly improved cell apoptotic rate and ablated cancer colony formation.The difference was statistically significant(P＜0.05).The synergistic effect after treatment with a combination of Vorinostat with AA98 was proved by gold formula method.AA98 could reduce the activation of AKT/mTOR signaling pathway caused by Vorinostat and could decrease the p-AKT，p-4E-BP1，p-S6K1 protein levels in ovarian cancer cells(P＜0.05).Conclusions：Vorinostat significantly induced the expression of CD146, which might decrease the chemosensitivity of ovarian cancer cells.CD146 mAb may reverse and inhibit the activation of AKT/ mTOR signaling pathway caused by Vorinostat and substantially enhance killing of ovarian cancer cells.The two drugs have obvious synergistic antitumor effects.

Ovarian neoplasms;Antigens,CD146;Antineoplastic agents;Vorinostat;Apoptosis;Synergistic effect

2016-08-08）

[本文編輯王昕]

國家自然科學(xué)基金（81101970）；北京市科技新星計劃（Z141107001814015）；北京市醫(yī)管局重點醫(yī)學(xué)發(fā)展項目揚帆計劃（ZYLX201406）

100006北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦科微創(chuàng)中心（馬曉黎，劉雨聲，郭銀樹，段華）；中國科學(xué)院生物物理研究所（閻錫蘊）；華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院婦產(chǎn)科（馬丁）

段華，E-mail：duanhua888@163.com

#共同第一作者